CN105296458A

CN105296458A - 一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法

Info

Publication number: CN105296458A
Application number: CN201510858567.7A
Authority: CN
Inventors: 李晓凤; 雷发玲; 辛璇; 赵光磊; 吴晖; 余以刚; 唐诗潮
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: CN105296458B

Abstract

本发明公开了一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，该方法是以海藻酸钠和聚乙烯醇（PVA）为基体，与施氏假单胞菌菌体的生理盐水悬浮液混合，混匀后注入CaCl₂溶液中，固化得到。本发明所述的施氏假单胞菌细胞固定化方法工艺简单，固定化细胞颗粒机械强度高，弹性好，水解活性高，在反应体系中耐受性强。本发明方法得到一种新型的具有高效水解活力的固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

Description

一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术应用领域，具体涉及一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法。

背景技术

固定化细胞技术是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，是在固定化酶的基础上发展起来的新技术。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。通过各种方法将细胞和水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。

与游离的细胞相比，固定化的细胞具有显著的优点：1）固定化可以提高菌体的稳定性；2）固定化细胞易于分离进而简化产物的分离纯化；3）可以获得更高的细胞浓度；4）细胞的种类多种多样，大小和特性各不相同，故此细胞固定化的方法有很多种，固定化的方法主要有吸附法、包埋法、交联法。吸附法是利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法，用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。包埋法是将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。交联法是依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶，常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。

发明内容

本发明目的在于进一步优化现有技术，提供一种高效水解活力施氏假单胞菌细胞的固定化方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，包括以下步骤：

（1）施氏假单胞菌经活化培养、发酵培养得到菌液，菌液离心分离得菌体，菌体干燥备用；

（2）将步骤（1）得到的菌体接入经高压灭菌冷却的海藻酸钠与PVA的混合溶液中，混匀后注入搅拌的饱和硼酸-CaCl₂溶液中固定化，过滤得到小珠后用蒸馏水洗涤，再经冷冻干燥制得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

进一步地，步骤（1）所述施氏假单胞菌为PseudomonasstutzeriGIM1.273，购自广东省微生物研究所。

进一步地，步骤（1）所述发酵培养的培养基中各成分的质量体积分数为：葡萄糖0.1%~5%，酵母浸膏0.1%~5%，(NH₄)₂SO₄0.2%~3%g，K₂HPO₄0.02%~1%g，MgSO₄·7H₂O0.002%~0.2%，其余成分为水；培养基中初始pH值为6.0~8.0。

进一步地，步骤（1）所述发酵培养条件为温度20℃~40℃，转速120~200r/min，震荡培养0.5d~3d。

进一步地，所述细胞固定化采用包埋法-交联法联合使用的方法。

进一步地，步骤（2）所述的海藻酸钠与PVA在混合溶液中的质量体积分数分别为0.5%~8%与0%~12%。

进一步地，步骤（2）所述的海藻酸钠与PVA的混合溶液为固定化载体，其中固定化载体与施氏假单胞菌干重比为（50~250）:1。

进一步地，步骤（2）所述的饱和硼酸-CaCl₂溶液为交联剂，所述交联剂中CaCl₂浓度为0.05mol/L~1.0mol/L，硼酸为饱和硼酸溶液。

进一步地，步骤（2）所述固定化的温度为0℃~10℃，固定化的时间为0.5h~24h。

进一步优化地，本发明的目的通过以下技术方案实现：

（1）施氏假单胞菌的获取：将施氏假单胞菌活化后接种至诱导培养基中，接种量为1%~10%（v/v），培养温度为25℃~40℃，转速为120~200rpm，培养时间为12h~72h，高速冷冻离心分离得到菌体，离心温度为0℃~12℃，转速为8000rpm~13000rpm，经真空冷冻干燥6~48h，悬浮于生理盐水中；

（2）配制海藻酸钠与PVA的混合溶液，并进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件是121℃，10~30min，冷却备用；

