CN107110864A

CN107110864A - 用于检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法

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Publication number: CN107110864A
Application number: CN201580069412.3A
Authority: CN
Inventors: J.基尔维斯卡里; J.库尔克拉
Original assignee: Molecular Diagnostics Inc
Current assignee: Mobidiag Oy; Molecular Diagnostics Inc
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: US11566294B2; EP3234608A1; ES2839874T3; FI20146124A; EP3234608B1; AU2015366081A1; AU2021269432A1; EP3234608A4; CN107110864B; US20230323478A1; FI126289B; AU2015366081B2; WO2016097491A1; AU2021269432B2; JP2017538434A; PL3234608T3; CA2971529A1; US20190345540A1; JP6873903B2

Abstract

本发明提供了在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的基于核酸扩增的方法。本发明基于对高毒力艰难梭菌基因组中阴性和阳性标志物特异的寡核苷酸引物和探针的用途。

Description

用于检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法

本发明涉及基于核酸扩增的诊断测定领域。更具体地，本发明提供了在生物样品中(如粪样品中)检测高毒力艰难梭菌菌株(优选为毒素生产性艰难梭菌菌株027)的基于PCR的方法。本发明基于对高毒力艰难梭菌菌株中阴性和阳性标志物特异的寡核苷酸引物和探针的用途。

发明背景

艰难梭菌感染(CDI)是一种毒素介导的肠道疾病。CDI的临床结果可以从无症状定殖(colonization)变化到更严重的疾病综合征，包括严重腹泻，腹痛，发烧和白细胞增多。艰难梭菌被认为是住院治疗和抗生素治疗后患者发生的感染性腹泻的主要原因。因此，CDI现在被认为是最重要的保健相关感染之一。此外，还出现了非医院相关的艰难梭菌库(reservoirs)，并且艰难梭菌能够在动物宿主中传播(Denéve et al.，2009；Rupnik etal，2009)。

目前，艰难梭菌检测方法包括细胞毒素产生(cytotoxigenic)培养法、对由艰难梭菌产生的毒素A和毒素B检测的细胞毒素测定(CYT)，对艰难梭菌tcdB基因检测的基于PCR的测定，和对艰难梭菌特异性谷氨酸脱氢酶(GDH)检测的测定(Eastwood et al.，2009)。

在现有技术中，已经发现基于PCR的测试是快速筛选和鉴定含有艰难梭菌的样品的可靠、灵敏和特异的诊断工具(Eastwood et al.，2009；Hirvonen et al.，2013；Houseret al.，2010和WO2012087135)。商业使用中的是由WO2010116290(Philips)公开的方法，其涉及通过分析细胞毒素tcdB基因以及tcdC基因中的缺失的存在或缺少来检测产毒的艰难梭菌菌株的多重PCR测定。

虽然已经公开了用于检测毒素生产性艰难梭菌菌株的多个基于PCR的测定方法，但在本领域中仍然需要能够为检测那些高毒力艰难梭菌菌株提供高特异性和可靠性的PCR测定。本发明人现在已经在艰难梭菌基因组中定位了DNA序列区域，其令人惊讶地非常适合用于与高毒力艰难梭菌菌株相关的阴性和阳性标志物的特异性和灵敏性扩增。

样品基质(sample matrix)(其在腹泻诊断中通常是粪或食物样品)可能含有许多PCR抑制剂。这降低了PCR反应的扩增效率并因此对扩增子设计步骤预期更为细致的优化以验证所有模板和拷贝数被等量扩增，但也足够有效。因此，需要实现高PCR效率(最佳是尽可能接近100％)的寡核苷酸设计。所用的检测方法还可以影响扩增效率和/或偏爱。

本发明人现在已经定位了DNA序列区域，该区域完全适合用于引起腹泻的高毒力艰难梭菌菌株的特异性和灵敏性扩增和定量。扩增子被设计为是如此特异的，使得它们可以彼此组合成任何多重集合。自然地，这点的先决条件是所有公开的扩增子也已被设计为在相同的反应和循环条件下进行扩增。本发明的目的是替代作为用于高毒力艰难梭菌筛选测试的抗原测试和培养，并因此通过快速提供丰富的信息集提供方法改善，实现在改善的患者管理中的实验室和临床益处。此外，如果临床微生物实验室能够容易地区分非产毒的艰难梭菌和高毒力艰难梭菌，则感染控制能够获益。

