CN113637760A - 血浆游离dna甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法 - Google Patents

血浆游离dna甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及卵巢癌检测的技术领域，特别是涉及一种血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，其只需要受试者10mL的血液，在很大程度上减少良性患者接受不必要侵入性检测的比例，降低有创检测带来的感染风险和心理压力；包括取样测试步骤：第一步，收集10ml病人的静脉血，通过两步离心法收集到大约4‑5ml的血浆；第二步，用商用的Qiagen的提取试剂盒，从血浆中提取游离的cfDNA；第三步，通过Qubit和Labchip对提取的cfDNA进行质控；第四步，通过酶反应将cfDNA平段补齐,加接头；第五步，用甲基化特异的抗体富集含有甲基化的片段；第六步，将富集到的甲基化片段通过PCR扩增的方法，构建二代测序文库；第七步，以NovaS4测序仪,双端PE150的方式对构建好的文库进行测序。

Description

血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法
技术领域
本发明涉及卵巢癌检测的技术领域，特别是涉及一种血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法。
背景技术
2018年全球卵巢癌新发病人数近30万人，死亡人数约为18.5万人。卵巢癌的死亡率一直高居不下，其5年生存率在妇科肿瘤中最低，仅为46％，有15％的患者在确诊两个月内死亡，提高卵巢癌的生存率和患者的生存质量势在必行。如能在卵巢癌早期发现，其5年生存率则可达到92％。但目前在临床上没有可以有效用于卵巢癌早期发现的标志物。近几十年来，尽管治疗的技术和药物在不断的发展，卵巢癌的治疗效果并没有得到较大幅度的提升，手术的完全切除率仍是影响OS和PFS的唯一显著因素。这一方面是由于大部分卵巢癌，特别是占总卵巢癌约70％的高级别浆液腺癌，在癌症早期缺乏明显的症状，临床上大于75％的卵巢癌症患者初诊时就处于III-IV期，存在腹腔或远端转移，治疗效果不佳，5年生存率仅为29％；另一方面，在临床上缺乏可用于卵巢癌早期发现的生物标志物。英国的UKCTOCS trial和美国的PLCO trial利用CA125，经阴道超声或两者相结合分别对20.2万和7.8万女性进行了长期的普筛，最终发现利用该方式进行人群筛检并不能够降低卵巢癌的死亡率，反而会增加不必要的手术及可能的心理健康损害。其他蛋白类标志物如TP53，HE4，骨桥蛋白等等，也被研究用于早期卵巢癌的检测，但该类标志物或缺乏组织特异性，或缺乏癌症特异性，且蛋白类标志物在癌症早期水平较低，其有效性仍需要更多的研究验证。全基因组DNA甲基化的改变在癌变早期就可在癌组织中检测，该信号通过癌细胞的分泌、凋亡等途径进入血液循环，近年来血液中循环肿瘤DNA(ctDNA)的甲基化信号也被用于癌症早期诊断的研究。利用血液中循环肿瘤DNA的甲基化信号来进行癌症的无创检测以及早期检测在肺癌，肾癌，胰腺癌等其它癌种中已有研究，但在卵巢癌中仍缺乏相关的信息。直接从卵巢癌症组织筛选得到的少数DNA甲基化标志物也可在早期癌症患者血液中被检测到，但由于血液样本的复杂性，其在早期卵巢癌患者中灵敏度较低。从卵巢癌患者血浆游离循环核酸(cfDNA)中直接筛选可用于鉴别癌症患者的多位点高灵敏度和特异性的DNA甲基化生物标志物，将有助于卵巢癌的早期检出，从而提高患者的生存率与生存质量。
目前临床上用于卵巢癌早期检测的仍是CA125等蛋白指标的检测。正常卵巢表面上皮并不产生CA125，癌变之后，恶变的上皮会产生大量CA125，从而引起血液中CA125值升高，以35IU/ml为界限来辅助判断肿瘤良恶性。但由胚胎期体腔上皮发育而来的组织(卵巢表面上皮除外)基本都产生少量CA125，在患有非卵巢癌的其它肿瘤(如胰腺癌，胃癌等)，某些良性疾病(内异症，胰腺炎，腹膜炎等)或一些健康生理性状态(妊娠，经期，产后)都会有CA125值升高的现象，因此CA125蛋白指标并不适用于早期的卵巢癌的检出。
影像学的的检测手段，如经阴道超声等，可发现卵巢中较大的肿块，可判断是实性或是囊性，但仍需要活检来判断其良恶性，不易发现早期直径<1cm的实性肿瘤。
英国的UKCTOCS trial和美国的PLCO trial利用CA125，经阴道超声或两者相结合分别对20.2万和7.8万女性进行了长期的普筛，最终发现利用该方式进行人群筛检并不能够降低卵巢癌的死亡率，反而会增加不必要的手术及可能的心理健康损害，因此不建议对普通人群进行CA125和阴道超声的普筛。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种只需要受试者10mL的血液，在很大程度上减少良性患者接受不必要侵入性检测的比例，降低有创检测带来的感染风险和心理压力的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法。
本发明的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，包括取样测试步骤：
