CN112111447B - 一种宫内膜采集装置及采集方法和宫内膜干细胞收获方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种宫内膜采集装置，该宫内膜采集装置包括顶端开口的杯体，杯体上设有截流膜，截流膜与杯体形成第一腔室，第一腔室内设有微载体，截流膜的孔径小于微载体的粒径；本发明提供的一种宫内膜采集方法能够解决现有技术中难以将采集到的经血中的宫内膜分离出来的问题，本发明提供的宫内膜采集装置和宫内膜采集方法能够显著提高经血中宫内膜的收获量，可收获大量的宫内膜干细胞。

Description

一种宫内膜采集装置及采集方法和宫内膜干细胞收获方法
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，特别涉及一种宫内膜采集装置及采集方法和宫内膜干细胞收获方法。
背景技术
子宫内膜干细胞是一类存在于子宫内膜基底层的成体干细胞，具有一般成体干细胞的自我更新，无限增殖和多向分化潜能，参与子宫内膜上皮和间充质细胞的周期性再生，在子宫内膜的动态再生修复中有至关重要的作用。
经血是血液和一些脱落的子宫内膜、子宫颈年夜等的混杂液体，2008年美国科学家Patel等发现从健康女性经血中可分离处子宫内膜干细胞，且由于经血来源丰富、收集过程无创、无伦理争论等优点，渴望从经血中分离更多的宫内膜，但是，现有的方法难以对经血中的宫内膜进行收集。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种宫内膜采集装置，该宫内膜采集装置包括顶端开口的杯体，杯体上设有截流膜，截流膜与杯体形成第一腔室，第一腔室内设有微载体，截流膜的孔径小于微载体的粒径。
其中，截流膜可以与杯体固定连接或活动连接，如先将截流膜贴在圆环上，再在圆环上设置卡件，在杯体上设置用于卡固卡件的卡孔，此时可在微载体吸附经血后，将截流膜从杯体上取下，将微载体到出，即可收集宫内膜；本发明中的微载体的粒径在200微米以上，截流膜的孔径200微米，优选100微米、50微米，以保证微载体不会从截流膜上流出。
进一步地，第一腔室连通有排放管，排放管上设有开关阀。
进一步地，排放管连通于杯体的底端。
通过设置排放管和开关阀，无需打开截流膜，可通过打开开关阀使微载体从排放管内排出，此时截流膜可以与杯体固定连接，如粘接。
进一步地，杯体由乳胶、医用硅胶或者热塑性塑料制成。
进一步地，微载体的粒径为200-500微米，截流膜的孔径为100微米或50微米，截流膜为微孔滤膜。
其中，微孔滤膜与杯体的连接方式可以是将微孔滤膜夹设于两个塑料材质的网状结构之间，再将两个网状结构热封于杯体内。
进一步地，截流膜与杯体还形成有第二腔室，第二腔室位于第一腔室上方。
通过设置第二腔室，使经血可以暂时存放于第二腔室内，缓慢地过滤。
进一步地，截流膜由四周到中间与杯体底部之间的距离逐渐减小。
进一步地，宫内膜采集方法包括以下步骤：
S1吸附：使用权利要求1的宫内膜采集装置吸附经血，微载体包括可降解微载体基质材料交联成的凝胶球芯、包被于球芯的吸附因子层、偶联于吸附因子上的DEAE；
S2保存：打开开关阀，将吸附有经血的微载体用滤网过滤、除去血液，再将微载体放置于保护液内。
其中，DEAE为纤维素，本发明研究发现，将微载体放置于杯体内，当经血流入杯体内时，经血中的水分将微载体溶胀，但体积不会发生很大改变，经血中的宫内膜干细胞与溶胀后的微载体结合，取出后将其过滤去除血液等杂质，再放入保护液内保存，即可获得宫内膜，当需要分离宫内膜干细胞时，可将保存于保护液中的微载体以及附着于微载体上的宫内膜通过EDTA消化下来，洗涤后再离心，即可得到宫内膜干细胞。
进一步地，保护液是将低氧保护剂、支原体抑制剂以及氨基糖苷类抗生素用浓度为20-45mg/ml的DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每毫升DMEM/F12培养基水溶液分别溶解低氧保护剂3-15mg、支原体抑制剂1-35mg以及氨基糖苷类抗生素100-500U。
其中，低氧保护剂为重量份数为5:1的氯化钴和乳酸钠的混合物，支原体抑制剂包括以下组分：富勒烯10-25重量份和喹诺酮4-10重量份，富勒烯为重量份数比为1.2-3:1的富勒烯C60和富勒烯C84的混合物，氨基糖苷类抗生素包括重量份数比为1:1.5:2的链霉素、妥布霉素和庆大霉素的混合物。
进一步地，微载体的制备方法为：
(1)制球：将浓度为1％-2％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5％-3％的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，纳米化海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为1:3-1:5；