发明概述

本发明的一个目的在于提供在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，所述方法包括：

进行核酸扩增反应，其包含自所述生物样品提取的DNA作为模板、在所述反应中对于扩增艰难梭菌hydR基因中目标序列特异性的第一寡核苷酸引物组、和在所述反应中对于扩增对应于SEQ ID NO：2所列的艰难梭菌序列的目标序列的至少部分特异性的第二寡核苷酸引物组，其中所述hydR基因包含对应于SEQ ID NO：1的序列。

本发明的另一个目的在于提供寡核苷酸引物组，其含有包含存在于如SEQ ID NO：3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO：4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸引物组扩增艰难梭菌hydR基因中的目标序列。

本发明的另一个目的在于提供寡核苷酸引物组，其含有包含存在于如SEQ ID NO：5中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：5中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和包含存在于如SEQ ID NO：6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸引物组扩增艰难梭菌基因组中的目标序列。

本发明的另一个目的在于提供寡核苷酸引物组，其含有包含存在于如SEQ ID NO：11中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：11中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和包含存在于如SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸引物组扩增艰难梭菌tcdB基因中的目标序列。

本发明的另一个目的在于提供用于在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的试剂盒，所述试剂盒包含：如上所定义的寡核苷酸引物组；以及用于在核酸扩增反应中进行核酸扩增的试剂。

发明详述

本发明方法的目的在于充当针对高毒力艰难梭菌，和复发性疾病相关核糖核酸型027的定性鉴定的初步微生物筛选测试。方法优选从在不使用浓缩培养基情况下直接提取自如粪样品的生物样品的DNA进行。优选地，本发明的方法是基于PCR的艰难梭菌测定：如qPCR测定，或基于核酸的定性多重化体外诊断试验，其意图用于检测对应于高毒力艰难梭菌和毒素生产性027核糖核酸型选择标志物的检测和鉴定的核酸标志物。

如本文所用，存在于核酸样品中的“目标序列”是待引发并通过“引物”延伸的艰难梭菌DNA链。目标序列可以是单链的或在与其互补序列的双链体中。在本文所述的扩增反应之前，优选在一定程度上纯化本发明中定义的目标序列。

如本文所用，术语“寡核苷酸”指在DNA扩增方法中用作试剂的核苷酸，核苷，核碱基或相关化合物中两种或更多种的任何聚合物，如引物和探针。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA和/或其类似物。术语寡核苷酸不表示针对试剂的任何特定功能；相反，它通常用于覆盖本文所述的所有此类试剂。以下更详细地描述本发明的特定寡核苷酸。如本文所用，寡核苷酸实际上可以是任何长度，仅受其在DNA扩增反应中的特异性功能的限制。定义的序列和化学结构的寡核苷酸可以通过本领域普通技术人员已知的技术产生，如通过化学或生物合成，以及通过来自重组核酸分子(即细菌或病毒载体)的体外或体内表达产生。寡核苷酸可以以任何方式修饰，只要给定的修饰与给定寡核苷酸的所需功能相容即可。本领域普通技术人员可以容易地确定是否给定的修饰对于本发明的任何给定的寡核苷酸是合适的或期望的。修饰包括但不限于碱基修饰，糖修饰或主链修饰。虽然本发明的寡核苷酸的设计和序列取决于它们如下所述的功能，一般需要考虑几个变量。其中最关键的是：长度、G/C含量、解链温度(Tm)、Gibb自由能(G)、特异性、自身互补和与系统中其他寡核苷酸互补、多聚嘧啶(T，C)或多聚嘌呤(A，G)区段(streches)，以及3′末端序列。控制这些和其他变量是寡核苷酸设计的标准和众所周知的方面，并且可以使用各种计算机程序来筛选大量潜在的寡核苷酸用于最佳寡核苷酸。

如本文所用，术语“PCR反应”或“PCR扩增”通常是指使用与互补链杂交的引物循环聚合酶介导的核酸指数扩增，例如描述于Innis et al，PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications，Academic Press(1990)。已经研发出能够与组合物进行热循环反应，读取荧光染料的强度，并在每个循环后显示荧光强度的设备，所述组合物含有能够发射指定波长光束的荧光指示剂。扩增产物含有与目标核酸序列或其互补物具有序列同一性的序列，并且可以用例如插入染料或检测探针检测，所述检测探针对靶核酸序列的区域或其互补物具有特异性。本发明中定义的PCR反应优选作为实时PCR测定进行。

