CN111484969B - 毛囊干细胞来源外泌体在促进毛囊干细胞增殖以及向毛囊细胞分化中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了毛囊干细胞来源外泌体在促进毛囊干细胞增殖以及向毛囊细胞分化中的用途。本发明发现毛囊干细胞来源的外泌体可以进入受体细胞，能够促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的增殖；其中，褪黑素刺激的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛囊干细胞增殖效果更明显。本发明进一步发现，毛囊干细胞来源外泌体可以促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的迁移，褪黑素刺激的毛囊干细胞来源的外泌体促进迁移效果更明显。毛囊干细胞来源外泌体可以促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的毛囊发育相关基因的表达，进而促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化，褪黑素刺激的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛囊干细胞增殖分化效果更明显。

Description

毛囊干细胞来源外泌体在促进毛囊干细胞增殖以及向毛囊细胞分化中的用途

技术领域

本发明涉及毛囊干细胞来源外泌体的新用途，尤其涉及毛囊干细胞来源外泌体在促进毛囊干细胞增殖以及促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化中的用途，属于毛囊干细胞来源外泌体的新用途领域。

背景技术

山羊(Capra hircus)又称夏羊、黑羊或羖羊，和绵羊一样，是最早被人类驯化的家畜之一。归类于脊椎动物门，哺乳动物纲，偶蹄目，牛科，羊亚科，山羊亚科，山羊属。山羊品种按其经济用途分为乳用型、肉用型、绒用型三类。

山羊绒是动物生产的最好和最柔软的纤维之一，专门用于生产豪华纺织产品。大多数羊绒产自于自在中国，蒙古，伊朗等国家，羊绒生产对经济做出了重要贡献。中国是世界上最大的羊绒生产国，占世界羊绒产量的50％，其中约30％来自于内蒙古绒山羊。内蒙古绒山羊多分布于内蒙古自治区的西部,体质结实。内蒙古绒山羊生产的羊绒品质好，产量高，包括有理想的颜色(白色)，亮度和弹性。内蒙古绒山羊绒的生长呈现出季节性变化，即自然光周期的变化，羊绒生长通常从7月开始，随后3月停止，羊毛在4月底脱落。

哺乳动物表皮包含几个自我更新的隔室，含有多类细胞。包括表皮干细胞、来自毛囊的角质形成细胞-祖细胞、黑素细胞祖细胞、皮肤神经干细胞、外分泌腺干细胞、位于真皮乳头的皮肤衍生前体(SKP)、位于毛囊膨出区细胞表达巢蛋白的毛囊干细胞(Hairfollicle stem cells)(Yu H,Fang D,Kumar SM,et al.Isolation of a novelpopulation of multipotent adult stem cells from human hair follicles.TheAmerican journal of pathology.2006 Jun；168(6):1879-88.)。毛囊干细胞位于毛囊凸起区域的干细胞在每个毛发生长期阶段都能产生毛囊结构(Paus R,Cotsarelis G.Thebiology of hair follicles.The New England journal of medicine.1999 Aug 12；341(7):491-7.)。毛囊干细胞和大多数成体干细胞一样，具有慢周期性、自我更新、体外增殖和多向分化潜能，是毛囊中的原始细胞。毛发的周期性自我更新以及生长依赖于毛囊干细胞周期性增殖和分化(Hoffman RM.Introduction to Hair-Follicle-AssociatedPluripotent Stem Cells.Methods in molecular biology(Clifton,NJ).2016；1453:1-5.)。

毛囊干细胞具有多向分化潜能，可以分化为多种类型的细胞，例如：神经细胞，脂肪细胞，神经胶质细胞，角质形成细胞，平滑肌细胞，心肌细胞，黑素细胞，骨细胞和软骨细胞等(He N,Dong Z,Zhu B,Nuo M,Bou S,Liu D.Expression of pluripotency markersin Arbas Cashmere goat hair follicle stem cells.In vitro cellular&developmental biology Animal.2016 Aug；52(7):782-8.)。此外，毛囊干细胞还可以再生表皮。毛囊干细胞的分化潜能在毛囊的上部最大，这可以产生大量的这些干细胞(Amoh Y,Mii S,Aki R,et al.Multipotent nestin-expressing stem cells capable of forming neurons are located in the upper,middle and lower part of the vibrissahair follicle.Cell cycle(Georgetown,Tex).2012 Sep 15；11(18):3513-7.)。

毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)是一种特殊的成纤维细胞，处于毛囊最下部分。真皮乳头被确定为永久和稳定的特化成纤维细胞群，其首先表现为与表皮相互作用以确保毛囊发育的细胞聚集体，被认为提供协调毛发生长的信号(Oliver RF,JahodaCA.Dermal-epidermal interactions.Clinics in dermatology.1988 Oct-Dec；6(4):74-82.)。在毛发生长的调节中具有许多重要作用。因此，这些细胞的体外模型被广泛用于研究毛囊诱导，生长和维持的分子机制(Topouzi H,Logan NJ,Williams G,HigginsCA.Methods for the isolation and 3 d culture of dermal papilla cells fromhuman hair follicles.Experimental dermatology.2017 Jun；26(6):491-6.)。DP细胞不仅是毛囊发育和功能所必需的，而且也是细胞的储库，具有分化成具有潜在治疗重要性的一系列细胞类型的潜力。用于培养DP细胞的改进方法可用于治疗脱发，并且指导DP细胞分化成其他谱系的能力，特别是施万细胞，可提供修复受损神经的细胞来源(Biernaskie J,Sparling JS,Liu J,et al.Skin-derived precursors generate myelinating Schwanncells that promote remyelination and functional recovery after contusionspinal cord injury.The Journal of neuroscience:the official journal of theSociety for Neuroscience.2007 Sep 5；27(36):9545-59.)

