WO2022000065A4

WO2022000065A4 - Aptâmero modificado, sistema aptaimunológico, painel aptaimunológico, kit, método e uso no diagnóstico de câncer de próstata

Info

Publication number: WO2022000065A4
Application number: PCT/BR2021/050290
Authority: WO
Inventors: Vivian Alonso GOULART; Aline Gomes De SOUZA; Karina MARANGONI; Esther Campos FERNÁNDEZ; Emília Rezende VAZ; Luiz Ricardo Goulart Filho
Original assignee: Universidade Federal de Uberlândia; Imunoscan Engenharia Molecular Ltda
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2022-03-17
Also published as: WO2022000065A1; BR102020013625A2

Abstract

A presente invenção descreve novos aptâmeros modificados e um sistema aptaimunológico compreendendo ao menos um dos referidos aptâmeros modificados R4 e/ou D4 combinado com ao menos um anticorpo específico, painéis aptaimunológicos compreendendo o referido sistema, kit; método de diagnóstico ou prognóstico e seus usos para identificar biomarcadores do câncer de próstata em células tumorais circulantes de amostras biológicas. A partir da análise destes biomarcadores por citometria de fluxo, é possível discriminar pacientes com câncer de próstata de uma maneira superior ao antígeno prostático específico, que atualmente é o biomarcador padrão-ouro no câncer de próstata. Assim, o sistema aptaimunológico da presente invenção apresenta um menor índice de falsos positivos e falsos negativos, o que é útil na triagem, diagnóstico, prognóstico e monitoramento terapêutico do câncer de próstata para aprimorar seu manejo clínico.

Claims

REIVINDICAÇÕES MODIFICADAS Recebidas pela Secretaria Internacional no dia 31 Janeiro 2022 (31.01.2022)

1 . Aptâmero modi ficado caracterizado pelo fato de ser modi ficado com uma molécula de biotina acoplada na extremidade 5 ' e um nucleotideo monofos fato 2 ’ desoxitimidina invertido na extremidade 3 ' , compreendendo as SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2 .

2 . Sistema e painel aptaimunológico e seus respectivos controles para uso em um método de diagnóstico , prognóstico , predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata por meio da técnica de citometria de fluxo caracterizado pelo fato de que compreende :

- Painel de anticorpos 1 : EpCAM e anti-CD45 ; ou

- Painel de anticorpos 2 : CD44 e anti-CD133 ; combinado a qualquer um dos aptâmeros modi ficados das SEQ ID NO . 1 ou SEQ ID NO . 2 , e compreende a adição de um complexo ligante de biotina, mais particularmente a estreptavidina marcada com um fluorocromo ou os aptâmeros marcados diretamente com a adição de um f luorocromo na extremidade 5 ' .

3 . Sistema aptaimunológico , de acordo com a reivindicação 2 , caracterizado pelo fato de que os anticorpos também estão marcados com fluorocromos di ferentes , de acordo com os filtros do citômetro de fluxo .

FOLHA MODIFICADA (ARTIGO 19)

4 . Sistema aptaimunológico , de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 e 3 , caracterizado pelo fato de que o sistema aptaimunológico pode estar na forma de uma composição ou composição farmacêutica, ou pode compreender os seus elementos separados em mais de uma composição ou composições farmacêuticas , as quais serão combinadas de acordo com o uso desej ado .

5 . Painel aptaimunológico , de acordo com a reivindicação 2 , caracterizado pelo fato de que os respectivos controles compreendem : no painel 1 estreptavidina, isotipo de anti-EpCAM e isotipo de anti-CD45 marcados com os mesmos fluorocromos dos seus correspondentes ; e no painel 2 estreptavidina, isotipo de anti-CD44 e isotipo de anti-CD133 marcados com os mesmos fluorocromos dos seus correspondentes .

6 . Kit para detecção de células circulantes de câncer de próstata em amostra tecidual ou liquida de um paciente por meio de citometria de fluxo caracterizado pelo fato de que compreende o sistema e painel aptaimunológico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 5 e instruções de uso .

7 . Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6 , caracterizado pelo fato de que pode compreender ainda ao menos um tubo de coleta a vácuo com EDTA, tampão de lise de hemácias com cloreto de amónia com ou sem fixador celular,

FOLHA MODIFICADA (ARTIGO 19) tampão de bloqueio com plasma humano inativado de sangue tipo AB, tampão fos fato com albumina sérica bovina e azida básica como solução de lavagem e/ou corante de viabilidade com fluorescência di ferente dos usados nos painéis .

8 . Uso de painel e sistema aptaimunológico e kit para diagnóstico , prognóstico , predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata caracterizado pelo fato de que compreende etapas de processamento e análise de amostras de indivíduos humanos com o uso do sistema ou painel aptaimunológico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 5 ; ou uso do kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 e 7 , podendo a amostra ser uma biópsia tecidual ou liquida de um fluido corporal , mas preferivelmente em que a amostra se trata de sangue peri férico e compreende as etapas sequenciais de :

- isolar a camada de células mononucleares da amostra de sangue peri férico após sua centri fugação ou após outro método adequado de separação do anel leucocitário ;

- trans ferir a camada de células mononucleares para um tubo de citometria ;

- lisar as hemácias e em seguida lavar a suspensão celular resultante usando , respectivamente , um tampão de lise com ou sem fixador e uma solução de lavagem;

FOLHA MODIFICADA (ARTIGO 19) - bloquear as ligações inespecí ficas da porção Fc dos anticorpos usados nos painéis , pela incubação da suspensão celular com uma solução de bloqueio ;

- incubar separadamente a suspensão celular no tampão de bloqueio com os painéis aptaimunológicos e o corante de viabilidade e em seguida lavar com solução de lavagem;

- marcar indiretamente os aptâmeros com seu ligante estreptavidina e em seguida lavar com uma solução de lavagem; ler a fluorescência de leucócitos das amostras processadas , a partir da identi ficação dos mesmos por seu tamanho e granulosidade em um citômetro de fluxo ; analisar os dados da citometria obtidos para identi ficação de células tumorais circulantes ( CTCs ) da próstata .

9 . Uso de painel e sistema aptaimunológico e kit para diagnóstico , prognóstico , predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata, de acordo com a reivindicação 8 , caracterizado pelo fato de que a identi ficação de células tumorais circulantes ( CTCs ) da próstata compreende :

- selecionar os singl ets , dentre os singl ets selecionar as células vivas , e dentre as células vivas selecionar individualmente por histograma as marcações especi ficas de cada painel , segundo seus controles correspondentes ;

FOLHA MODIFICADA (ARTIGO 19) - no painel aptaimunológico 1 , selecionar as células com marcação negativa para CD45 e dentre elas , selecionar as células com marcação positiva para EpCAM e dentre estas selecionar as células com marcação positiva para os aptâmeros da SEQ ID NO . 1 ou da SEQ ID NO . 2 .

- no painel aptaimunológico 2 , selecionar as células com marcação positiva para CD133 e dentre elas , selecionar as células com marcação positiva para CD44 e de entre estas selecionar as células com marcação positiva para os aptâmeros da SEQ ID NO . 1 ou SEQ ID NO . 2 .

10 . Uso de painel e sistema aptaimunológico e kit para diagnóstico , prognóstico , predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata, de acordo com a reivindicação 8 , caracterizado pelo fato de que , durante o processamento das amostras , as CTCs podem ser submetidas a outros meios de detecção , tais como exame microscópico de fluorescência .

FOLHA MODIFICADA (ARTIGO 19)