(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次；
(3)包被：将浓度为10％-20％的吸附溶液和浓度为0.3％-1％的戊二醛溶液等比例混合均匀制得混合液，将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中反应，混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为1-3:1；
(4)洗涤：待包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤三次；
(5)中和：加入浓度为0.5％-2％的甘氨酸溶液反应，甘氨酸溶液的体积与步骤(3)的混合液体积相同；
(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤三次；
(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为1-3mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为0.5-2mol/L的DEAE-HCl溶液进行搅拌；海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:1-3:1-3；
(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液洗涤，每次洗涤均以300rpm的转速搅拌8min后放出洗涤液，所用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液与海藻酸钙微胶珠的体积比例均为1-3:1，制得湿润微载体；
(9)冻干：将步骤(8)所得到的微载体冻干得到微载体；
吸附溶液是将吸附因子用水溶解制得的。
进一步地，吸附因子包括质量比为1-2:1-2:5-10的壳聚糖、纤连蛋白和明胶；优选地，吸附因子包括质量比为1:1:5的壳聚糖、纤连蛋白和明胶。
进一步地，步骤(2)、步骤(4)和步骤(6)中至少一个的用无菌纯化水洗涤具体操作方法为：以50-300rpm的转速搅拌5-10min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为1-3:1。
进一步地，步骤(3)将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中反应的反应条件为：温度为20-60℃，搅拌速度为50-300rpm，时间为30min-2h。
进一步地，步骤(5)的反应条件如下：中和温度为40℃-60℃，搅拌速度为50-300rpm，中和时间为2-3h。
进一步地，步骤(7)两次搅拌的具体条件如下：搅拌速度为50-300rpm，搅拌温度为60-80℃，搅拌时间为0.5-2h。
进一步地，步骤(8)的洗涤方法如下：以50-300rpm的转速搅拌5-10min后弃洗涤液。
本发明还提供了一种宫内膜干细胞的获取方法，该方法是将放置于保护液中且附着有宫内膜的微载体加入离心管内，再加入EDTA消化5min，EDTA浸没微载体，消化后用0.9％的氯化钠溶液洗涤微载体，收集洗涤液，以1500rpm的速度离心5min，取沉淀，即得宫内膜细胞，将制得的宫内膜细胞进行培养，培养方法为：将细胞悬液按照1×106/cm2的密度接种到培养瓶中，放入37℃、5％CO2培养箱培养；12小时后进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。传代方法：吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2次，再加入消化液消化3min，消化液包括体积比为1:1的0.25％胰酶和0.04％EDTA；轻轻吹打细胞，使细胞脱离瓶底得到单细胞悬液；将单细胞悬液离心吹散，按1:8传代。
本发明还提供了一种宫内膜干细胞的获取方法，该获取方法是放置于保护液中且附着有宫内膜的微载体放入t25培养瓶中，加入培养基进行培养，细胞在微载体上长满后消化传代；每1g微载体对应5-10ml培养基，具体方法如下：
将1g载体以及其富集的细胞放入t25培养瓶中，将入5-10ML培养基进行培养，将装有载体的培养瓶放置于37℃、5％CO2培养箱培养。细胞通常在4-6天扩增8-10倍，长满载体。待细胞在微载体上长满后消化传代。
消化方法：吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗载体2次，再加入消化液消化3min，消化液包括体积比为1:1的0.25％胰酶和0.04％EDTA；轻轻晃动载体，使细胞脱离载体得到单细胞悬液；将单细胞悬液离心吹散，按1:8传代至新的载体。也可消化后收获、冻存细胞。