30年前，Pan和Johnstone首次观察到了外泌体(Exosome)，同时研究了网织红细胞成红细胞的成熟过程，他们所指出的“囊泡”，后来被称为“外泌体”，从培养的单层细胞脱落并保留了运铁蛋白受体和许多膜相关蛋白。当时的人们只认为这是从细胞中释放出去的细胞不需要的一些囊泡，被认为是“垃圾”，还未意识到其可能存在的生物学功能。直到发现“囊泡”现象的十年后，Raposo(Raposo G,Nijman HW,Stoorvogel W,et al.B lymphocytessecrete antigen-presenting vesicles.The Journal of experimental medicine.1996Mar 1；183(3):1161-72.)等人才发现了这些囊泡可以从被病毒侵染的B淋巴细胞分离出来，具有呈递抗原和诱导T细胞应答的功能，验证了其免疫功能。从那时起，许多关于外泌体的研究开始兴起，已经鉴定外泌体为沟通细胞的桥梁，是细胞间通讯的装置。通过验证，很多癌细胞、干细胞、树突细胞、平滑肌细胞、免疫细胞等细胞都可以分泌外泌体，这些外泌体还可以发挥一些正常的生理或生物学功能(Admyre C,Johansson SM,Qazi KR,etal.Exosomes with immune modulatory features are present in human breastmilk.Journal of immunology(Baltimore,Md:1950).2007 Aug 1；179(3):1969-78.)。且外泌体天然存在于各种体液，如血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁等，在一些炎症，免疫反应上广泛应用(Cobelli NJ,Leong DJ,Sun HB.Exosomes:biology,therapeutic potential,and emerging role in musculoskeletal repair and regeneration.Annals of theNew York Academy of Sciences.2017 Dec；1410(1):57-67.)。

外泌体被认为是不同的囊泡群体，其与微泡体的大小不同。外泌体定义为30-100nm范围内的囊泡，而微囊泡定义为100-1000nm范围内的囊泡。然而，尽管存在这种明显的区别，术语“外泌体”和“微泡”在许多已发表的报告中也可互换使用(van der Pol E,Boing AN,Harrison P,Sturk A,Nieuwland R.Classification,functions,and clinicalrelevance of extracellular vesicles.Pharmacological reviews.2012 Jul；64(3):676-705.)。

外泌体的生物发生由两个步骤组成，即内体的膜囊泡的向内出芽和它们释放到多泡体(MVB)的结构中。当含有表面蛋白的细胞膜发生内吞作用时，就形成了的早期的外泌体。早期的外泌体在囊泡分拣蛋白(如转运必需核内体复合物(ESCRT))的作用下识别、分类、挑选外泌体内含蛋白，从而形成多囊泡体；或者在神经酰胺的帮助下形成多囊泡体，该过程根据是否需要ESCRT的参与分为ESCRT依赖途径及ESCRT非依赖途径。简单来说，随着腔内囊泡的积累，MVB的形成发生在早期内体到晚期内体成熟的过程中。成熟后，MVB被导向与溶酶体融合，其中它们的多泡体将经历溶酶体或质膜降解，其中它们的内容物将被释放到细胞外空间。

外泌体携带一种独特的蛋白质，脂质和RNA，可以与原始细胞不同。外泌体为其内部含有的蛋白质、脂质、RNA提供了保障，使其免受酶类降解，并通过内吞作用进入细胞。因为外泌体来自内体，它们含有对于运输和融合很重要的蛋白质，如膜联蛋白；有参与细胞靶向的四跨膜蛋白；有参与其从MVB的生物发生蛋白，如Alix和TSG101；有血小板来源生长因子受体；有溶酶体相关膜蛋白、热休克蛋白(HSPs)、脂相关蛋白等。外泌体的高通量蛋白质组学分析揭示了细胞外基质和细胞表面蛋白质的存在，如胶原蛋白，整合素和半乳糖凝集素；细胞表面受体如血小板衍生生长因子受体B和表皮生长因子受体(EGFR)；和信号传导分子和细胞内细胞骨架成分加代谢酶和G蛋白。有研究表明，外泌体内含蛋白与其来源细胞没有直接的关系，大多数外泌体的蛋白种类一致。所以一些典型的蛋白被认为是外泌体表面标记物，通常可用其对外泌体进行鉴定。包括四分子交联体家族成员(CD9、CD63、CD81)，肿瘤易感基因101(Tsg101)蛋白和热休克蛋白(HSPs)。外泌体可以与受体细胞细胞膜膜表面的受体或配体相结合，可以内化激活胞内信号通路，从而改变其细胞表型。

外泌体可以携带在细胞之间转移的功能性mRNA和miRNA(Valadi H,Ekstrom K,Bossios A,Sjostrand M,Lee JJ,Lotvall JO.Exosome-mediated transfer of mRNAsand microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.Naturecell biology.2007 Jun；9(6):654-9.)，外泌体的RNA含量是细胞RNA的一个子集，在某些情况下，可能是完全不同的或组织特异性的，无论其来源细胞是什么，都是由于外泌体在生物发生过程中特异性靶向MVB。除含有RNA外，肿瘤释放的微囊泡还含有单链DNA，基因组DNA，cDNA和转座因子(Balaj L,Lessard R,Dai L,et al.Tumour microvesicles containretrotransposon elements and amplified oncogene sequences.Naturecommunications.2011 Feb 1；2:180.)。

外泌体膜表面存在大量的蛋白和受体(如CD63、CD81、CD9、HSPs)，可通过这些蛋白与抗体的特异性结合，通过Western blot的方法对其进行鉴定。也可以通过透射电子显微镜来进行形态学观察，当在透射电子显微镜下观察时，外泌体呈典型的茶托杯状，直径为30-100nm。外泌体进一步鉴定需要蛋白质组学分析、荧光激活细胞分选技术(FACS)、纳米粒子示踪技术(NTA)等手段的辅助。

迄今为止，尚未有毛囊干细胞来源的外泌体的功能或有关活性的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种促进毛囊干细胞分泌外泌体的方法。

本发明的目的之二是提供一种促进毛囊干细胞增殖以及促进其向毛囊细胞分化的方法。

本发明的目的之三是提供一种促进毛乳头细胞增殖的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先发现，褪黑素可以促进毛囊干细胞增殖，500pg/mL褪黑素为最适增殖浓度；在此基础上，本发明进一步发现，毛囊干细胞可以分泌外泌体，用褪黑素刺激毛囊干细胞能够促进毛囊干细胞分泌外泌体，其中，采用100-700pg/mL褪黑素刺激毛囊干细胞均能促进毛囊干细胞分泌外泌体，尤其是采用500pg/mL褪黑素刺激毛囊干细胞能够最显著的促进毛囊干细胞分泌外泌体。

本发明进一步发现，毛囊干细胞来源的外泌体促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的增殖、迁移和发育相关基因的表达，可以促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化；此外，用褪黑素刺激毛囊干细胞后所分泌的外泌体促进效果更明显且呈伴浓度梯度增大而增加。

本发明通过实验发现，向毛囊干细胞加入外泌体后，毛囊干细胞的增殖均有所增加，且随着浓度梯度的增加而显著增加。褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会极显著促进毛囊干细胞的增加。因此，毛囊干细胞来源的外泌体能够促进毛囊干细胞自身的增殖，而被褪黑素处理后的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛囊干细胞增殖的效果更明显。

本发明通过实验进一步发现，毛囊干细胞来源的外泌体能够促进毛乳头细胞增殖，而被褪黑素处理后的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛乳头细胞增殖的效果更明显。