如本文所用，术语“探针”是指指示扩增的多种信号分子中的任何一种。例如， Green和其他DNA结合染料是检测探针。一些检测剂探针可以是基于序列的，例如5′核酸酶探针。各种检测剂探针在本领域中是已知的，例如探针(参见美国专利号5,538,848)。可以通过添加修饰的核苷酸来增加探针的解链温度Tm。一个探针中修饰的核苷酸的量优选为1，2，3，4或更多。修饰的核苷酸可以是LNA核苷酸(Exiqon A/S)、小沟结合剂(minor groove binder)(MGB^TM)、SuperBase，或肽核酸(PNA)或增加探针Tm的任何其它修饰。

本领域技术人员知道扩增的目标序列(即扩增子)在相关菌株中天然地变化。在本发明的方法中设计适于扩增所述扩增子的引物时，可以考虑这种微小变化。优选地，在该方法中扩增了选自由SEQ ID NO：1，2和10组成的组的每个目标扩增子的至少50，60，70，80，90或100个核苷酸长的序列。

优选地，引物和探针包含如权利要求书中所定义的序列，并且少于30，35，40，45，50或55个核苷酸长，并且更优选地少于50个核苷酸长。每个目前的引物和探针也可以定义为选自SEQ ID NOS：3-9和11-13或包含SEQ ID NOS：3-9和11-13的序列的任一个引物或探针序列中存在的至少10、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。

本发明涉及在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株存在的方法。优选地，该方法是实时PCR测定。可以使用DNA芯片，凝胶电泳，辐射测量，荧光测量，或磷光测量进行该方法。本领域技术人员也可以在利用PCR或核酸扩增的其他方法和平台中使用本发明的引物和探针。例如，所述生物样品可以是粪样品、环境样品或食物样品。

所述方法包括以下步骤：

进行核酸扩增反应，其包含自所述生物样品提取的DNA作为模板、在所述反应中对于扩增艰难梭菌hydR基因中目标序列特异性的第一寡核苷酸引物组、和在所述反应中对于扩增对应于SEQ ID NO：2所列的艰难梭菌序列的目标序列的至少部分特异性的第二寡核苷酸引物组，其中所述hydR基因包含对应于SEQ ID NO：1的序列。优选地，所述方法包含在所述生物样品中通过任何能够检测反应中扩增的目标序列的方法的在所述生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的步骤。

当第一寡核苷酸引物组不扩增出特异性产物(即hydR基因中的目标序列对于高毒力艰难梭菌菌株是阴性标志物)并且所述第二寡核苷酸引物组扩增出特异性产物(即艰难梭菌基因组中由第二引物组靶向的序列对于高毒力艰难梭菌菌株是阳性标志物)时，在所述样品中检出所述高毒力艰难梭菌菌株。

本方法检测的最重要的高毒力艰难梭菌菌株是毒素生产性艰难梭菌菌株027。因此，本方法特别涉及这种艰难梭菌菌株的检测。然而，所述样品中艰难梭菌hydR基因DNA的存在指示了艰难梭菌菌株027不存在于检查的样品中，或者说明了除了存在毒素梭菌菌株027之外，样品中还存在另一种艰难的梭菌菌株。然而，本领域技术人员意识到一些高毒力艰难梭菌菌株不被归类于027-核糖核酸型菌株，因此，本发明还涉及与高毒力027-核糖核酸型类似的艰难梭菌菌株的检测。

优选地，第一寡核苷酸引物组靶向艰难梭菌hydR基因，并扩增SEQ ID NO：1所列的hydR序列，从而序列的至少一部分在扩增反应中被特异性扩增。更优选地，第一寡核苷酸引物组含有包含存在于如SEQ ID NO：3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO：4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，所述引物扩增SEQ ID NO：1所列的hydR序列的至少部分。最优选地，第一寡核苷酸引物组含有包含如SEQ ID NO：3中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：3中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：4中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：4中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

可以通过使用包含如SEQ ID NO：7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续的核苷酸或者或由如SEQ ID NO：7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续的核苷酸组成的探针，或者优选地通过使用包含如SEQ ID NO：7中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：7中所列的核苷酸序列来检测用第一寡核苷酸引物扩增的目标序列的存在。

艰难梭菌基因组中第二寡核苷酸引物组的目标序列对应于编码假定的接合转座子DNA重组蛋白的基因。优选地，所述第二寡核苷酸引物组含有包含存在于如SEQ ID NO：5所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：5所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO：6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。更优选地，第二寡核苷酸引物组含有包含如SEQ ID NO：5中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：5中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，以及包含如SEQID NO：6中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：6中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