本方法可直接对吸附于微载体上的宫内膜进行培养，其培养效果与消化后再进行培养的效果无显著差异，操作方便。
本发明提供的一种宫内膜采集方法能够解决现有技术中难以将采集到的经血中的宫内膜分离出来的问题，本发明提供的宫内膜采集装置和宫内膜采集方法能够显著提高经血中宫内膜的收获量，可收获大量的宫内膜干细胞。
附图说明
图1.为实施例1的宫内膜采集装置的结构示意图；
图2.为实施例2的宫内膜采集装置的结构示意图；
图3.为实施例3的宫内膜采集装置的工作原理图；
图4.为实施3例宫内膜采集装置的工作原理图。
其中，1为杯体，2为排放管，3为开关阀，4为微载体，5为截流膜，6为管体，7为过滤网，8为保护液。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，示出了本实施例宫内膜采集装置的结构示意图，本示例中，该宫内膜采集装置包括顶端开口的杯体1，该杯体为圆柱状，乳胶材质，杯体1上设有截流膜5，截流膜5与杯体1形成第一腔室，第一腔室内设有微载体4，截流膜5的孔径小于微载体4的粒径，本示例中微载体的粒径大于200微米，截流膜为微孔滤膜，购自北京中西远大科技有限公司，孔径为100微米，该微孔滤膜夹设于两个塑料材质的网状结构之间，两个网状结构热封于杯体内侧壁；本实施例的杯体内设有1g微载体；在其他实施例中，也可以根据截流膜材质以及杯体的材质用其他固定连接或活动连接的方式将截流膜与杯体连接；
微载体的制备方法如下：
(1)制球：将5L浓度为1％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5％的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，纳米化海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为1:3；
(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次，洗涤方法是加入纯化水后以50rpm的转速搅拌5min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为1:1；
(3)包被：将10L浓度为10％的吸附溶液和10ml浓度为0.3％的戊二醛溶液等比例混合均匀制得混合液，将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中在温度为20℃、搅拌速度为50rpm的条件下反应30min，混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为1:1；
(4)洗涤：待包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤三次，洗涤方法是加入纯化水后以50rpm的转速搅拌5min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为1:1；
(5)中和：加入浓度为0.5％的甘氨酸溶液在温度为40℃、搅拌速度为50rpm的条件下中和2h，甘氨酸溶液的体积与步骤(3)的混合液体积相同；
(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤三次，洗涤方法是加入纯化水后以50rpm的转速搅拌5min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为1:1；
(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为1mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为0.5mol/L的DEAE-HCl溶液进行搅拌；海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:1:1；两次搅拌的具体条件均为：搅拌速度为50rpm，搅拌温度为60℃，搅拌时间为0.5h；
(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液洗涤，每次洗涤均以50rpm的转速搅拌5min后放出洗涤液，所用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液与海藻酸钙微胶珠的体积比例均为1:1，制得湿润微载体；
(9)冻干：将步骤(8)所得到的微载体冻干，用钴60γ射线辐射灭菌，辐照剂量为20KGy，制得微载体；
吸附溶液是将吸附因子用水溶解制得的，吸附因子包括质量比为1:2:8的壳聚糖、纤连蛋白和明胶；
