CN116004548A - 一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法 - Google Patents

一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：S1：将目标microRNA装载于外泌体中；S2：将装载有目标microRNA的外泌体添加至被转染的细胞培养液中；S3：将步骤S2获得的间充质干细胞挑取克隆，传代培养，获得诱导性多能干细胞。本发明的方法与现有重编程技术相比在保证高诱导率的基础上具有显著的安全性和无细胞损伤。

Description

一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法。
背景技术
诱导性多能干细胞（iPSCs）技术是通过向终末分化细胞导入特定的转录因子，通过特定基因的表达将体细胞逆转为多能干细胞，使其具备类似于胚胎干细胞的全能性及无限增殖特性。
 iPSCs技术开发早期多采用整合病毒载体介导来实现上述细胞逆转过程。最初使用“逆转录酶病毒”为载体向体细胞中植入几种转录因子基因，通过这些转录因子表达对细胞实现基因重编程，最终获得iPS细胞。而这种方法的缺陷是增加了宿主细胞基因组不稳定性风险，有可能会由于外源基因插入细胞基因组，而干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。
随着iPS技术不断发展，以及人们对其衍生的细胞产品用于药物开发及临床应用的迫切期望，科学家们正在积极的通过不同策略开发安全性更高的iPSCs诱导技术，以达到有效治疗应用的安全性和产品质量标准要求。
目前miRNA法被认为是未来临床应用最有希望的技术策略，其不涉及基因编辑等过程，无基因整合风险，但仍然存在一些尚未解决的问题：（1）单独使用诱导效率不高，通常与转录因子导入联用以提高诱导效率；（2）microRNA导入细胞的方式是通过脂质体，导入效率相对较低；（3）脂质体的使用导致外源物质引入，同时其本身也存在一定细胞毒性，会参与细胞生理活动，进而有可能影响后续细胞质量。（4）为降低脂质体对细胞造成的毒性，转染后需在4-8小时内换液，此步骤增加了操作的繁琐性。因此提升此方法优化microRNA组分及递送方式仍为提高诱导效率的攻坚难点。
目前miRNA介导的iPS诱导技术主要以脂质体转载，从未有文献报道过使用外泌体来实现此过程。
外泌体(exosomes)是一种直径在30-150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含rna、蛋白质、microrna、dna片段等多种成分。外泌体的结构（磷脂双分子层和囊泡状结构）和生理特性，使它们具有很好的生物相容性，低免疫原性和低毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好，是miRNA递送系统的理想候选者。目前对外泌体递送系统研究，主要集中于药物递送，即提取细胞本身自装载的外泌体进行靶向细胞治疗；或者外泌体提取后进行药物装载用于后续靶向细胞治疗。在iPS细胞制备过程中尚未有人尝试。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明的第一方面，提供了一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：
S1：将目标microRNA装载于外泌体中；
S2：将装载有目标microRNA的外泌体添加至含有被转染的细胞的培养基中进行培养使其转染至细胞内；
S3：将步骤S2获得的发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中的装载方法为电穿孔、超声或直接孵育。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中的外泌体来自人源细胞或牛奶外泌体。
在本发明的一些实施例中，所述人源细胞的类型与被转染细胞的类型相同。
在本发明的一些实施例中，人源细胞为外周血单个核细胞、间充质干细胞、成纤维细胞或内皮祖细胞。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中的外泌体的制备方法包括如下步骤：
a：将细胞接种于培养瓶中，加入完全培养基，培养至融合度约50-60%，更换为DMEM培养基，继续培养2天后，收集培养上清离心后置于-80℃温度下待用；
b：将细胞上清溶解离心，收集上清后离心，收集沉淀用PBS重悬后，再次离心，沉淀用PBS重悬待用。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中将目标microRNA通过电穿孔装载于外泌体中的具体步骤为：
将miRNA悬液与外泌体悬液等体积混合，置于电转仪中进行电转，操作结束后将外泌体37℃静置，加入PBS，离心，沉淀用PBS重悬待用。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中将目标microRNA通过超声装载于外泌体中的具体步骤为：