SEQ ID NO：8和9中定义的第二寡核苷酸引物组的探针可用作相同反应中的竞争性探针，以检测艰难梭菌基因组中对应于SEQ ID NO：8或9中位置12的位置处的G/A多态性。可以通过使用包含如SEQ ID NO：7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续的核苷酸或由如SEQ ID NO：7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续的核苷酸组成的探针来检测用所述第二寡核苷酸引物组扩增的目标序列的存在，从而检测所述G/A多态性。优选地，通过使用包含如SEQ ID NO：8或9中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：8或9中所列的核苷酸序列组成的探针来检测用所述第二寡核苷酸引物组扩增的目标序列。

如方法中定义的扩增反应还可以包含对于扩增艰难梭菌毒素B基因(tcdB)特异性的第三寡核苷酸引物组。第三寡核苷酸引物组扩增如SEQ ID NO：10所列的核苷酸区域的至少一部分。

优选地，第三寡核苷酸引物组含有包含存在于如SEQ ID NO：11所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：11所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。

更优选地，第三寡核苷酸引物组含有包含如SEQ ID NO：11中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：11中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，以及包含如SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

通过使用包含存在于如SEQ ID NO：13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO：13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的探针，优选地，通过使用包含如SEQ ID NO：13中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：13中所列的核苷酸序列组成的探针来检测用所述第三寡核苷酸引物组扩增的目标序列的存在。

本发明还涉及寡核苷酸酸引物组(即寡核苷酸)，其包含如上对于第一，第二或第三寡核苷酸引物组或其混合物所定义的引物。引物组还可以包含如上定义的用于每个引物组的探针。本发明还涉及这些寡核苷酸引物组用于在生物样品(如粪样品或食物样品)中检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的用途。

本发明还提供了用于在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的试剂盒，试剂盒可以包含如上定义的寡核苷酸引物组；以及用于进行核酸扩增的试剂。优选地，试剂选自下组：DNA聚合酶、dNTP，和缓冲液。

本发明的另一个实施方案是使用具有修饰的核苷酸的寡核苷酸引物和探针在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法。通常，使用经修饰的核苷酸使缩短寡核苷酸引物或探针而不损害其特异性成为可能。一个引物或探针中修饰的核苷酸的量优选为1，2，3，4或更多。修饰的核苷酸可以是LNA核苷酸(Exiqon A/S)、小沟结合剂(minor groovebinder)(MGB^TM)、SuperBase，或肽核酸(PNA)或对寡核苷酸具有相同作用的任何其它核苷酸修饰。该方法包括与上文和权利要求书中所述的方法基本相同的步骤，但是用至少一种修饰的引物或探针进行。用于此类方法的引物和探针的一个实例是：

引物对1(用于检测hydR基因)：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其中探针具有序列SEQ ID NO：7。

引物对2(用于检测假定的接合转座子，pct)：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，其中探针具有序列CTG TAG ATT TCG GTA CGA(SEQ ID NO：14)，其中带下划线的核苷酸是修饰的核苷酸如LNA。

引物对3(用于检测tcdB基因)：SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，其中探针具有序列SEQ ID NO：13。

因此，本领域技术人员将理解，可以通过使用至少一个修饰的核苷酸以类似的方式缩短任何上述引物或探针的长度。

用于阐明本发明背景，特别是提供关于其实践的附加细节的出版物和其他材料通过引用并入本文。在下面的实施例中进一步描述本发明，这并不意图限制本发明的范围。

实施例

实施例1：

在该实施例中，使用所公开的发明的测定来检测产生毒素的和非毒素产生性的艰难梭菌菌株。共测试了代表37个不同核糖核酸型的48个表征的样品。该测试排除了027或遗传上密切相关的核糖核酸型。

该测定包含一个扩增目标组(target panel)的多重PCR反应(表1)。基于这些标志物的组合检测来鉴定毒素生产性艰难梭菌和区分高毒力艰难梭菌。毒素标志物：tcdB基因编码毒素B，027-阴性标志物：hydR编码TetR家族转录调节蛋白，以及027阳性标志物：pct编码推定的接合转座子DNA重组蛋白。引物和探针如表9所定义。

艰难梭菌测定应该从不同的毒素生产性艰难梭菌菌株中给出阳性结果，并对非毒素产生性的艰难梭菌菌株给出阴性结果。测试了包容性(inclusivity)(分析反应性)以说明包含在组中包括的目标之间的潜在遗传变异。本实施例使用良好表征的菌株描述了艰难梭菌qPCR测定的包容性的结果。