由此，本发明提供了一种促进毛囊干细胞分泌外泌体的方法，包括：用褪黑素刺激毛囊干细胞促进毛囊干细胞分泌外泌体；其中，所加入的褪黑素的浓度优选100-700pg/mL，更优选为500pg/mL。

本发明还提供了一种促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化的方法，包括：向毛囊干细胞中加入毛囊干细胞分泌的外泌体；其中，在制备毛囊干细胞分泌的外泌体时，向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌外泌体。

本发明还提供了一种促进毛囊干细胞增殖的方法，包括：向毛囊干细胞中加入毛囊干细胞分泌的外泌体促进毛囊干细胞增殖；其中，在制备毛囊干细胞分泌的外泌体时，向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌外泌体。

本发明进一步提供了一种促进毛乳头细胞增殖的方法，包括：向毛乳头细胞中加入毛囊干细胞分泌的外泌体促进毛乳头细胞增殖；其中，在制备毛囊干细胞分泌的外泌体时，向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌外泌体。

本发明整体技术方案详述

本发明首先考察了褪黑素对毛囊干细胞增殖及对其外泌体分泌量的影响，该实验将褪黑素刺激毛囊干细胞，提取其细胞上清分泌物，利用BCA蛋白定量，结果表明定量结果有所差异，初步确定褪黑素刺激毛囊干细胞，其来源的外泌体量会有所增加。根据MTT与BCA结果，联合本实验组前期数据分析认为500pg/mL褪黑素刺激3d时，毛囊干细胞增殖情况最好，未发生分化现象，其来源外泌体准确判断为毛囊干细胞的外泌体。本发明发现100pg/mL、300pg/mL、500pg/mL、700pg/mL四个浓度的褪黑素对体外培养的毛囊干细胞来源的外泌体的量均有促进作用，其中，500pg/mL褪黑素刺激组刺激3d时能够最为显著地增加毛囊干细胞外泌体的分泌量。

在无外泌体血清培养基培养下，100pg/mL、300pg/mL、500pg/mL、700pg/mL四个浓度的褪黑素对体外培养的毛囊干细胞的增殖均有促进作用，且500pg/mL是促进毛囊干细胞增殖的最适浓度。100pg/mL、300pg/mL、500pg/mL、700pg/mL四个浓度的褪黑素对体外培养的毛囊干细胞来源的外泌体的量均有促进作用，且500pg/mL褪黑素刺激组刺激3d时为外泌体最适浓度提取时间处理组。

本发明进一步考察了褪黑素对毛囊干细胞来源外泌体的影响，采用了HSP70、CD9、CD81作为了鉴定外泌体的标志性蛋白，实验结果表明呈阳性表达。选取β-actin做为内参蛋白，相对于内参，HSP70、CD9、CD81表达量明显増高，证明了本实验对外泌体的抽离有效可用于后续的实验。本实验中设置了对照组和处理组，利用褪黑素和褪黑素(受体阻断)激素处理毛囊干细胞，各激素处理细胞所得来源的外泌体都能够表达HSP70、CD9、CD81，但表达量有所不同。其中MT-Exo组的HSP70、CD9、CD81均高表达于CG-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo，CG-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo各组表达量差异不显著，这与BCA定量的结果一致，再次证明了褪黑素刺激毛囊干细胞，其来源的外泌体的量会有所增加。

本发明进一步考察了毛囊干细胞来源外泌体对受体细胞的影响。通过在毛囊干细胞中分别加入不同组处理的外泌体(CG-Exo、MT-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo)，每组外泌体加入不同浓度(100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL)，对照组加入PBS，共培养1-4d，采用MTT法检测不同处理下对毛囊干细胞的体外增殖情况；结果显示，加入外泌体后，毛囊干细胞的增殖均有所增加，且随着浓度梯度的增加而显著增加。褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会极显著促进毛囊干细胞的增加。而Luz-Exo、4-P-Exo与CG-Exo的差异较小，因为加入褪黑素后褪黑素的受体又被阻断，这可能就趋近于未处理的毛囊干细胞。加入低浓度的外泌体时，对毛囊干细胞的增殖就会产生一定的影响，高浓度外泌体对毛囊干细胞的增殖在3d后达到极显著的情况，可以看出，随着外泌体浓度的增加，外泌体促增殖能力增强。综上可见，毛囊干细胞来源的外泌体能够促进毛囊干细胞自身的增殖，而被褪黑素处理后的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛囊干细胞增殖的效果更明显。与各组外泌体加入毛囊干细胞相似，在加入外泌体后，毛乳头细胞的增殖均有所增加。

褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会极显著促进毛囊干细胞的增加。相同的，Luz-Exo、4-P-Exo与CG-Exo的差异较小。但是对于毛乳头细胞来说，在前2天时，相同天数内，加入同种外泌体不同的浓度似乎差异不大，尤其是在加入300μg/mL和500μg/mL浓度时；但总体来说，毛囊干细胞来源的外泌体能够促进毛乳头细胞增殖，而被褪黑素处理后的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛乳头细胞增殖的效果更明显。

Transwel迁移实验结果示，与对照组相比，加入褪黑素刺激的组可促进毛囊干细胞的迁移。当加入毛囊干细胞来源的外泌体时，细胞的迁移效果迅速增加。同时，褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会极显著促进毛囊干细胞的增加。与毛囊干细胞的迁移情况相似，加入褪黑素刺激的组相对于对照组来说，可促进毛乳头细胞的迁移。同样的，毛囊干细胞来源的外泌体的迁移效果迅速增加，褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会显著促进毛乳头细胞的增加。

β1-整合素和SOX9都为干细胞特异性表达基因，在毛囊干细胞加入褪黑素和褪黑素处理过的外泌体后，0-5d时，细胞表达量逐渐增加，5d后干性基因表达降低。FGF5是羊毛抑制生长基因，主要调控毛囊周期性发育，在毛囊的生长过程中均有表达，在3d时，表达量达到最大，随后表达量降低。β-catenin作为Wnt信号通路的关键因子调控毛囊干细胞分化的外源性因素作用巨大。高度激活β-catenin可导致毛囊干细胞向毛囊细胞方向分化，缺少或者低强度激活β-catenin则促进其分化成为表皮方向细胞。在0-3d时，基因表达量逐渐增加，随后表达量降低，但7d后，基因表达量又继续增加，可能是干细胞分化为毛囊细胞后，β-catenin信号通路又继续作用。KAP7和KAP8为毛囊细胞标志基因，在0-7d时表达不明显，14d时表达量迅速增加，可见外泌体的加入促进了毛囊干细胞向毛囊细胞的分化。