将miRNA悬液与外泌体悬液等体积混合均匀，使用超声波细胞破碎仪将超声探头没入混合液内，超声分 6 个周期，超声波细胞破碎仪参数设置为：频率20 kHz，振幅20%，30s ON/30 s OFF，整个过程在冰浴上进行，超声结束后，将所获得的溶液在 37℃恢复 30min，将所获得的溶液重新使用 PBS 离心洗涤，收集外泌体。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中将目标microRNA通过直接孵育装载于外泌体中的具体步骤为：
将miRNA悬液与外泌体悬液等体积混合均匀，在恒温摇床上，37°C 孵育 1h收集外泌体。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中每隔3-6天转染1次，连续转染三次以上。
在本发明的一些实施例中，目标microRNA包括miR-195-5p、miR-211-5p、miR-520c-3p、miR-30e-5p、miR-519d-3p、miR-32-5p中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，目标microRNA的使用终浓度总和不超过200nM。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中外泌体的浓度为0.5×1012-1×1012颗粒/ml。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中目标microRNA与外泌体等体积混合。
本发明还提供一种诱导性多能干细胞的制备方法，包括：
装载microRNA的外泌体与病毒重编程方法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在病毒转染之前或之后加入培养液中；
或所述装载microRNA的外泌体与质粒法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在质粒转染之前或之后加入培养液中；
或所述装载microRNA的外泌体与化学小分子法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在加入化学小分子物质之前或之后加入培养液中。
在本发明的一些实施例中，当装载microRNA的外泌体与病毒重编程方法联合使用时，所述装载microRNA的外泌体在病毒转染之后48h加入培养液中；
当装载microRNA的外泌体与质粒法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在质粒转染之后48h加入培养液中；
当装载microRNA的外泌体与化学小分子法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在加入化学小分子物质之后48h加入培养液中。
其中，病毒重编程方法是指将一定浓度的表达转录因子（例如Oct4、Sox2、Klf4、Myc）的病毒（例如仙台病毒、腺病毒等）添加于培养细胞中感染靶细胞，孵育过夜并更换新鲜培养基，持续培养每天换液直至第七天左右，将细胞消化接种于包被Matrigel的培养皿中继续培养直至有有iPS细胞克隆形成。
质粒法是指将包含转录因子（例如Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）序列的质粒载体与电转缓冲液混合后重悬细胞进行电转。将电转后的细胞接种于预先包被了Matrigel的培养皿中，每天更换新鲜培养基，直至有克隆形成。
化学小分子法是指向培养细胞中持续添加一定浓度的化学小分子物质（例如CHIR99021、PD0325901、SB590885、IWP2和Y27632等），持续培养、换液直至有iPS细胞克隆出现。
相比于现有技术传统递送系统脂质纳米颗粒（LNPs），外泌体具有以下优点：
外泌体在体液中比LNPs更稳定，LNPs可以容易被巨噬细胞或网状内皮细胞清除；由于其内源性和高生物相容性，外泌体具有相对较低的细胞毒性和免疫原性，使用后不需及时去除；外泌体具有更高的细胞摄取率，增加miRNA的转导效率；外泌体在运输过程中可以提供更好的保护，因为包裹在双层外质体膜内，不易降解。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
（1）本发明的方法操作过程简单，递送过程不引入外源物质，便于质控。
（2）本发明的方法使用外泌体递送miRNA，通过细胞自然内吞导入细胞内部，对细胞不产生任何损伤及毒性，明显提高miRNA转染效率。
（3）本发明的方法与现有miRNA诱导技术相比最终iPSC诱导率较脂质体方式明显增高。
附图说明
图1为转染后24小时流式检测携带荧光的细胞率（左为外泌体递送，右为脂质体递送）；
图2为外泌体与脂质体递送目标miRNA后24小时细胞中目标miRNA水平；
图3为外泌体递送与脂质体递送miRNA 21天后碱性磷酸酶染色结果；
图4为两种方式递送miRNA获得的P5代iPSC形态照片（A为外泌体递送系统；B为脂质体递送系统）；
图5为两种方式递送miRNA获得的P5代iPSC OCT4和SSEA4表达情况（A为外泌体递送系统；B为脂质体递送系统）。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
1、基于外泌体递送系统的miRNA导入
1.1 外泌体制备