表1.艰难梭菌测定目标组

材料和方法

1.1细菌靶标列表

艰难梭菌测定涵盖引起胃肠道感染的病原体。在涵盖非毒素艰难梭菌和毒素B生产艰难梭菌的包容性研究中，测试了代表37个不同核糖核酸型的总共48个特征样品，菌株名单见表2。该测试排除了027或遗传上非常密切相关的核糖核酸型。

从商品化的生物库(ATCC，DSMZ，和Microbiologics)中收集菌株。以小于100ng/μl的浓度测试DNA样品。

表2.Amplidiag艰难梭菌GE测定包容性测试组

#	原始编码	#	原始编码	#	原始编码
						1	ATCC 51695	17	ATCC BAA-1808	33	106090
2	ATCC 43599	18	106216	34	ATCC 43603
						3	ATCC 17857	19	ATCC BAA-1812	35	ATCC 43255
4	ATCC BAA-1871	20	ATCC 43601	36	AHS 56035
						5	0329P(ATCC 9689)	21	ATCC 43602	37	ATCC BAA-2156
6	ATCC BAA-1813	22	0527P(ATCC 700057)	38	RHC 7727
						7	ATCC BAA-1874	23	106210	39	AHS 55868
8	ATCC BAA-1809	24	ATCC BAA-1873	40	106194
						9	ATCC BAA-1810	25	ATCC BAA-1804	41	RHC 7758
10	ATCC BAA-1801	26	ATCC BAA-1811	42	ATCC BAA-1807
						11	ATCC BAA-1382	27	AHS 55375	43	ATCC BAA-1872
12	ATCC 43596	28	0833P(ATCC 43593)	44	ATCC BAA-1806
						13	ATCC 43600	29	RHC 7722	45	ATCC BAA-2155
14	AHS 55050	30	AHS 26782	46	ATCC BAA-1814
						15	ATCC 43598	31	AHS 55985	47	106073
16	106222	32	ATCC BAA-1875	48	AHS 56010

1.2试剂和仪器

qPCR试剂：

qPCR Mastermix，Mobidiag

由艰难梭菌qPCR引物和探针组成的测定混合物

设备：

Stratagene MxPro 3000

PCR设置

反应中：

10μl 2x Mastermix

5ul 4x引物混合物

5μl样品/阳性对照DNA混合物/DNA提取物对照/H2O

--------------

20ul总体

PCR程序：

结果

表3.艰难梭菌菌株中标志物toxB，pct和hydR的鉴定

对照的功能性

-阳性对照检测为阳性

-阴性对照检测为阴性

-在所有样品中检测到内部扩增对照

结论

所有39个毒素生产性菌株均被正确鉴定为ToxB+。所有9个非毒素生产性菌株均被正确鉴定为阴性。没有菌株给出027核糖核酸型(toxB+，pct+，hydR-)的假阳性鉴定。

如预期，检测到对照，这证实了结果的可靠性。

实施例2：

在该实施例中，测试了所公开的发明区分027核糖核酸型检测的功能性。将两个非常密切相关的核糖核酸型(即016和176)包含在样品中。

材料和方法

DNA提取

如下提取来自艰难梭菌隔离群的DNA：将来自细菌培养物的菌落悬浮于1xPBS缓冲液中，终浓度约为1.5x 10^8CFU/ml(参考McFarlan标准0.5)。用NucliSENS EasyMAG(bioMérieux)设备根据制造商用于Generic 2.0.1程序方案自动提取后，将100μl细菌悬浮液转移到板外(off-board)裂解步骤。将DNA洗脱至100μl洗脱缓冲液。提取系列包含提取对照物，即艰难梭菌(无毒素生产性菌株)。

实时PCR和分析

如实施例1定义进行PCR反应。内部扩增对照，阳性PCR对照和阴性PCR对照包括在测试系列中。

测试了总共18个不同027核糖核酸型菌株，一个016核糖核酸型菌株和一个176核糖核酸型菌株。

表4.艰难梭菌027株中标志物toxB，pct和hydR的鉴定

该测定给出了所有18个不同027菌株的正确鉴定，并给出了016和176核糖核酸型的正确鉴定。因此，除027核糖核酸型为027+之外，该测定检测了遗传上密切相关的016和176核糖核酸型。