本发明所有实施例和对照例中涉及的壳聚糖、纤连蛋白和明胶均购自美国Sigma公司，以下不再一一赘述。
实施例2
如图2所示，示出了本实施例宫内膜采集装置的结构示意图，与实施例1的区别在于，截流膜5由四周到中间与杯体1底部之间的距离逐渐减小，由于微载体吸附血液后会膨胀，因此如此设置，可以避免截流膜因微载体的膨胀而破裂。
实施例3
如图3所示，示出了本实施例宫内膜采集装置的结构示意图，与实施例1的区别在于，第一腔室连通有排放管2，排放管2上设有开关阀3，排放管2连通于杯体1的底端，该杯体为上宽下窄状，医用硅胶材质，本示例通过设置排放管和开关阀，无需打开截流膜，可以通过排放管收集吸附宫内膜细胞的微载体，使用方便。
实施例4
本实施例提供了一种宫内膜采集装置，其结构与实施例3相同，区别之处在于微载体的制备方法不同，本实施例的微载体的制备方法如下：
(1)制球：将5L浓度为1.5％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为1.5％的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，纳米化海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为1:4；
(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次，洗涤方法是加入纯化水后以175rpm的转速搅拌8min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为2:1；
(3)包被：将10L浓度为15％的吸附溶液和20mL浓度为0.6％的戊二醛溶液混合均匀制得混合液，将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中在温度为40℃、搅拌速度为175rpm的条件下反应1.5h，混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为2：1；
(4)洗涤：待包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤三次，洗涤方法是加入纯化水后以175rpm的转速搅拌8min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为2:1；
(5)中和：加入浓度为1.5％的甘氨酸溶液在温度为50℃、搅拌速度为175rpm的条件下中和2.5h，甘氨酸溶液的体积与步骤(3)的混合液体积相同；
(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤三次，洗涤方法是加入纯化水后以175rpm的转速搅拌8min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为2:1；
(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为2mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为1.5mol/L的DEAE-HCl溶液进行搅拌；海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:2:2；两次搅拌的具体条件如下：搅拌速度为150rpm，搅拌温度为70℃，搅拌时间为1.5h；
(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液洗涤，每次洗涤均以175rpm的转速搅拌8min后放出洗涤液，所用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液与海藻酸钙微胶珠的体积比例均为2：1，制得湿润微载体；
(9)冻干：将步骤(8)所得到的微载体冻干，用钴60γ射线辐射灭菌，辐照剂量为19KGy，制得微载体；
吸附溶液是将吸附因子用水溶解制得的，吸附因子包括质量比为1:1:5的壳聚糖、纤连蛋白和明胶。
实施例5
本实施例提供了一种宫内膜采集装置，其结构与实施例3相同，区别之处在于微载体的制备方法不同，本实施例的微载体的制备方法如下：
(1)制球：将5L浓度为2％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为3％的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，纳米化海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为1:5；