本发明发现毛囊干细胞来源的外泌体可以进入受体细胞；毛囊干细胞来源外泌体可以促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的增殖；其中，褪黑素刺激的毛囊干细胞来源的外泌体促进增殖效果更明显。本发明进一步发现，毛囊干细胞来源外泌体可以促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的迁移，褪黑素刺激的毛囊干细胞来源的外泌体促进迁移效果更明显。毛囊干细胞来源外泌体可以促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的毛囊发育相关基因的表达，可以促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化，褪黑素刺激的毛囊干细胞来源的外泌体促进增殖分化效果更明显。

附图说明

图1毛囊干细胞增殖活性曲线。

图2蛋白标准曲线。

图3褪黑素对毛囊干细胞外泌体分泌量的影响。

图4各组毛囊干细胞来源外泌体浓度(μg/mL)。

图5毛囊干细胞来源外泌体透射电镜图；A,未处理组毛囊干细胞来源外泌体(100×)；B,未处理组毛囊干细胞来源外泌体(200×)；C,处理组毛囊干细胞来源外泌体(100×)；D,处理组毛囊干细胞来源外泌体(200×)。

图6 Western blot检测各组毛囊干细胞来源外泌体标志蛋白。

图7毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞增殖的影响试验结果。

图8毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头细胞增殖的影响试验结果。

图9毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞迁移的影响试验结果。

图10毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头细胞迁移的影响试验结果。

图11毛囊干细胞来源外泌体调控毛囊干细胞增殖分化KAP7表达的影响试验结果。

图12毛囊干细胞来源外泌体调控毛囊干细胞增殖分化KAP8表达的影响试验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1褪黑素对毛囊干细胞增殖及对其外泌体分泌量的影响实验

1实验材料和试剂

1.1实验材料

已分离纯化的内蒙古绒山羊毛囊干细胞系。

1.2实验试剂

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone；DMSO、MTT购自Coolaber；表皮生长因子(EGF)、褪黑素(Melatonin)购自Sigma；Insulin-Transferrin-Selenium(ITS)、0.25％胰蛋白酶购自Gibco；双抗(PS)购自索莱宝；Total Exosome Isolation Reagent(from cellculture media)购自Invitrogen；RIPA裂解液、BCA Protein Assay Kit购自上海生工。

2.实验方法

2.1毛囊干细胞的解冻和复苏

(1)自液氮中取出P3代毛囊干细胞(解冻后为P4代)，迅速投入到37℃水浴中，镊子夹住剧烈震荡，至无明显冰块取出。(2)用酒精棉球轻轻擦拭管口，后移入超净工作台中。(3)移液枪吸去细胞液移入新的离心管中，1500r/min离心5min。(4)弃掉上清液，干细胞培养液(含DMEM/F12、10％FBS、1％PS、20ng/mL EGF、10μL/mL ITS)重悬。(5)在100mm培养皿中加入干细胞培养液，接种细胞悬液，放置到37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

2.2毛囊干细胞的传代培养

(1)毛囊干细胞长到60％-70％融合时，酶消化法传代培养；(2)弃掉培育细胞时的细胞培养液，加适量的有双抗的PBS溶液，清洗两遍；(3)加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，消化1min；(4)加入等体积培养液，停止消化；(5)将皿中的悬液转移入新的离心管中，1 500r/min离心5min，沉淀即为细胞，小心吸出上清，培养液重悬细胞；(6)将传代好的P5代毛囊干细胞用细胞计数板法进行细胞计数(细胞数/mL＝四个大格细胞总数/4×10⁴个/mL)。

2.3不同浓度褪黑素刺激对毛囊干细胞增殖活性的影响

细胞计数以调整细胞密度2000个/孔，接入96孔板，加入干细胞培养液。细胞贴壁后，隔天换液，将干细胞培养基的血清换为无外泌体血清(血清120000×g过夜离心制备)。设置对照组(0pg/mL)和褪黑素处理组(100pg/mL、300pg/mL、500pg/mL、700pg/mL)，每个浓度设置5个复孔，每孔总体积为150μL。分别在加入褪黑素1-4天时采用MTT法测试细胞增殖活性情况。MTT法具体如下：

(1)每孔继续加入20μL MTT(5pg/mL)工作液，枪头吹打混匀；(2)将96孔板放入37℃，5％CO₂的饱和湿度细胞培养箱中继续培养4h；(3)4h后取出培养板，吸出孔内的培养基，注意不要吸到板底的紫色沉淀；(4)向每孔各加入200μL的DMSO以溶解沉淀，将96孔板放入37℃，5％CO₂的饱和湿度细胞培养箱中，孵育30min；(5)30min后将96孔板震荡10min，酶标仪(490nm)测试OD值；(6)根据所测得的OD值，分析比较各组细胞增殖情况，并绘制细胞增殖活性曲线。

2.4褪黑素浓度的确定

细胞计数以调整细胞密度3×10⁵个/瓶，接入25cm²细胞培养瓶，加入干细胞培养液。待细胞贴壁，隔天换液，将干细胞培养基的血清换为无外泌体血清(血清120000×g过夜离心制备)。设置对照组(0pg/mL)和褪黑素处理组(100pg/mL、300pg/mL、500pg/mL、700pg/mL)，每个浓度设置3个重复培养瓶。分别在加入褪黑素1-4天时，收集各组细胞上清。采用试剂盒提取各组外泌体，并用BCA法测试各组外泌体的浓度。

2.4.1外泌体的提取

收集各组培养液上清，试剂盒法提取外泌体。

(1)300×g，离心10min，4℃，取上清；

(2)2000×g，离心15min，4℃，取上清；

(3)10000×g，离心30min，4℃，取上清；

(4)0.22μm过滤器过滤，收集滤过液；

(5)超滤管浓缩，收集细胞上清浓缩液；

(6)将细胞上清浓缩液转移至新的离心管并添加0.5体积的外泌体分离试剂；

(7)通过涡旋混合培养基/试剂混合物，直到有一个均质溶液；

(8)将样品放置在2℃至8℃孵育过夜；

(9)孵育后，以10,000×g离心样品，4℃，1h；

(10)弃掉上清液，沉淀即为外泌体，将沉淀重悬于适当体积的PBS中。

2.4.2外泌体浓度的测定

将得到的各组外泌体沉淀重悬，加入RIPA裂解液裂解，冰上孵育5min，12000×g离心5min，取上清。采用BCA法进行蛋白定量，本实验使用BCA Protein Assay Kit(生工)。

(1)标准品的配制

BCA工作液的总体积＝(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的BCA工作液体积。将5X溶液A用蒸馏水稀释为1X溶液A，根据所需BCA工作液总体积，定量取溶液A:溶液B＝50:1，混匀制成BCA工作液。取1mL蒸馏水和1mL溶液D，混匀成溶液E。称取10mg试剂C，用0.5mL溶液E溶解，涡旋震荡60s，得到溶液F。