实施例3：

在该实施例中，将所公开的发明与用于检测027推定的阳性艰难梭菌的现有技术方法相比较。将本发明的测定与Xpert艰难梭菌/Epi(Cepheid)测试相比较。

Xpert艰难梭菌/Epi测试使用检测tcdC基因中的缺失来报告阳性027推定发现。

用这两种方法测试了代表11个不同核糖核酸型的总共11个不同菌株，并且比较了结果。

Xpert艰难梭菌/Epi测试报告了5个株为产毒的艰难梭菌阳性，027推定阳性，而没有一个测试菌株实际上是核糖核酸型027。在这5种菌株中，本发明的方法只鉴定了2个菌株为027阳性，从而说明了与现有技术相比，在区分027和非027核糖核酸型之间的改善效应。值得注意的是，这两个艰难梭菌菌株(016和176)已显示与高毒力艰难梭菌菌株高度相关(Knetsch et al.，2011)。

如预期，本公开的标志物的鉴定正确报告了作为ToxB+的9个菌株，而未报告027+。总之，本发明的测定将9/11菌株正确鉴定为027-，而Xpert艰难梭菌/Epi测试正确报告了6/11菌株关于027的推定的阴性。

实施例4：

本发明的工作流程由以下组成：从粪样品提取核酸(NucliSens easyMAG)、实时PCR扩增和检测目标基因区域以及分析结果。

在该实施例中，不同的毒素生产性艰难梭菌菌株在粪背景下作为掺杂样品(spiked sample)进行测试。共使用35个不同的菌株。将每个菌株掺入艰难梭菌阴性的粪样品中。自粪样品提取DNA并且进行了qPCR反应，从而菌株以7，5CFU/反应或75CFU/反应的浓度存在，如表6所示。所有样品均以一式两份的反应进行测试。

结果表明，菌株在所有情况下都被正确鉴定为阳性。

表6.掺杂粪样品中不同毒素生产性艰难梭菌菌株的检测

标志物检测的Cq值

IC＝内部对照，控制PCR抑制

CFU/rxn＝菌落形成单位/反应

每个样品两次重复

实施例5：

本实施例描述了对艰难梭菌qPCR测定中由于交叉反应所致的潜在的假阳性结果的研究结果。用于此设计测定的样品材料是粪样品。因此，与胃肠道感染相关且其不被测定组覆盖的病原体(细菌，病毒和寄生虫)可以导致潜在的交叉反应。包含到共生菌群的细菌也可以起交叉反应。此外，将包括到测定目标组的病原体添加到交叉反应研究中，因为仅应检测出目标病原体并且不应该发生其他目标之间的交叉反应。

材料和方法

试剂，设备和样品

qPCR试剂：

Mobidiag’s qPCR Mastermix(MM)

由艰难梭菌qPCR引物和探针(参见表9)组成的测定混合物

设备：

Stratagene Mxp3000

PCR设置

反应中：

10ul 2x MM

5μl 4x引物混合物

5μl样品/阳性对照DNA混合物/H2O

---------------

20μl总体

阳性对照＝模板混合物

样品：

从127个病原体提取的DNA(或RNA)。菌株主要收集自商品化的生物库(ATCC，DSMZ，Microbiologics Qnostics和Vircell)。一些菌株从Mobidiag生物库中加入，并且那些菌株最初从患者样品中纯化并用HUSLAB表征(赫尔辛基大学中心医院实验室)。

通过16S rRNA测定或NanoDrop测定DNA的量。

表7.交叉反应结果

对照的功能性

-阳性对照检测为阳性

-阴性对照检测为阴性

结果

交叉反应性试验显示无假阳性。

表9.寡核苷酸引物和探针

[表9]

表10.由寡核苷酸组扩增的扩增子

[表10]

参考文献

Denéve，C.，Janoira，C.，Poilaneb，I.，Fantinatob，C.，and Collignon，A.，Newtrends in Clostridium difficile virulence and pathogenesis，InternationalJournal of Antimicrobial Agents，2009 33：24-28.

Eastwood，K.，Else P.，Charlett，A.，and Wilcox，MH.，Comparison of NineCommercially Available Clostridium difficile Toxin Detection Assays，a Real-Time PCR Assay for C.difficile tcdB，and a Glutamate Dehydrogenase DetectionAssay to Cytotoxin Testing and Cytotoxigenic Culture Methods，J.Clin.Microbiol.，Oct.2009，p.3211-3217.

Hirvonen，JJ.，Mentula，S.，Kaukoranta，S-S.，Evaluation of a New AutomatedHomogeneous PCR Assay，GenomEra C.difficile，for Rapid Detection of ToxigenicClostridium difficile in Fecal Specimens，J.Clin.Microbiol.2013，51(9)：2908.DOI：10.1128/JCM.01083-13.