培养上清收集：将贴壁或悬浮细胞以3000-5000个细胞每平方厘米接种于培养瓶中，每平方厘米添加2ml完全培养基，即一个T75培养瓶加入15ml完全培养液。培养2天后，融合度约50-60%，更换普通DMEM培养基（不含任何血清血替等类似成分），继续培养2天后，收集培养上清于3000 g离心15min，去除细胞或细胞碎片，置于-80°C冰箱待用。
外泌体提取：将细胞上清4°C溶解，装于离心管中10000g离心30分钟，收集上清，100000g离心70分钟，收集沉淀用PBS重悬后，100000g离心70分钟，沉淀用适量PBS重悬待用。
1.2目标miRNA装载于外泌体中
I．电穿孔法
用电转缓冲液将外泌体重悬至1×1012颗粒/ml浓度，用无RNA酶水将每种miRNA溶解为20nM悬液，与上述外泌体悬液等比例混合，置于电转仪中进行电转500W，20ms，1次，操作结束后将外泌体37°C静置5-10分钟后，加入适量PBS，100000g离心70分钟，沉淀用适量PBS重悬待用。
II. 直接孵育法
将外泌体溶液与miRNA溶液等体积混合均匀，在恒温摇床上，37°C 孵育 1h，收集外泌体。
III. 超声法
将外泌体溶液与miRNA溶液等体积混合均匀，使用超声波细胞破碎仪将超声探头没入混合液内，超声分 6 个周期（20 kHz, 20% 振幅, 30s ON/30 s OFF），整个过程在冰浴上进行。超声结束后，为了恢复外泌体膜， 所获得的的溶液将在 37°C 恢复 30 min。将所获得的两种溶液重新使用 PBS 离心洗涤，收集外泌体。
1.3 携带miRNA的外泌体递送
贴壁细胞以每平方厘米10000个细胞接种到T75培养瓶中，待3-4天后时细胞长满，可消化进行传代铺板。吸出上清至新的50mL离心管待用，加入15ml DPBS清洗皿底一次，弃掉洗液；加入2ml消化酶，晃动培养瓶使消化酶均匀地覆盖培养瓶底部，置于37℃培养箱中消化3-5分钟，待细胞从瓶底脱落，则加入培养上清结束消化。收集细胞悬液，300g 离心5分钟；弃掉上清液，加入适量完全培养基重悬计数。按照每孔2×104个细胞接种在事先用Vitronectin或Matrigel包被的六孔板。
悬浮细胞可直接按照每孔2×104个细胞接种在事先用Vitronectin或Matrigel包被的六孔板。
铺板后24-36小时内用E7培养液替代完全培养基，并将携带miRNA的外泌体添加到培养液中，培养箱培养6h，温度控制在37.5 ℃，之后恢复37℃培养。24h后重复此过程，后续每天换液，添加与第一次相同浓度装载好的外泌体溶液，持续4-6天，铺板当天算第0天。
2、基于脂质体递送系统的miRNA导入
a. 细胞准备
以每平方厘米10000个细胞接种到T75培养瓶中，待3-4天后时细胞长满，可消化进行传代铺板。吸出上清至新的50ml离心管待用，加入15ml DPBS清洗皿底一次，弃掉洗液；加入2ml 消化酶，晃动培养瓶使消化酶均匀地覆盖培养瓶底部，置于37℃培养箱中消化3-5分钟，待细胞从瓶底脱落，则加入培养上清结束消化。收集细胞悬液，300g 离心5分钟；弃掉上清液，加入适量完全培养基重悬计数。按照每孔2×104个细胞接种在事先用Vitronectin或Matrigel包被的六孔板。
b. miRNA转染
铺板后24-36小时内转染，转染前给细胞换液：每孔2 ml E7培养基。每组转染体系单独配制，各准备2个1.5 ml离心管，按下表配制，将管2液体加入管1中，充分混匀，室温静置10分钟。吸取混合液加入更换了培养基的细胞中，前后左右晃动6孔板混匀。37 ℃培养箱培养。转染后，4-8h后换液，后续每天换液。铺板算D0，一遍D1，D4，D7，D11转染3至4次。第四天以相同步及条件骤进行第二次转染，转然后第三天换液，第四天重复第三次转染，转染后第三天换液，第四天再次重复转染。
表1 各组的转染体系
表1中，M1代表 miR-195-5p；M2代表miR-211-5p；M3代表miR-520c-3p；M4代表miR-30e-5p；M5代表miR-519d-3p，各组microRNA的浓度均为20µM。试剂I使用的是Opti-MEM I；转染试剂使用的是Lipofectamine Stem reagent；培养基使用的是Opti-MEM I。
3、细胞培养及传代
3.1 iPS细胞纯化
之后的细胞隔天换一次液，直至13天左右，此时已有小细胞团陆续出现。
约20-25天，克隆已长至足够大，小心用枪头将形态良好的克隆从原六孔板中挑出后，接种到事先包被有Vitronectin或Matrigel的24孔板一孔中培养约4天待克隆长大后，观察细胞形态，使用枪头将明显分化的细胞集落去除，弃上清，每孔加入1ml EDTA消化酶孵育3分钟，当大部分细胞脱落后加入上清终止消化，每孔加入2ml DPBS 洗液，收集洗液250g离心，离心结束后用适量完全培养基重悬细胞。将细胞接种至12孔板或者六孔板中。
3.2 iPS细胞扩增
收集上清，每孔加入1ml EDTA消化酶孵育3分钟，当大部分细胞脱落后加入上清终止消化，每孔加入2ml DPBS 洗液，收集洗液250g离心，离心结束后用适量完全培养基重悬细胞，并计数。以3x104个细胞/平方厘米密度接种细胞，此时细胞定义为P1代。之后每天更换培养基，培养2-3天，细胞融合度达到60-70%进行重复传代。传代三次以上进行细胞鉴定，包括形态、表型。
4、实验结果