(2)根据所测得样品个数选取酶标板上的若干孔，分为标准组和样品组。其中16个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入5μL相应浓度的标准蛋白质溶液；剩余的孔，加入各组样品5μL，分为2个重复组。

(3)各管分别加入5μL溶液F，37℃孵育30min。

(4)各孔加入200μL BCA工作液，迅速混匀，37℃中孵育30min。

(5)冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的A562值。

(6)以标准组各孔吸光值(562nm)的平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。

(7)根据相同样品的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。

3结果与分析

3.1毛囊干细胞的传代与复苏

毛囊干细胞解冻后于培养皿培养，显微镜下观察，隔天贴壁。毛囊干细胞呈明显的铺路石状生长；高倍显微镜下观察，发现毛囊干细胞呈多核状生长，细胞核占细胞比例较大，可见细胞有明显的幼稚细胞的状态。

3.2褪黑素刺激毛囊干细胞

3.2.1毛囊干细胞的形态观察

细胞接入培养板，隔天贴壁。褪黑素刺激前，毛囊干细胞的形态均一，贴于皿底整体上呈现出铺路石状生长，褪黑素刺激后，1-2d细胞形态无明显变化。3d后，细胞增殖相对于对照组明显增多，细胞形态依然为毛囊干细胞形态，呈铺路石状排列生长。4d时，看到细胞已长满96孔板底，细胞核形态突出，细胞生长的较密集。

3.2.2不同浓度褪黑素刺激对毛囊干细胞增殖活性的影响

MTT法测得的结果显示500pg/mL的褪黑素为毛囊干细胞增殖的最适浓度：以细胞培养天数为横坐标，MTT法测得的吸光值为纵坐标，绘制不同浓度褪黑素刺激对毛囊干细胞增殖活性的影响的折线图(图1)。由图可知，褪黑素处理毛囊干细胞前2d，细胞吸光值变化不大，可能是因为细胞还在适应培养基条件的改变。3d时，各组细胞吸光值变化较大，0pg/mL、100pg/mL、300pg/mL、500pg/mL、700pg/mL浓度褪黑素处理的吸光值分别为0.1087±0.0037^a、0.1109±0.0021^ab、0.1236±0.0032^bc、0.1304±0.0059^c、0.1106±0.0057^ab。由此可见，相对于不加褪黑素组，加了褪黑素组细胞增殖都明显增加(P＜0.01)，500pg/mL褪黑素处理组细胞增殖最明显。4d时，细胞继续增殖，0pg/mL、100pg/mL、300pg/mL、500pg/mL、700pg/mL浓度褪黑素处理的吸光值分别为0.2428±0.0077^a、0.3779±0.0112^e、0.3840±0.0137^e、0.3946±0.0065^e、0.3180±0.0091^c，相对于不加褪黑素组，加了褪黑素组细胞增殖依然都明显增加(P＜0.01)，500pg/mL褪黑素处理组细胞增殖最明显。综上所述认为500pg/mL的褪黑素为毛囊干细胞增殖的最适浓度。

3.2.3 BCA法测外泌体浓度

根据BCA法测得的各组标准品的吸光值，绘制标准曲线(见图2)，计算各组外泌体浓度。对不同浓度褪黑素刺激对毛囊干细胞来源的外泌体浓度进行分析(见表1)，以细胞培养天数为横坐标，浓度为纵坐标，对结果进行直观的差异性分析(图3)。结果显示，不同浓度褪黑素刺激毛囊干细胞后，随着刺激天数的增加，毛囊干细胞其来源的外泌体浓度量均有所增加。刺激3d时，500pg/mL组外泌体浓度增加剧烈，其他组呈稳步增长状态，可能是与细胞增殖也在增加有关。刺激4d时，各组外泌体浓度也有所增加，700pg/mL增长较明显，但3d时500pg/mL外泌体浓度以达到4d时的外泌体浓度，可能是因为此时细胞已大量增殖，几乎长满细胞培养瓶底，外泌体释放活力有所减弱。100pg/mL和300pg/mL刺激组，外泌体浓度也有所增加，但增加范围不如500pg/mL与700pg/mL组。综上所述，认为500pg/mL褪黑素刺激组刺激3d时为外泌体最适浓度提取时间处理组。

表1褪黑素刺激后毛囊干细胞来源外泌体浓度(μg/mL)

实验例2褪黑素对毛囊干细胞来源外泌体的影响实验

1实验材料和试剂

1.1实验材料

本实验室提供的已分离纯化的内蒙古绒山羊毛囊干细胞。

1.2实验试剂

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone；表皮生长因子(EGF)、褪黑素(Melatonin)、Tris-base、Glycine购自Sigma；Luzindole、4-P-PDOT均购自ChemCruz；Insulin-Transferrin-Selenium(ITS)、0.25％胰蛋白酶均购自Gibco；双抗(PS)、5×蛋白上样缓冲液购自索莱宝；Total Exosome Isolation Reagent(from cell culture media)购自Invitrogen；RIPA裂解液、BCA Protein Assay Kit、SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒、SDS、脱脂奶粉购自上海生工；Mouse Anti-CD81 Antibody购自Novus；RabbitAnti-bete-actin antibody、Rabbit Anti-HSP70 antibody、Rabbit Anti-CD9 antibody均购自Bioss、HSP70；Western Blot二抗购自LI-COR公司。

2实验方法

由实验例1确定褪黑素的浓度为500pg/mL，褪黑素刺激细胞3d后提取的外泌体。

2.1褪黑素刺激毛囊干细胞

(1)细胞计数以调整细胞密度5×10⁵个/瓶，接入75cm²细胞培养瓶，加入干细胞培养液进行培养。

(2)当细胞长至50％时，加适量的有双抗的PBS溶液清洗2遍后弃掉，更换为无外泌体血清(胎牛血清120000×g过夜离心制备)培养液。

(3)将细胞随机分为两组，每组三个重复。一组加入无外泌体血清配制的普通干细胞培养基(含DMEM/F12、10％FBS(无外泌体)、1％PS、20ng/mL EGF、10μL/mL ITS)，另一组无外泌体血清配制的普通干细胞培养基中加入褪黑素(MT，500pg/mL)，即(含DMEM/F12、10％FBS(无外泌体)、1％PS、20ng/mL EGF、10μL/mL ITS、500pg/mL MT。

(4)培养3d后，分别收集两组细胞上清。

2.2.褪黑素刺激(受体阻断)刺激毛囊干细胞

选取褪黑素受体阻断剂500pg/mL褪黑素+500pg/mL Luzindole(Luz，MTI+MT2受体阻断)、500pg/mL褪黑素+500pg/mL 4-P-PDOT(4-P，MT2受体阻断)，刺激毛囊干细胞，方法同实验2.1。