(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次，洗涤方法是加入纯化水后以300rpm的转速搅拌10min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为3:1；
(3)包被：将10L浓度为20％的吸附溶液和30mL浓度为1％的戊二醛溶液混合均匀制得混合液，将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中在温度为60℃、搅拌速度为300rpm的条件下反应2h，混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为3:1；
(4)洗涤：待包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤三次，洗涤方法是加入纯化水后以300rpm的转速搅拌10min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为3:1；
(5)中和：加入浓度为2％的甘氨酸溶液在温度为60℃、搅拌速度为300rpm的条件下中和3h，甘氨酸溶液的体积与步骤(3)的混合液体积相同；
(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤三次，洗涤方法是加入纯化水后以300rpm的转速搅拌10min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为3:1；
(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为3mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为2mol/L的DEAE-HCl溶液进行搅拌；海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:3:3；两次搅拌的具体条件如下：搅拌速度为300rpm，搅拌温度为80℃，搅拌时间为2h；
(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液洗涤，每次洗涤均以300rpm的转速搅拌8min后放出洗涤液，所用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液与海藻酸钙微胶珠的体积比例均为3：1，制得湿润微载体；
(9)冻干：将步骤(8)所得到的微载体冻干，用钴60γ射线辐射灭菌，辐照剂量为20KGy，制得微载体；
吸附溶液是将吸附因子用水溶解制得的，吸附因子包括质量比为2:1:10的壳聚糖、纤连蛋白和明胶。
实施例6
本实施例提供了一种宫内膜采集装置的采集方法，该宫内膜采集方法包括以下步骤：
S1吸附：使用宫内膜采集装置吸附经血；
S2保存：取管体6，在管体顶端放置过滤网7，将宫内膜采集装置的排放管对准管体开口处，打开开关阀，将吸附有经血的微载体用滤网过滤、除去血液，再将过滤网上方的微载体连通过滤网一起放置于保护液内，保护液没过微载体；
其中，保护液是将低氧保护剂、支原体抑制剂以及氨基糖苷类抗生素用浓度为20mg/ml的DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每毫升DMEM/F12培养基水溶液分别溶解低氧保护剂3mg、支原体抑制剂1mg以及氨基糖苷类抗生素100U。
其中，低氧保护剂由50g氯化钴和10g乳酸钠混合制成，支原体抑制剂包括以下组分：10g富勒烯和10g喹诺酮，富勒烯为7.5g富勒烯C60和2.5g富勒烯C84混合制得，氨基糖苷类抗生素包括1g的链霉素、1.5g妥布霉素和2g庆大霉素混合制得。
实施例7
本实施例提供了一种宫内膜采集装置的采集方法，如图4所示，该宫内膜采集方法包括以下步骤：6为管体，7为过滤网，8为保护液
S1吸附：使用宫内膜采集装置吸附经血；
S2保存：取管体6，在管体顶端放置过滤网7，将宫内膜采集装置的排放管对准管体开口处，打开开关阀，将吸附有经血的微载体用滤网过滤、除去血液，再将过滤网上方的微载体连通过滤网一起放置于保护液内，保护液没过微载体；
其中，保护液是将低氧保护剂、支原体抑制剂以及氨基糖苷类抗生素用浓度为32mg/ml的DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每毫升DMEM/F12培养基水溶液分别溶解低氧保护剂9mg、支原体抑制剂20mg以及氨基糖苷类抗生素300U。
其中，低氧保护剂由50g氯化钴和10g乳酸钠混合制成，支原体抑制剂包括以下组分：15g富勒烯和7g喹诺酮，富勒烯为11.25g富勒烯C60和3.75g富勒烯C84混合制得，氨基糖苷类抗生素包括1g的链霉素、1.5g妥布霉素和2g庆大霉素混合制得。
实施例8
本实施例提供了一种宫内膜采集装置的采集方法，该宫内膜采集方法包括以下步骤：