Houser，BA.，Hattel，AL.，and Jayarao，BM.，Real-Time Multiplex PolymeraseChain Reaction Assay for Rapid Detection of Clostridium difficile Toxin-Encoding Strains，Foodborne Pathogens And Disease，2010，7(6)：719-726.

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Rupnik，M.，Wilcox，MH.and Gerding，DN，Clostridium difficile infection：new developments in epidemiology and pathogenesis，Nature Reviews Microbiology7，526-536(July 2009)p526，doi：10.1038/nrmicro2164

序列表

<110> 分子诊断有限责任公司

<120> 检测高毒力艰难梭菌菌株存在的方法

<130> 53625

<150> FI 20146124

<151> 2014-12-19

<160> 13

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 232

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 1

cgaacttcct ctattaaagc gaatgggatt ttttctaacc agctacaatg taccattttt 60

ctacgtgtgt aatcattcgc actatgaaca accaattcta ttattttttc atttgctgta 120

agggtgtcat cagcaacaag atactctaaa aaattattca tttgtgagta aagttctttt 180

gtgacacttc tcagtatatc ttctttagtt ttaaagtgat gatacattgc ac 232

<210> 2

<211> 119

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 2

acggaaacat caaataacga attgacaatt tctgtagatt tcggtacgaa aacttcatgg 60

gaaagcagct tggtaaccca attaaatgaa ataccatata ataacattgg taaaggtac 119

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 3

cgaacttcct ctattaaagc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 艰难梭菌 630

<400> 4

gtgcaatgta tcatcacttt a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 5

acggaaacat caaataacg 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 6

gtacctttac caatgttatt atatg 25

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 7

aatcattcgc actatgaaca accaatt 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 8

tctgtagatt tcggtacgaa aacttca 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 9

tctgtagatt ttggtacgaa aacttca 27

<210> 10

<211> 171

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 10

ggaagtgaat gtatatgaaa acctaagtag atattagtat attttataaa tagaaaggag 60

gatatataaa agagttttag catttagatg taaaaatatt caataaaaat attatagtaa 120

aggagaaaat tttatgagtt tagttaatag aaaacagtta gaaaaaatgg c 171

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 11

ggaagtgaat gtatatgaaa acc 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 12

gccatttttt ctaactgttt tc 22

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 艰难梭菌630

<400> 13

agaaaggagg atatataaaa gagttttagc 30

Claims

1.在生物样品中检测高毒力艰难梭菌(Clostridium difficile)菌株的存在的方法，所述方法包括：

进行核酸扩增反应，其包含自所述生物样品提取的DNA作为模板、在所述反应中对于扩增艰难梭菌hydR基因中目标序列特异性的第一寡核苷酸引物组、和在所述反应中对于扩增对应于SEQ ID NO:2所列的艰难梭菌序列的目标序列的至少部分特异性的第二寡核苷酸引物组，其中所述hydR基因包含对应于SEQ ID NO:1的序列。

2.根据权利要求1的方法，其包括在所述生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株存在的步骤，其中当所述第一寡核苷酸引物组不扩增出特异性产物并且所述第二寡核苷酸引物组扩增出特异性产物时，在所述样品中检出所述高毒力艰难梭菌菌株。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述高毒力艰难梭菌菌株是艰难梭菌菌株027或者027-核糖核酸型-类似艰难梭菌菌株(027-ribotype-resembling Clostridium difficilestrain)。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述样品中艰难梭菌hydR基因DNA的存在指示艰难梭菌菌株027不存在于所述样品中。

5.根据权利要求1或2的方法，其中对于所述第一寡核苷酸引物组的艰难梭菌特异性目标序列是如SEQ ID NO:1所列的艰难梭菌hydR基因的核苷酸区域，并且所述核苷酸区域的至少部分被特异性扩增。

6.根据权利要求5的方法，其中所述第一寡核苷酸引物组含有包含存在于如SEQ IDNO:3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。

7.根据权利要求6的方法，其中所述第一寡核苷酸引物组含有包含如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸和包含SEQ IDNO:4中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

8.根据权利要求1或2的方法，其中通过使用包含存在于如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的探针来检测用所述第一寡核苷酸引物组扩增的目标序列的存在。

9.根据权利要求8的方法，其中通过使用包含如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列组成的探针来检测用所述第一寡核苷酸引物组扩增的目标序列的存在。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二寡核苷酸引物组含有包含存在于如SEQ ID NO:5所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:5所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。