2.3外泌体的提取

同实验例1的2.4.1。

2.4外泌体浓度的测定

同实验例1的2.4.2。

2.5毛囊干细胞来源外泌体的鉴定

2.5.1透射电子显微镜鉴定毛囊干细胞来源外泌体形态

取上述分离得到的外泌体悬液10μL，加入等体积PBS溶液稀释，然后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置1min后，用滤纸将多余液体轻轻吸去；用3％磷钨酸钠溶液(pH6.8)室温复染5min，双蒸水洗一遍，室温晾干2min；于透射电镜观察各视野区，随机选取个外泌体测量其直径并照相。

2.5.2Western blot蛋白印迹检测外泌体标志蛋白HSP70、CD9、CD81表达水平

(1)分离胶的配制：把配置SDS-PAGE胶的玻璃片和梳子洗净晾干后，安装到配胶板上，沿着玻璃边孔向孔中注入去离子水，等待20min检查是否漏水，如果漏水，重新安装。按照配方配制12％分离胶，迅速混匀，加到玻璃板的浓缩胶分隔处稍偏下，除去气泡后，向分离胶以上注入去离子水。

(2)浓缩胶的配制：30min后，待分离胶凝固，配置浓缩胶，迅速混匀后，倒出分离胶以上的去离子水，加入浓缩胶，立即插入梳子，待胶凝固。

(3)点样：胶板做好后，将胶板放入电泳槽中，向电泳槽中导入SDS电泳缓冲液至刻度线，拔出梳子，沿着壁向每个点样孔中点入样品。

(4)电泳：点样完成后，盖上盖子，先用120V的电压跑浓缩胶，改为80V跑分离胶。

(5)待蛋白跑至胶2/3以下时，关闭电泳仪，回收电泳缓冲液，进入下一步实验。

(6)转膜(湿转)：裁剪一张与胶同样大小的PVDF膜(胶的边缘可切去)，先放在甲醇中浸泡1-2min，用镊子取出后放入转膜缓冲液中浸泡1-2min，时间不宜过长，否则会影响蛋白条带的集中。打开转膜夹，按照负极(黑)、海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵、正极(白)顺序放置。将黑白夹子夹紧后，放入转膜装置中。在转膜槽中倒入已经预冷的转膜缓冲液，在转膜槽内的隔间放入大小合适的冰袋，盖上盖子，恒流350mA，90min。

(7)封闭：用1×TBS配制5％的脱脂奶粉，将膜轻轻取出，放入封闭液中，置于摇床，室温低速2h。

(8)一抗杂交：封闭完成后，回收封闭液，用TBST洗涤膜，洗涤四次，每次5min。按照说明书的要求，用TBST稀释一抗，气泡全部去除后，置于4℃过夜杂交。

(9)二抗杂交：回收一抗，用TBST洗涤膜，洗涤四次，每次5min。按照说明书的要求，用TBST稀释二抗，室温杂交1h。

(10)成像：二抗杂交完成后，弃去二抗稀释液，用TBST洗涤膜，洗涤四次，每次5min，用TBS洗涤一次，5min。用Odyssye红外激光扫描成像系统检测蛋白表达含量后进行分析。

3结果与分析

3.1毛囊干细胞的培养

毛囊干细胞解冻后于培养皿培养，显微镜下观察，隔天贴壁。有明显铺路石状生长的细胞即为毛囊干细胞；培养2d后细胞长至50％，更换为含褪黑素和褪黑素(受体阻断)Luzindole(Luz)和4-P-PDOT(4-P)的培养基。褪黑素刺激前，毛囊干细胞的形态均一，贴于皿底整体上呈现出铺路石状生长，在加入褪黑素和褪黑素(受体阻断)刺激后，处理组与对照组相比细胞形态并没有发生明显的变化，但是褪黑素刺激组细胞数量有所增多。

3.2外泌体浓度的测定

由蛋白标准曲线(图2)，计算各组处理后毛囊干细胞来源的外泌体浓度。对不同处理刺激对毛囊干细胞来源的外泌体浓度进行分析(见表2)，以细胞培养天数为横坐标，浓度为纵坐标，对结果进行直观的差异性分析(见图4)；其中，未加褪黑素处理组毛囊干细胞来源外泌体命名为CG-Exo，加入500pg/mL褪黑素处理组毛囊干细胞来源外泌体命名为MT-Exo，加入500pg/mL褪黑素(受体阻断剂Luzindole)处理组命名为Luz-Exo，加入500pg/mL褪黑素(受体阻断剂4-P-PDOT)处理组命名为4-P-Exo。结果显示，各组毛囊干细胞来源的外泌体浓度分别为939.33±6.61^a、1352.50±9.36^e、1053.33±8.57^c、958.83±8.49^a。相对于对照组，加入褪黑素后，外泌体浓度明显增加，可能是与细胞持续的增殖有关；而加入两组褪黑素受体阻断剂后，外泌体浓度又有所下降，可能是因为受体阻断剂阻断了褪黑素受体，使细胞又恢复了正常未刺激状态，所以4-P-Exo组与CG-Exo组差异很小，而Luz-Exo组与CG-Exo组略有差异，可能是因为两个受体阻断剂阻断的受体不同。Luz组略高于4-P处理组，Luz主要阻断的是褪黑素受体1和2，4-P主要阻断的是褪黑素受体2，在加入褪黑素膜受体阻断剂的情况下，两组都出现了外泌体分泌量下降的情况，所以推测，在本实验条件下，可能是通过褪黑素膜受体2调控实现的。也出现了同样的状况从而发挥的功能已不一致。总体来说，MT-Exo处理组与其他三组差异极显著，BCA定量结果初步认为加入褪黑素处理毛囊干细胞后，其来源的外泌体浓度有所增加。

表2各组毛囊干细胞来源外泌体浓度(μg/mL)

注：表中同一行数据肩著有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，相邻字母差异显著(p<0.05)，相间字母差异极显著(p<0.01)。

3.3外泌体的鉴定

3.3.1透射电镜鉴定毛囊干细胞来源外泌体形态

外泌体在电镜视野中大多是略小于100nm的，同时具有茶托样或凹半球样的结构，具有明显的膜，立体结构清晰，结果显示，毛囊干细胞与褪黑素刺激后毛囊干细胞来源外泌体均呈现典型的外泌体结构(见图5)。