第一步，用EDTA抗凝管收集10ml病人的静脉血，通过两步离心法收集到大约4-5ml的血浆；
第二步，用商用的Qiagen的提取试剂盒，从血浆中提取游离的cfDNA；
第三步，通过Qubit和Labchip对提取的cfDNA进行质控；通过质控的样品继续进行下游的实验，没有通过质控的样品，暂定实验；
第四步，通过酶反应将cfDNA平段补齐,加接头；
第五步，用甲基化特异的抗体富集含有甲基化的片段；
第六步，将富集到的甲基化片段通过PCR扩增的方法，构建二代测序文库；
第七步，以NovaS4测序仪,双端PE150的方式对构建好的文库进行测序。
本发明的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，还包括质控分析步骤：
首先，得到下机的原始数据后，使用Trimmomatic去除接头序列，使用FastQC进行质控分析；
其次，采用Bowtie2比对软件，将clean data比对待参考基因组(hg19)上，并统计比对情况；根据比对结果进行下列质控分析：
1)血液中的cfDNA经过捕获后得到的DNA片段包含大部分单核小体片段和小部分双核小体片段；对DNA长度进行统计；
2)将BAM文件转化为BigWig文件，查看基因区(以及CpG岛)及其上下游的信号分布特征；
3)采用R包MEDIPS对BAM进行分析，查看MEDIP实验的质控结果；包括CG位点的富集程度，覆盖度，测序饱和度等。
本发明的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，还包括差异甲基化区域分析步骤：
首先，对每个样本，使用R包MEDIPS，将基因组按照300bp的无重复bins进行窗口划分，并计算每个bin上的reads count和rpkm值；
然后，将所有样本按照3：1分为训练集和测试集；
1)对训练集，我们使用DESeq进行差异分析，并提取差异最大的前300个DMRs(差异甲基化区域)；
2)使用R包glmnet，将训练集得到的top 300DMRs作为特征，对训练集样本的RPKM值进行线性拟合(elastic net模型)，预测测试集样本的甲基化分值，对卵巢癌晚期和健康样本的区分性能达到AUROC 0.9，灵敏度和特异性分别为76.92％和88.57％；对早期卵巢癌患者和健康人样本的区分性能达到，AUROC 0.89，灵敏度和特异性分别为66.67％和88.57％，高于CA125对这些样本的AUC(0.8)；对早期卵巢癌患者和良性患者样本的区分性能达到，AUROC 0.8,灵敏度为70％,特异性为86.30％，远高于CA125对这些样本的AUC(0.45)。
与现有技术相比本发明的有益效果为：该方法只需要受试者10mL的血液，通过检测其中cfDNA的甲基化信号，来辅助诊断患者是否患有卵巢癌；该技术的区分效果优于传统的CA125检测，特别是在良性样本和早期卵巢癌的区分上，准确性可以达到83.3％,可以在很大程度上减少良性患者接受不必要侵入性检测的比例，降低有创检测带来的感染风险和心理压力。
附图说明
图1是用Top300 DMRs区分晚期卵巢癌(OC晚期)和健康人的ROC曲线，和对应的灵敏度、特异性和准确率指标图；
图2是用Top300 DMRs区分早期卵巢癌(OC早期)和健康人的ROC曲线，对应的灵敏度、特异性和准确率指标，以及CA125在这些样本中ROC曲线图；
图3是用Top300 DMRs区分早期卵巢癌(OC早期)和良性样本(Benign)的ROC曲线，对应的灵敏度、特异性和准确率指标，以及CA125在这些样本中ROC曲线图
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如图1至图3所示，本发明的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，包括取样测试步骤：
第一步，用EDTA抗凝管收集10ml病人的静脉血，通过两步离心法收集到大约4-5ml的血浆；
第二步，用商用的Qiagen的提取试剂盒，从血浆中提取游离的cfDNA；
第三步，通过Qubit和Labchip对提取的cfDNA进行质控；通过质控的样品继续进行下游的实验，没有通过质控的样品，暂定实验；
第四步，通过酶反应将cfDNA平段补齐,加接头；
第五步，用甲基化特异的抗体富集含有甲基化的片段；
第六步，将富集到的甲基化片段通过PCR扩增的方法，构建二代测序文库；
第七步，以NovaS4测序仪,双端PE150的方式对构建好的文库进行测序；
该方法只需要受试者10mL的血液，通过检测其中cfDNA的甲基化信号，来辅助诊断患者是否患有卵巢癌；该技术的区分效果优于传统的CA125检测，特别是在良性样本和早期卵巢癌的区分上，准确性可以达到83.3％,可以在很大程度上减少良性患者接受不必要侵入性检测的比例，降低有创检测带来的感染风险和心理压力。
本发明的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，还包括质控分析步骤：
首先，得到下机的原始数据后，使用Trimmomatic去除接头序列，使用FastQC进行质控分析；
其次，采用Bowtie2比对软件，将clean data比对待参考基因组(hg19)上，并统计比对情况；根据比对结果进行下列质控分析：
1)血液中的cfDNA经过捕获后得到的DNA片段包含大部分单核小体片段和小部分双核小体片段；对DNA长度进行统计；