（3）将步骤（1）所得菌悬液加入步骤（2）所得的混合溶液中，涡旋振荡混匀，得混合物；

（4）用注射器将步骤（3）得到的混合物匀速注入硼酸-CaCl₂溶液中，0℃~4℃下固定化0.5h~24h，过滤干燥制得施氏假单胞菌固定化细胞；

进一步地，步骤（1）所述的施氏假单胞菌活化培养的具体操作为：从试管保存的菌种中挑1~2环至50~200mL营养肉汤培养基中震荡培养，培养温度为25~40℃，培养时间为6h~48h；

进一步地，步骤（1）所述的诱导培养基为葡萄糖0.1%~5%（w/v，下同），酵母浸膏0.1%~5%，(NH₄)₂SO₄0.2%~3%g，K₂HPO₄0.02%~1%g，MgSO₄·7H₂O0.002%~0.2%，其余成分为水；初始pH值6.0~8.0，培养温度为25~40℃，培养时间为6h~48h；

进一步地，步骤（2）所述的海藻酸钠与PVA的混合溶液为固定化载体，其中各物质的质量体积分数分别为：海藻酸钠0.5%~8%、PVA0%~12%；

进一步地，步骤（3）的固定化载体与菌体干重比为（50~250）:1；

进一步地，步骤（4）所述的硼酸-CaCl2溶液为饱和硼酸和0.05~1.0mol/LCaCl₂溶液；

进一步地，步骤（4）所述的固定化过程中需慢速搅拌硼酸-CaCl₂溶液；

进一步地，步骤（4）所述的干燥方法为真空冷冻干燥，干燥时间为6h~48h。

本发明具有以下的优点：

1、本发明制备固定化细胞生物制剂的方法简便，联合采用了包埋法和交联法，细胞不易渗透，并且传质性能好，同时增加了机械强度。

2、本发明制备的固定化细胞具有处理效率高、水解活性高、稳定性强、易于分离回收循环利用等优点。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1

将PseudomonasstutzeriGIM1.273（购自广东省微生物研究所）种子液接种到发酵培养基中，接种量为1%（v/v），35℃，150rpm条件下培养24h，在10℃下以8000rpm离心10min后得到所需菌体，真空冷冻干燥24h。固定化载体为100mL海藻酸钠和PVA的混合溶液，其中海藻酸钠的质量体积分数为2%，PVA的质量体积分数为5%，固定化载体经高压蒸汽灭菌后冷却至室温，按固定化载体：施氏假单胞菌干重=100:1加入菌粉，涡旋振荡混匀后用注射器匀速注入200mLCaCl₂浓度为0.3mol/L的饱和硼酸-CaCl₂溶液中，4℃固定化6h，得到的小珠经100目滤布过滤后，用蒸馏水洗去表面未固定的细胞和Ca²⁺，干燥，得到浅黄色小珠，为固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

菌种培养方法：种子培养基，营养肉汤；发酵液培养基（w/v）为1%葡萄糖，1%酵母浸膏，1.2%(NH₄)₂SO₄，0.1%K₂HPO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，其余成分为水；pH为7.0±0.1。

采用以下方法测定固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解活力，包括以下操作：在10mL反应瓶中加入0.6mL磷酸缓冲盐溶液(PBS,50mM,pH8.0），0.1mL溶于异丙醇的p-NPP溶液，混合均匀，再置于40℃，180rpm预热5min，加入50mg上述所得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂，40℃，180rpm反应10min，立即加入Na₂CO₃溶液终止反应，用酶标仪测A₄₀₅，该吸光度代入标准曲线方程后，可计算出待测样品中的水解活力，单位为U/mg。

按照上述的方法检测固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解活力，同时检测市面买的固定化酶Novozyme435的水解活力。最终检测到固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解酶活为4.23U/mg，Novozyme435的水解活力为2.44U/mg。

实施例2

将PseudomonasstutzeriGIM1.273（购自广东省微生物研究所）种子液接种到发酵培养基中，接种量为4%（v/v），发酵液培养基（w/v）为5%葡萄糖，5%酵母浸膏，3%(NH₄)₂SO₄,0.08%K₂HPO₄,0.1%MgSO₄·7H₂O，其余成分为水；pH为8.0±0.1。25℃，150rpm条件下培养60h，在4℃下以10000rpm离心10min后得到菌体，真空冷冻干燥12h，悬浮于生理盐水中。