3.3.2 Western blot蛋白印迹检测外泌体标志蛋白HSP70、CD9、CD81表达水平

HSP70、CD9、CD81为外泌体表面特异性标记。CG-Exo、MT-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo四组各重复上样3次，与CG-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo相比，MT-Exo蛋白表达量表现明显的上调，CG-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo各组之间蛋白表达量差异不明显，这与BCA蛋白定量结果相一致，说明抽提的外泌体有效(见图6)。其中，HSP70为热休克蛋白，其表达丰度最好，CD9和CD81也都有所表达，CD81条带呈弥散状，可能是与样品种属有关，不同种属之间表达蛋白的能力不同。以β-actin为内参，对western blot进行灰度分析，结果显示与图片表观一致，与CG-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo相比，MT-Exo蛋白表达量增加，符合BCA结果判断。

实验例3毛囊干细胞来源外泌体对受体细胞的作用实验

1实验材料和试剂

1.1实验材料

内蒙古白绒山羊P5代毛囊干细胞来源外泌体、毛囊干细胞、毛乳头细胞。

1.2实验试剂

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone；表皮生长因子(EGF)、褪黑素(Melatonin)、PKH67、结晶紫均购自Sigma；Luzindole、4-P-PDOT均购自ChemCruz；Insulin-Transferrin-Selenium(ITS)、0.25％胰蛋白酶均购自Gibco；双抗(PS)、4％多聚甲醛、Triton X100、DAPI购自索莱宝；Total Exosome Isolation Reagent(from cell culturemedia)购自Invitrogen；BCA Protein Assay Kit、BSA均购自上海生工；RNAiso Plus、反转录试剂盒、PCR Taq、2×SYBR Premix Ex Taq均购自TAKARA。

2实验方法

2.1毛囊干细胞和毛乳头细胞摄取外泌体

2.1.1 PKH67标记外泌体

PKH67可与细胞膜的脂质双分子层稳定结合，是一种绿色荧光细胞标记试剂染料，常常被用于标记含有脂质双分子层膜的外泌体。方法具体如下：

(1)外泌体用1mL试剂盒中Diluent C稀释液重悬；

(2)取4μL PKH67染液,加入1mL试剂盒中Diluent C稀释液稀释；

(3)上述(1)液与(2)液均匀混合，室温孵育2～5min，时常轻轻颠倒离心管，使液体充分混匀；

(4)加入等量1％BSA孵育1min，终止染色反应；

(5)100000×g，4℃，离心70min，去上清；

(6)PBS重悬外泌体沉淀。

2.1.2荧光显微镜观察毛囊干细胞和毛乳头细胞对外泌体的摄入

(1)将P5代毛囊干细胞和毛乳头细胞接入铺有22×22mm细胞爬片的12孔板中；

(2)待细胞贴壁后，加入带有PHK67染料标记的毛囊干细胞细胞来源外泌体，共孵育12h；

(3)12h后，PBS清洗细胞3遍；

(4)4％的多聚甲醛固定细胞30min；

(5)PBS清洗3遍，每次3min；

(6)用1μg/mL的DAPI室温染细胞核15min；

(7)PBS清洗3遍，每次3min，去除多余染料；

(8)最后将上述处理完毕的细胞置于载玻片上封片，荧光显微镜分析毛囊干细胞和毛乳头细胞对外泌体的摄入情况。

2.2毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞和毛乳头细胞增殖的影响

细胞计数以调整细胞密度2000个/孔，接入96孔板，毛囊干细胞加入干细胞培养液，毛乳头细胞加入毛乳头细胞培养液。细胞贴壁后换液，将培养液的血清换为无外泌体血清(血清120000×g过夜离心制备)。实验分为对照组和外泌体处理组，各组加入细胞培养液，其中外泌体处理组分为CG-Exo、MT-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo四种外泌体处理，各外泌体处理组设置100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL三个浓度梯度。每个浓度设置3个复孔，每孔总体积为150μL。分别在加入外泌体1-4天时采用MTT法测试受体细胞增殖活性情况。

2.3毛囊干细胞来源外泌体对受体细胞迁移的影响

无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁴个/孔。实验分为对照组和外泌体处理组，外泌体处理组分为CG-Exo、MT-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo四种外泌体处理，各外泌体处理组设置100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL三个浓度梯度。迁移实验采用corning公司transwell小室，具体方法如下：

(1)Transwell上室接种200μL细胞悬液，对照组下室加入无外泌体血清培养基500μL和PBS，实验组下室加入无外泌体血清培养基500μL和各组不同浓度外泌体；(2)48h(毛乳头细胞为24h)后终止培养，弃掉培养基，用无菌棉签轻轻拭去上室残留细胞；(3)PBS轻轻清洗细胞；4％多聚甲醛固定20min，弃去固定液；蒸馏水清洗2次，1％结晶紫染色20min；弃去染液，蒸馏水清洗2次，于倒置相差显微镜下观察，每组取6个随机视野计数跨膜迁移细胞，取均值，实验重复三次。

2.4毛囊干细胞来源外泌体对受体细胞毛囊发育相关基因的影响

按照实验2.3的分组，将受体细胞接入24孔板，5％CO₂饱和湿度培养箱培养，分别在加入外泌体1天、3天、5天、7天、14天、21天时提取各处理组细胞的总RNA，用来检测受体细胞发育过程中各基因的的表达量。

2.4.1受体细胞总RNA的提取与鉴定

RNAiso Plus裂解各组处理后的受体细胞，然后提取总RNA，测定RNA浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性鉴定。

2.4.2 RT-PCR引物设计与合成

根据GenBank中所公布的山羊基因序列，利用Priemer 5.0软件设计引物。

2.4.3 RT-PCR扩增

2.4.4相对定量PCR检测基因不同组间的表达

2.5实验数据的统计分析

基因表达丰度采用目的基因与内标基因的(1+E)^-△△Ct表示，其中E为扩增效率，当目的基因和持家基因扩增效率接近100％时用2^-△△Ct表示。

3结果分析

3.1毛囊干细胞和毛乳头细胞摄取外泌体

将用细胞膜标记物PKH67标记的各组外泌体分别加入到受体细胞毛囊干细胞和毛乳头细胞中，共孵育15小时。共聚焦显微镜检测，结果各组外泌体均能被受体细胞毛囊干细胞和毛乳头细胞对外泌体的摄取，PKH67标记的外泌体(绿色)进入到受体细胞，并在受体细胞细胞核(蓝色)周围，说明各组外泌体均能被受体细胞吸收。