2)将BAM文件转化为BigWig文件，查看基因区(以及CpG岛)及其上下游的信号分布特征；
3)采用R包MEDIPS对BAM进行分析，查看MEDIP实验的质控结果；包括CG位点的富集程度，覆盖度，测序饱和度等；首次利用甲基化抗体结合二代测序技术构建了卵巢癌患者游离DNA(cfDNA)的甲基化图谱；发现了卵巢癌患者cfDNA中与健康人和良性患者之间特异的甲基化差异区域(DMRs)。
本发明的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，还包括差异甲基化区域分析步骤：
首先，对每个样本，使用R包MEDIPS，将基因组按照300bp的无重复bins进行窗口划分，并计算每个bin上的reads count和rpkm值；
然后，将所有样本按照3：1分为训练集和测试集；
1)对训练集，我们使用DESeq进行差异分析，并提取差异最大的前300个DMRs(差异甲基化区域)；
2)使用R包glmnet，将训练集得到的top 300DMRs作为特征，对训练集样本的RPKM值进行线性拟合(elastic net模型)，预测测试集样本的甲基化分值，对卵巢癌晚期和健康样本的区分性能达到AUROC 0.9，灵敏度和特异性分别为76.92％和88.57％；对早期卵巢癌患者和健康人样本的区分性能达到，AUROC 0.89，灵敏度和特异性分别为66.67％和88.57％，高于CA125对这些样本的AUC(0.8)；对早期卵巢癌患者和良性患者样本的区分性能达到，AUROC 0.8,灵敏度为70％,特异性为86.30％，远高于CA125对这些样本的AUC(0.45)；利用机器学习的方法，使用排名前三百的DMRs的甲基化信号进行模型训练，建立基于cfDNA甲基化信号的卵巢癌分类器；基于cfDNA甲基化的分离器可用于区分卵巢癌患者和健康人，也可以区分早期卵巢癌患者和良性患者，其表现都要优于CA125的区分效果。
本发明的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，其在工作时，只需要受试者10mL的血液，通过检测其中cfDNA的甲基化信号，来辅助诊断患者是否患有卵巢癌；该技术的区分效果优于传统的CA125检测，特别是在良性样本和早期卵巢癌的区分上，准确性可以达到83.3％,可以在很大程度上减少良性患者接受不必要侵入性检测的比例，降低有创检测带来的感染风险和心理压力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，其特征在于，包括取样测试步骤：
第一步，用EDTA抗凝管收集10ml病人的静脉血，通过两步离心法收集到大约4-5ml的血浆；
第二步，用商用的Qiagen的提取试剂盒，从血浆中提取游离的cfDNA；
第三步，通过Qubit和Labchip对提取的cfDNA进行质控；通过质控的样品继续进行下游的实验，没有通过质控的样品，暂定实验；
第四步，通过酶反应将cfDNA平段补齐,加接头；
第五步，用甲基化特异的抗体富集含有甲基化的片段；
第六步，将富集到的甲基化片段通过PCR扩增的方法，构建二代测序文库；
第七步，以NovaS4测序仪,双端PE150的方式对构建好的文库进行测序。
2.如权利要求1所述的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，其特征在于，还包括质控分析步骤：
首先，得到下机的原始数据后，使用Trimmomatic去除接头序列，使用FastQC进行质控分析；
其次，采用Bowtie2比对软件，将clean data比对待参考基因组(hg19)上，并统计比对情况；根据比对结果进行下列质控分析：
1)血液中的cfDNA经过捕获后得到的DNA片段包含大部分单核小体片段和小部分双核小体片段；对DNA长度进行统计；
2)将BAM文件转化为BigWig文件，查看基因区(以及CpG岛)及其上下游的信号分布特征；
3)采用R包MEDIPS对BAM进行分析，查看MEDIP实验的质控结果；包括CG位点的富集程度，覆盖度，测序饱和度等。
3.如权利要求2所述的血浆游离DNA甲基化检测辅助卵巢癌早期诊断的方法，其特征在于，还包括差异甲基化区域分析步骤：
首先，对每个样本，使用R包MEDIPS，将基因组按照300bp的无重复bins进行窗口划分，并计算每个bin上的reads count和rpkm值；
然后，将所有样本按照3：1分为训练集和测试集；
1)对训练集，我们使用DESeq进行差异分析，并提取差异最大的前300个DMRs(差异甲基化区域)；
2)使用R包glmnet，将训练集得到的top 300DMRs作为特征，对训练集样本的RPKM值进行线性拟合(elastic net模型)，预测测试集样本的甲基化分值，对卵巢癌晚期和健康样本的区分性能达到AUROC 0.9，灵敏度和特异性分别为76.92％和88.57％；对早期卵巢癌患者和健康人样本的区分性能达到，AUROC 0.89，灵敏度和特异性分别为66.67％和88.57％，高于CA125对这些样本的AUC(0.8)；对早期卵巢癌患者和良性患者样本的区分性能达到，AUROC 0.8,灵敏度为70％,特异性为86.30％，远高于CA125对这些样本的AUC(0.45)。
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