本实施例固定化载体灭菌处理的具体步骤与实施例1相同，不同之处在于，本实施例海藻酸钠的质量体积分数不同，以说明海藻酸钠的质量体积分数对固定化细胞水解活力的影响。具体操作如下，按上述要求完成施氏假单胞菌的收集及菌悬液的制备后，配制100mLPVA质量体积分数为2%的混合溶液，按固定化载体：施氏假单胞菌干重=100:1加入菌粉，再分别配制海藻酸钠不同质量体积浓度（0.5%~8%）的海藻酸钠与PVA的混合溶液，10℃下在200mL1.2mol/L的饱和硼酸-CaCl₂溶液中固定化2h，其他的固定化步骤按实施例1进行，制得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

根据实施例1所述的方法在405nm下检测施氏假单胞菌固定化细胞的水解活力，当海藻酸钠与PVA的混合溶液中海藻酸钠的质量体积分数为3%时，固定化细胞的水解活力为4.43U/mg。

实施例3

将PseudomonasstutzeriGIM1.273（购自广东省微生物研究所）种子液接种到发酵培养基中，接种量为2%（v/v），发酵液培养基（w/v）为0.2%葡萄糖，0.5%酵母浸膏，1%(NH₄)₂SO₄，0.8%K₂HPO₄,0.15%MgSO₄·7H₂O，其余成分为水；pH为8.0±0.1。25℃，200rpm条件下培养48h，在4℃下以10000rpm离心10min后得到菌体，真空冷冻干燥24h，悬浮于生理盐水中。

本实施例固定化载体的灭菌处理的具体步骤与实施例1相同，不同之处在于，本实施例采用的PVA的质量体积分数不同，以说明PVA的配比对固定化细胞水解活力的影响。具体操作如下，按实施例1完成施氏假单胞菌的收集及菌悬液的制备后，配制100mL海藻酸钠质量体积分数为5%的海藻酸钠与PVA的混合溶液，200mLCaCl₂浓度为0.2mol/L的饱和硼酸-CaCl₂溶液，再分别配制PVA不同质量体积浓度（0%~12%）的海藻酸钠与PVA的混合溶液，4℃条件下固定4h，其他的固定化步骤按实施例1进行，制得实验所需固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

将上述固定化细胞按照实施例1所述的方法在405nm下检测固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解活力，当PVA的质量分数为5%，固定化细胞的水解活力为4.51U/mg。

实施例4

将PseudomonasstutzeriGIM1.273（购自广东省微生物研究所）种子液接种到发酵培养基中，接种量为5%（v/v），发酵液培养基（w/v）为0.2%葡萄糖，0.5%酵母浸膏，1%(NH₄)₂SO₄,0.8%K₂HPO₄,0.15%MgSO₄·7H₂O，其余成分为水；pH为8.0±0.1。40℃，80rpm条件下培养36h，在4℃下以10000rpm离心10min后得到菌体，真空冷冻干燥24h，悬浮于生理盐水中。

本实施例固定化载体的灭菌处理的具体步骤与实施例1相同，不同之处在于，本实施例固定化时饱和硼酸-CaCl₂溶液中CaCl₂的浓度为0.05~1.0mol/L，以确定CaCl₂的浓度对固定化细胞水解活力的影响。具体操作如下，按实施例1完成施氏假单胞菌的收集及菌悬液的制备后，配制100mL混合载体溶液，其中海藻酸钠和PVA的质量体积分数分别为1%和8%，固定化载体/催化剂干重比为50:1，0℃条件下固定8h其他的固定化步骤按实施例1进行，制得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

按实施例1所述方法测定固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解活力，当CaCl₂的浓度为0.3mol/L，施氏假单胞菌固定化细胞的水解活力为4.01U/mg。

实施例5

将PseudomonasstutzeriGIM1.273（购自广东省微生物研究所）接种到发酵培养基中，接种量为3%（v/v），发酵液培养基（w/v）为0.8%葡萄糖，0.5%酵母浸膏，0.1%(NH₄)₂SO₄,0.2%K₂HPO₄,0.009%MgSO₄·7H₂O，其余成分为水；pH为8.0±0.1。30℃，200rpm条件下培养72h，在4℃下以12000rpm离心5min后得到菌体，真空冷冻干燥36h，悬浮于生理盐水中。