3.2毛囊干细胞来源外泌体对受体细胞增殖的影响

3.2.1毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞增殖的影响

毛囊干细胞中分别加入不同组处理的外泌体(CG-Exo、MT-Exo、Luz-Exo、4-P-Exo)，每组外泌体加入不同浓度(100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL)，对照组加入PBS，共培养1-4d，采用MTT法检测不同处理下对毛囊干细胞的体外增殖情况(图7)。结果显示，加入外泌体后，毛囊干细胞的增殖均有所增加，且随着浓度梯度的增加而显著增加。褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会极显著促进毛囊干细胞的增加。而Luz-Exo、4-P-Exo与CG-Exo的差异较小，因为加入褪黑素后褪黑素的受体又被阻断，这可能就趋近于未处理的毛囊干细胞。加入低浓度的外泌体时，对毛囊干细胞的增殖就会产生一定的影响(见表3)，高浓度外泌体对毛囊干细胞的增殖在3d后达到极显著的情况，可以看出，随着外泌体浓度的增加，外泌体促增殖能力强(见表4、表5)。综上所述，认为毛囊干细胞来源的外泌体能够促进其自身的增殖，而被褪黑素处理后的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛囊干细胞增殖的效果更明显。

表3 100μg/mL毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞增殖的影响

注：表中同一行数据肩著有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，相邻字母差异显著(p<0.05)，相间字母差异极显著(p<0.01)。

表4 300μg/mL毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞增殖的影响

注：表中同一行数据肩著有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，相邻字母差异显著(p<0.05)，相间字母差异极显著(p<0.01)。

表5 500μg/mL毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞增殖的影响

注：表中同一行数据肩著有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，相邻字母差异显著(p<0.05)，相间字母差异极显著(p<0.01)。

3.2.2毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头细胞增殖的影响

与各组外泌体加入毛囊干细胞相似，在加入外泌体后，毛乳头细胞的增殖均有所增加(见图8)。褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会极显著促进毛囊干细胞的增加。相同的，Luz-Exo、4-P-Exo与CG-Exo的差异较小。但是对于毛乳头细胞来说，在前2天时，相同天数内，加入同种外泌体不同的浓度似乎差异不大，尤其是在加入300μg/mL和500μg/mL浓度时，但总体来说，毛囊干细胞来源的外泌体能够促进毛乳头细胞增殖，而被褪黑素处理后的毛囊干细胞来源的外泌体促进毛乳头细胞增殖的效果更明显(见表6、表7、表8)。

表6 100μg/mL毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头细胞增殖的影响

注：表中同一行数据肩著有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，相邻字母差异显著(p<0.05)，相间字母差异极显著(p<0.01)。

表7 300μg/mL毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头细胞增殖的影响

注：表中同一行数据肩著有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，相邻字母差异显著(p<0.05)，相间字母差异极显著(p<0.01)。

表8 500μg/mL毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头细胞增殖的影响

注：表中同一行数据肩著有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，相邻字母差异显著(p<0.05)，相间字母差异极显著(p<0.01)。

3.3毛囊干细胞来源外泌体对受体细胞迁移的影响

3.3.1毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞迁移的影响

Transwell迁移实验结果示，与对照组相比，加入褪黑素刺激的组可促进毛囊干细胞的迁移(见图9)。当加入毛囊干细胞来源的外泌体时，细胞的迁移效果迅速增加。同时，褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会极显著促进毛囊干细胞的增加。

3.3.2毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头迁移的影响

与毛囊干细胞的迁移情况相似，加入褪黑素刺激的组相对于对照组来说，可促进毛乳头细胞的迁移(见图10)。同样的，毛囊干细胞来源的外泌体的迁移效果迅速增加，褪黑素处理后的毛囊干细胞来源外泌体MT-Exo相对于未处理毛囊干细胞来源的外泌体CG-Exo，和加入褪黑素(受体阻断)处理的外泌体Luz-Exo、4-P-Exo来说，会显著促进毛乳头细胞的增加。

3.3.3细胞总RNA的提取

采用RNAiso Plus提取对照组和实验组处理后的P5代毛囊干细胞和毛乳头细胞的总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示28S和18S带较清晰。说明RNA完整性较好，基本无明显降解，适用于进行后续实验。

3.4毛囊干细胞来源外泌体对受体细胞毛囊发育相关基因的影响

3.4.1毛囊干细胞来源外泌体对毛囊干细胞毛囊发育相关基因β1-整合素、SOX9、FGF5、β-catenin、KAP7、KAP8的影响

β1-整合素和SOX9都为干细胞特异性表达基因，在毛囊干细胞加入褪黑素和褪黑素处理过的外泌体后，0-5d时，细胞表达量逐渐增加，5d后干性基因表达降低。FGF5是羊毛抑制生长基因,主要调控毛囊周期性发育,在毛囊的生长过程中均有表达，在3d时，表达量达到最大，随后表达量降低。β-catenin作为Wnt信号通路的关键因子调控毛囊干细胞分化的外源性因素作用巨大。高度激活β-catenin可导致毛囊干细胞向毛囊细胞方向分化，缺少或者低强度激活β-catenin则促进其分化成为表皮方向细胞。在0-3d时，基因表达量逐渐增加，随后表达量降低，但7d后，基因表达量又继续增加，可能是干细胞分化为毛囊细胞后，β-catenin信号通路又继续作用。KAP7和KAP8为毛囊细胞标志基因，在0-7d时表达不明显，14d时表达量迅速增加，可见外泌体的加入促进了干细胞的分化(图11、图12)。

3.4.2毛囊干细胞来源外泌体对毛乳头细胞毛囊发育相关基因FGF5、β--catenin的影响

与毛囊干细胞类似，毛乳头细胞内FGF5表达量在3d时达到最大，随后表达量降低。β-catenin是作为Wnt信号通路的关键因子调控毛乳头细胞的生长，在1d时达到最大，随后表达量降低。

Claims (8)

1.毛囊干细胞来源的外泌体在促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化中的用途；所述毛囊干细胞来源的外泌体的制备方法包括：向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌得到外泌体。

2.毛囊干细胞来源的外泌体在促进毛囊干细胞增殖中的用途；所述毛囊干细胞来源的外泌体的制备方法包括：向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌得到外泌体。

3.毛囊干细胞来源的外泌体在促进毛乳头细胞增殖中的用途；所述毛囊干细胞来源的外泌体的制备方法包括：向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌得到外泌体。

4.一种促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化的方法，其特征在于，包括：向增殖的毛囊干细胞中加入毛囊干细胞来源的外泌体；所述毛囊干细胞来源的外泌体的制备方法包括：向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌得到外泌体。

5.一种促进毛囊干细胞分泌外泌体的方法，其特征在于，包括：用褪黑素刺激毛囊干细胞促进外泌体分泌。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所加入的褪黑素的浓度为100-700 pg/mL。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所加入的褪黑素的浓度为500 pg/mL。

8.一种促进毛乳头细胞增殖的方法，其特征在于，包括：向毛乳头细胞中加入毛囊干细胞分泌的外泌体促进毛乳头细胞增殖，其中，所述毛囊干细胞分泌的外泌体的制备方法包括，向毛囊干细胞中加入褪黑素促进毛囊干细胞分泌得到外泌体。

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