选择携带荧光标签的miR-195-5p-Cy3分别通过外泌体和脂质体递送系统分别转染细胞，24小时后流式检测转染效率，如图1。结果可见外泌体递送系统转染24小时后细胞携带荧光标签比例为96.81%，明显高于脂质体递送系统78.99%。说明外泌体递送组细胞摄取miRNA更多，转染效率更高。
同时转染五种miRNA，转染24h后对各组样本进行RT-PCR检测，各组分细胞内五种miRNA摄取情况，详见图2。其中对照组为未进行转染的细胞。从结果可见，外泌体组的细胞内五种miRNA含量均高于脂质体组，说明外泌体组miRNA细胞转导效率更高。
外泌体递送组在转染后第6天便出现克隆，而脂质体递送系统在第9天开始有克隆出现。并且在转染后第21天进行碱性磷酸酶染色，细胞染色阳性率外泌体递送组显著高于脂质体递送组，如图3。说明外泌体递送组在诱导后21天获得更多的iPSC克隆。
对iPSC细胞扩增到P5代后，对两组方式得到的iPSC进行细胞形态和干性标志物检测，详见图4和图5。结果表明，外泌体递送miRNA系统组获得的iPSC细胞与常规脂质体递送获得的iPSC细胞同样具有典型的iPSC细胞形态及干性标志物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1：将目标microRNA装载于外泌体中；
S2：将装载有目标microRNA的外泌体添加至含有被转染的细胞的培养基中进行培养使其转染至细胞内；
S3：将步骤S2获得的发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：步骤S1中的装载方法为电穿孔、超声或直接孵育。
3.根据权利要求1所述的基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：步骤S1中的外泌体来自人源细胞或牛奶外泌体。
4.根据权利要求3所述的基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述人源细胞的类型与被转染细胞的类型相同。
5.根据权利要求1所述的基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：步骤S1中的外泌体的制备方法包括如下步骤：
a：将细胞接种于培养瓶中，加入完全培养基，培养至融合度约50-60%，更换为DMEM培养基，继续培养2天后，收集培养上清离心后置于-80℃温度下待用；
b：将细胞上清溶解离心，收集上清后离心，收集沉淀用PBS重悬后，再次离心，沉淀用PBS重悬待用。
6.根据权利要求1所述的基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2中每隔3-6天转染1次，连续转染三次以上。
7.根据权利要求1所述的基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：目标microRNA包括miR-195-5p、miR-211-5p、miR-520c-3p、miR-30e-5p、miR-519d-3p、miR-32-5p中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：目标microRNA的使用终浓度总和不超过200nM。
9.一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：
包括装载microRNA的外泌体与病毒重编程方法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在病毒转染之前或之后加入培养液中；
或所述装载microRNA的外泌体与质粒法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在质粒转染之前或之后加入培养液中；
或所述装载microRNA的外泌体与化学小分子法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在加入化学小分子物质之前或之后加入培养液中。
10.根据权利要求9所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：
当装载microRNA的外泌体与病毒重编程方法联合使用时，所述装载microRNA的外泌体在病毒转染之后48h加入培养液中；
当装载microRNA的外泌体与质粒法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在质粒转染之后48h加入培养液中；
当装载microRNA的外泌体与化学小分子法联合使用，所述装载microRNA的外泌体在加入化学小分子物质之后48h加入培养液中。
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陈俏羽;赵丽华;陈袁;张曼玲;侯道荣;姜海滨;王俊政;刘曼菱;王晨宇;尤志欢;李荣凤;: "miRNA-205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用", 南京医科大学学报(自然科学版), no. 06 *

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