11.根据权利要求10的方法，其中所述第二寡核苷酸引物组含有包含如SEQ ID NO:5中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:5中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，以及包含如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过使用包含SEQ ID NO:8或9所列的核苷酸序列或由SEQ ID NO:8或9所列的核苷酸序列组成的探针来检测用所述第二寡核苷酸引物组扩增的目标序列的存在。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述扩增反应还包含在所述反应中对于扩增艰难梭菌毒素B基因(tcdB)特异性的第三寡核苷酸引物组，并且在所述反应中特异性扩增出如SEQ ID NO:10中所列的核苷酸区域的至少部分。

14.根据权利要求13的方法，其中所述第三寡核苷酸引物组含有包含存在于如SEQ IDNO:11所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:11所列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。

15.根据权利要求14的方法，其中所述第三寡核苷酸引物组含有包含如SEQ ID NO:11中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:11中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，以及包含如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

16.根据权利要求13的方法，其中通过使用包含存在于如SEQ ID NO:13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的探针来检测用所述第三寡核苷酸引物组扩增的目标序列的存在。

17.根据权利要求16的方法，其中通过使用包含如SEQ ID NO:13中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:13中所列的核苷酸序列组成的探针来检测用所述第三寡核苷酸引物组扩增的目标序列的存在。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物样品是粪样品或食物样品。

19.根据权利要求2的方法，其中使用DNA芯片、凝胶电泳、辐射测量、荧光测量，或磷光测量(phosphorescence measurement)来进行高毒力艰难梭菌菌株的检测。

20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法作为实时PCR测定进行。

21.寡核苷酸引物组，其含有包含存在于如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，以及包含存在于如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸引物组扩增艰难梭菌hydR基因中的目标序列。

22.根据权利要求21的寡核苷酸引物组，其含有包含如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列的寡核苷酸和包含如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列的寡核苷酸。

23.根据权利要求22的寡核苷酸引物组，其包含由如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

24.根据权利要求21-23中任一项的寡核苷酸引物组，其还含有包含存在于如SEQ IDNO:7中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的探针。

25.根据权利要求24的寡核苷酸引物组，其中所述探针包含如SEQ ID NO:7所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:7所列的核苷酸序列组成。

26.寡核苷酸引物组，其含有包含存在于如SEQ ID NO:5中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:5中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和包含存在于如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸引物组扩增艰难梭菌基因组中的目标序列。

27.根据权利要求26的寡核苷酸引物组，其含有包含如SEQ ID NO:5中所列的核苷酸序列的寡核苷酸和包含如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列的寡核苷酸。

28.根据权利要求27的寡核苷酸引物组，其包含由如SEQ ID NO:5中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

29.根据权利要求26-28中任一项的寡核苷酸引物组，其还含有包含存在于如SEQ IDNO:8或9中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:8或9中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的探针。

30.根据权利要求24的寡核苷酸引物组，其中所述探针包含如SEQ ID NO:8或9所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:8或9所列的核苷酸序列组成。

31.根据权利要求26-30中任一项的寡核苷酸引物组，其还包含根据权利要求21-25中任一项的寡核苷酸引物组。

32.寡核苷酸引物组，其含有包含存在于如SEQ ID NO:11中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:11中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和包含存在于如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸引物组扩增艰难梭菌tcdB基因中的目标序列。

33.根据权利要求32的寡核苷酸引物组，其含有包含如SEQ ID NO:11中所列的核苷酸序列的寡核苷酸和包含如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列的寡核苷酸。

34.根据权利要求33的寡核苷酸引物组，其包含由如SEQ ID NO:11中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:12中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸。

35.根据权利要求32-34中任一项的寡核苷酸引物组，其还含有包含存在于如SEQ IDNO:13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的探针。

36.根据权利要求35的寡核苷酸引物组，其中所述探针包含如SEQ ID NO:13所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:13所列的核苷酸序列组成。

37.根据权利要求32-34中任一项的寡核苷酸引物组，其还包含根据权利要求31的寡核苷酸引物组中定义的寡核苷酸。

38.寡核苷酸探针，其含有包含存在于如SEQ ID NO:7,8,9或13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或由存在于如SEQ ID NO:7,8,9或13中所列的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。

39.根据权利要求21-37中任一项的寡核苷酸引物组用于在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的用途。

40.根据权利要求39中的用途，其中所述生物样品是粪样品或食物样品。

41.用于在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的试剂盒，所述试剂盒包含：根据权利要求21-37中任一项的寡核苷酸引物组；以及用于进行核酸扩增的试剂。

42.根据权利要求41的试剂盒，其中所述试剂选自下组：DNA聚合酶、dNTP、和缓冲液。