本实施例固定化载体的灭菌处理的具体步骤与实施例1相同，不同之处在于，本实施例固定化载体与施氏假单胞菌干重比为（50~250）：1，以确定固定化载体与催化剂的比例对固定化细胞水解活力的影响。具体操作如下，按实施例1完成施氏假单胞菌的收集及菌悬液的制备后，配制100mL海藻酸钠-PVA混合溶液，其中海藻酸钠和PVA的质量体积分数分别为3%和3%，200mLCaCl₂的浓度为1.0mol/L的饱和硼酸-CaCl₂溶液，按不同的固定化载体/催化剂比例加入施氏假单胞菌（50:1~250:1），固定化12h，其他的固定化步骤按实施例1进行，制得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

将上述固定化细胞按照实施例1所述的方法在405nm下检测固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解活力，综合考虑，固定化载体与施氏假单胞菌干重比为150:1，此时固定化细胞的水解活力为3.44U/mg。

实施例6

将PseudomonasstutzeriGIM1.273（购自广东省微生物研究所）种子液接种到发酵培养基中，接种量为4%（v/v），发酵液培养基（w/v）为1%葡萄糖，3%酵母浸膏，1%(NH₄)₂SO₄，0.4%K₂HPO₄，0.2%MgSO₄·7H₂O，其余成分为水；pH为7.0±0.1。37℃，150rpm条件下培养48h，在4℃下以8000rpm离心15min后得到菌体，真空冷冻干燥12h，悬浮于生理盐水中。

本实施例固定化载体的灭菌处理的具体步骤与实施例1相同，不同之处在于，本实施例采用的固定化时间不同，以确定固定化时间对固定化施氏假单胞菌细胞水解活力的影响。具体操作如下，按实施例1完成施氏假单胞菌的收集及菌悬液的制备后，配制100mL混合载体溶液，其中海藻酸钠和PVA的质量体积分数分别为3%和5%，200mLCaCl₂的浓度为0.5mol/L的饱和硼酸-CaCl₂溶液，固定化载体与施氏假单胞菌干重比为100:1，按实施例1方法进行固定化，固定化时间为0.5h~12h，制得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。

将上述固定化细胞按照实施例1所述的方法在405nm下检测固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解活力，当固定化时间为4h，此时固定化细胞的水解活力为4.32U/mg。

以上实施例表明，通过固定化方法的实施，可以获得具有更高水解活力的施氏假单胞菌固定化细胞，其具有更高的生产强度，而且具有方便回收、可重复利用的明显优势。

Claims

1.一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

施氏假单胞菌经活化培养、发酵培养得到菌液，菌液离心分离得菌体，菌体干燥备用；

2.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，步骤（1）所述施氏假单胞菌为PseudomonasstutzeriGIM1.273，购自广东省微生物研究所。

3.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，步骤（1）所述发酵培养的培养基中各成分的质量体积分数为：葡萄糖0.1%~5%，酵母浸膏0.1%~5%，(NH₄)₂SO₄0.2%~3%g，K₂HPO₄0.02%~1%g，MgSO₄·7H₂O0.002%~0.2%，其余成分为水；培养基中初始pH值为6.0~8.0。

4.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，步骤（1）所述发酵培养条件为温度20℃~40℃，转速120~200r/min，震荡培养0.5d~3d。

5.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，所述细胞固定化采用包埋法-交联法联合使用的方法。

6.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，步骤（2）所述的海藻酸钠与PVA在混合溶液中的质量体积分数分别为0.5%~8%与0%~12%。

7.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，步骤（2）所述的海藻酸钠与PVA的混合溶液为固定化载体，其中固定化载体与施氏假单胞菌干重比为（50~250）:1。

8.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，步骤（2）所述的饱和硼酸-CaCl₂溶液为交联剂，所述交联剂中CaCl₂浓度为0.05mol/L~1.0mol/L，硼酸为饱和硼酸溶液。

9.根据权利要求1所述的一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，步骤（2）所述固定化的温度为0℃~10℃，固定化的时间为0.5h~24h。