S1吸附：使用宫内膜采集装置吸附经血；
S2保存：取管体6，在管体顶端放置过滤网7，将宫内膜采集装置的排放管对准管体开口处，打开开关阀，将吸附有经血的微载体用滤网过滤、除去血液，再将过滤网上方的微载体连通过滤网一起放置于保护液内，保护液没过微载体；
其中，保护液是将低氧保护剂、支原体抑制剂以及氨基糖苷类抗生素用浓度为45mg/ml的DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每毫升DMEM/F12培养基水溶液分别溶解低氧保护剂15mg、支原体抑制剂35mg以及氨基糖苷类抗生素500U。
其中，低氧保护剂由50g氯化钴和10g乳酸钠混合制成，支原体抑制剂包括以下组分：25g富勒烯和4g喹诺酮，富勒烯为18.75g富勒烯C60和6.25g富勒烯C84混合制得，氨基糖苷类抗生素包括1g的链霉素、1.5g妥布霉素和2g庆大霉素混合制得。
实施例9
本实施例提供了一种宫内膜干细胞的获取方法，该方法是将放置于保护液中且附着有宫内膜的微载体加入离心管内，再加入EDTA消化5min，EDTA浸没微载体，消化后用0.9％的氯化钠溶液洗涤微载体，收集洗涤液，以1500rpm的速度离心5min，取沉淀，即得宫内膜细胞，将制得的宫内膜细胞进行培养，培养方法为：将细胞悬液按照1×106/cm2的密度接种到培养瓶中，放入37℃、5％CO2培养箱培养；12小时后进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。传代方法：吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2次，再加入消化液消化3min，消化液包括体积比为1:1的0.25％胰酶和0.04％EDTA；轻轻吹打细胞，使细胞脱离瓶底得到单细胞悬液；将单细胞悬液离心吹散，按1:8传代；培养基成分为：DMEM/F12(Hyclone)；人纤连蛋白(25μg/ml)；碱性成纤维细胞生长因子(10ng/ml)；人表皮细胞生长因子(15ng/ml)；1％ITS(insulin-transferrin-selenium)(Gibco)；人血白蛋白(5％)；1％NEAA(Gibco)；氢化考的松(0.1μmol/L)、0.1％β－巯基乙醇(Gibco)。
实施例10
本实施例提供了一种宫内膜干细胞的获取方法，该获取方法是放置于保护液中且附着有宫内膜的微载体放入t25培养瓶中，加入培养基进行培养，细胞在微载体上长满后消化传代；每1g微载体对应10ml培养基；
具体如下：将1g载体以及其富集的细胞放入t25培养瓶中，将入10ML培养基进行培养，将装有载体的培养瓶放置于37℃、5％CO2培养箱培养，待细胞在微载体上长满后消化传代。
消化方法：吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗载体2次，再加入消化液消化3min，消化液包括体积比为1:1的0.25％胰酶和0.04％EDTA；轻轻晃动载体，使细胞脱离载体得到单细胞悬液；将单细胞悬液离心吹散，按1:8传代至新的载体；
培养基成分为：DMEM/F12(Hyclone)；人纤连蛋白(25μg/ml)；碱性成纤维细胞生长因子(10ng/ml)；人表皮细胞生长因子(15ng/ml)；1％ITS(insulin-transferrin-selenium)(Gibco)；人血白蛋白(5％)；1％NEAA(Gibco)；氢化考的松(0.1μmol/L)、0.1％β－巯基乙醇(Gibco)。
对照例1
本对例提供了一种宫内膜采集装置，该方法与实施例4的区别之处在于，将浓度为15％的吸附溶液用15％的明胶溶液替换，该明胶溶液是将明胶用水溶解制得。
对照例2
本对例提供了一种宫内膜采集装置，该方法与实施例4的区别之处在于，将浓度为15％的吸附溶液用15％的明胶溶液替换，该明胶溶液是将明胶用水溶解制得。
对照例3
本对例提供了一种宫内膜采集装置，该方法与实施例4的区别之处在于，将浓度为15％的吸附溶液用15％的明胶溶液替换，该明胶溶液是将明胶用水溶解制得。
试验例1
经血采集：取经过灭菌的月事杯，经咨询同意后，根据经血采集套装说明书收集一个健康女性的经血样本共60ml，用0.9％的氯化钠溶液稀释至210ml，等分为21份，每份10ml，放置于10ml的试管内，取实施例3-5和对照例1-3的宫内膜采集装置，实施例5组取6个，剩余每组取3个，共21个，将经血稀释液分别倒入实施例3-5和对照例1-3的杯体内，至各组杯体内的微载体将经血稀释液全部吸附后取出，实施例3-4和对照例1-3按照实施例10的方法进行培养，实施例5的6个平行样分为A组和B组，A组按照实施例9的方法进行获取，B组按照实施例10的方法进行获取，分别测定培养后的收获细胞数和培养后的细胞增殖倍数，结果见表1.
表1.通过各组方法采集、分离的细胞数和培养后细胞的增殖倍数.
Figure BDA0002699295230000171
由表1可知，采用实施例3-5的宫内膜采集方法采集的细胞数显著高于对照例1-3，证明本发明提供的微载体通过改进包被步骤的成分，显著提高了微载体对宫内膜干细胞的吸附作用，且A组和B组的细胞数和细胞增殖倍数无显著差异，证明可以采用本发明提供的直接培养的方式培养宫内膜干细胞，无需消化，操作简单。
综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。

Claims (7)

1.一种宫内膜采集装置，其特征在于，所述宫内膜采集装置包括顶端开口的杯体（1），所述杯体（1）上设有截流膜（5），所述截流膜（5）与所述杯体（1）形成第一腔室，所述第一腔室内设有微载体（4），所述截流膜（5）的孔径小于所述微载体（4）的粒径；
所述微载体（4）的制备方法包括如下步骤：
（1）制球：将浓度为1%-2%的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5%-3%的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，所述纳米化海藻酸钠溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:3-1:5；
（2）洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次；
（3）包被：将浓度为10%-20%的吸附溶液和浓度为0.3%-1%的戊二醛溶液等比例混合均匀制得混合液，将所述海藻酸钙微胶珠浸泡在所述混合液中反应，所述混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为1-3:1；
（4）洗涤：待所述包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤三次；
（5）中和：加入浓度为0.5%-2%的甘氨酸溶液反应，所述甘氨酸溶液的体积与步骤（3）所述的混合液体积相同；
（6）洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤三次；
（7）偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为1-3mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为0.5-2mol/L的DEAE-HCl溶液进行搅拌；所述海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:1-3:1-3；
（8）洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液洗涤，每次洗涤均以300rpm的转速搅拌8min后放出洗涤液，所用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液与海藻酸钙微胶珠的体积比例均为1-3:1，制得湿润微载体；
（9）冻干：将步骤（8）所得到的微载体冻干得到微载体；
所述吸附溶液是将吸附因子用水溶解制得的；
所述吸附因子包括质量比为1-2:1-2:5-10的壳聚糖、纤连蛋白和明胶。
2.如权利要求1所述的宫内膜采集装置，其特征在于，所述第一腔室连通有排放管（2），所述排放管（2）上设有开关阀（3）。
3.如权利要求2所述的宫内膜采集装置，其特征在于，所述排放管（2）连通于所述杯体（1）的底端。
4.如权利要求1所述的宫内膜采集装置，其特征在于，所述杯体（1）由乳胶、医用硅胶或者热塑性塑料制成，所述微载体的粒径为200-500微米，所述截流膜（5）的孔径为100微米或50微米，所述截流膜（5）为微孔滤膜。
5.如权利要求1所述的宫内膜采集装置，其特征在于，所述截流膜（5）由四周到中间与所述杯体（1）底部之间的距离逐渐减小。
6.如权利要求1所述的宫内膜采集装置，其特征在于，所述截流膜（5）与所述杯体（1）还形成有第二腔室，所述第二腔室位于所述第一腔室上方。
7.一种宫内膜采集装置的采集方法，其特征在于，所述宫内膜采集方法包括以下步骤：
S1吸附：使用权利要求1所述的宫内膜采集装置吸附经血，所述微载体包括可降解微载体基质材料交联成的凝胶球芯、包被于所述球芯的吸附因子层、偶联于所述吸附因子上的DEAE；
S2保存：打开开关阀，将吸附有经血的微载体用滤网过滤、除去血液，再将微载体放置于保护液内；
所述保护液是将低氧保护剂、支原体抑制剂以及氨基糖苷类抗生素用浓度为20-45mg/ml的DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂3-15mg、所述支原体抑制剂1-35mg以及氨基糖苷类抗生素100-500U。
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