CN114487188A - 基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法 - Google Patents
基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114487188A CN114487188A CN202210084886.7A CN202210084886A CN114487188A CN 114487188 A CN114487188 A CN 114487188A CN 202210084886 A CN202210084886 A CN 202210084886A CN 114487188 A CN114487188 A CN 114487188A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primary dysmenorrhea
- treating
- tablet
- animal model
- preparing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010013935 Dysmenorrhoea Diseases 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000011552 rat model Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 8
- UYIFTLBWAOGQBI-BZDYCCQFSA-N Benzhormovarine Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](C2=CC=3)CC[C@]4([C@H]1CC[C@@H]4O)C)CC2=CC=3OC(=O)C1=CC=CC=C1 UYIFTLBWAOGQBI-BZDYCCQFSA-N 0.000 claims abstract description 7
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102100031951 Oxytocin-neurophysin 1 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 229950002007 estradiol benzoate Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 7
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 claims description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 8
- 208000005171 Dysmenorrhea Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 7
- 240000007311 Commiphora myrrha Species 0.000 claims description 6
- 235000006965 Commiphora myrrha Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 235000007265 Myrrhis odorata Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000009188 angelicae sinensis extract Substances 0.000 claims description 4
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 4
- 239000001307 helium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000010238 partial least squares regression Methods 0.000 claims description 4
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 241000717739 Boswellia sacra Species 0.000 claims description 3
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 3
- 241001489978 Eupolyphaga Species 0.000 claims description 3
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 claims description 3
- 239000004863 Frankincense Substances 0.000 claims description 3
- 241000243684 Lumbricus Species 0.000 claims description 3
- 241001057584 Myrrha Species 0.000 claims description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 3
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims description 3
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- 229940081859 myrrh extract Drugs 0.000 claims description 3
- -1 pollen Typhae Substances 0.000 claims description 3
- 239000009286 sanguis draxonis Substances 0.000 claims description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000009136 dragon's blood Substances 0.000 claims description 2
- 241000159174 Commiphora Species 0.000 claims 4
- 240000001008 Dimocarpus longan Species 0.000 claims 1
- 240000004824 Trimezia steyermarkii Species 0.000 claims 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 2
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241001519271 Ajuga Species 0.000 description 1
- 241001043298 Croton draco Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010013082 Discomfort Diseases 0.000 description 1
- 241000735588 Gaultheria Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N famotidine Chemical compound NC(N)=NC1=NC(CSCCC(N)=NS(N)(=O)=O)=CS1 XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003821 menstrual periods Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，该方法为非疾病的治疗目的的方法，采用苯甲酸雌二醇和缩宫素联用复制原发性痛经大鼠模型，使用加味没竭片对原发性痛经大鼠模型进行干预治疗，基于气相色谱‑飞行时间质谱仪采集治疗后大鼠血清样品的代谢图谱信息；对数据进行处理分析，筛选出有显著性差异的生物标志物，通过网站分析其参与的代谢通路，探讨加味没竭片治疗原发性痛经的作用机制。本发明从整体的角度研究外界刺激对生物体内源性小分子的影响及变化规律，代谢组学方法与中药整体观相吻合，为中医证候和中药整体作用机制研究提供了新的研究思路和方法。
Description
技术领域
本发明属于生物信息学技术领域，具体涉及一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法。
背景技术
痛经系指经期前后或行经期间，出现下腹部痉挛性疼痛，并有全身不适，严重影响日常生活。分原发性和继发性两种。原发性痛经即功能性痛经，是指月经期疼痛，常呈痉挛性，集中在下腹部。其他症状包括头痛乏力、头晕、恶心呕吐、腹泻、腰腿痛，是年轻女性十分常见的病症，严重影响育龄期女性的正常工作生活。原发性痛经的临床治疗提倡尽快实施有效治疗措施，探讨对原发性痛经的干预作用及机制显得尤为重要。
原发性痛经主要由于生理期间前列腺素分泌较多，引起子宫肌层收缩剧烈，加味没竭片能够显著缓解原发性痛经患者的疼痛症状。目前对加味没竭片治疗原发性痛经的作用机制研究较少。中医讲究辨证论治，在疾病发生发展过程中，其生理、病理不断变化，疾病治疗应对症治疗。
加味没竭片对原发性痛经有破气行滞，活血化瘀的功效，在临床运用广泛。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法。即一种基于非靶向代谢组学判定加味没竭片作用于原发性痛经大鼠的代谢变化方法，具体地，研究加味没竭片对原发性痛经模型大鼠血清代谢物的影响，寻找可能的生物标志物，探讨加味没竭片治疗原发性痛经的作用机制。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，该方法为非疾病的治疗目的的方法，其包括如下步骤：
(1)、给大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇，腹腔注射缩宫素得到原发性痛经大鼠模型，灌胃给药加味没竭片；
(2)、通过气相色谱-飞行时间质谱仪(GC-TOF/MS)，造模后，采用加味没竭片对原发性痛经大鼠模型干预治疗，获得的血清进行代谢图谱信息的采集；
(3)、对步骤(2)中的代谢图谱信息进行数据预处理；
(4)、进行多变量统计分析，筛选有显著性差异的生物标志物群；
(5)、分析所述生物标志物群参与的代谢通路，探讨加味没竭片制备治疗原发性痛经的作用机制。
作为本发明的优选实施例，步骤(1)中，加味没竭片的制备过程为：按处方，将血竭、蒲黄、乳香、没药粉碎成细粉后备用；莪术粉碎成粗粉后，用水蒸气提取挥发油，蒸馏后的水溶液过滤，药渣、滤液分别收集；挥发油与β-环糊精、水混合并研磨进行包合，过滤，包合物真空干燥；药渣与浸泡的地龙、赤芍、三棱、土鳖虫加水煎煮，过滤，合并两次滤液，与上述莪术滤液合并后浓缩，加乙醇，静置，过滤，滤液回收乙醇并浓缩得流浸膏。
作为本发明的优选实施例，步骤(2)中，代谢图谱信息的采集过程具体包括：
(2.1)、血清样品制备：将冻存的原发性痛经大鼠模型的血清室温解冻，离心，加入甲醇/氯仿溶剂涡旋，再次离心，取上清液，回收即可；
(2.2)、设定气相色谱-飞行时间质谱仪中的质谱条件：接口温度：220℃；离子源温度：220℃；溶剂延时为6min，电离方式为电子电离，电子能量为70eV，全扫描方式，质谱扫描范围为30-550m/z，以每秒10张谱方式采集；
色谱条件：进样温度：270℃；不分流进样1.0μL；柱温：起始温度为90℃，保留1min，以8℃/min的速度升至170℃，然后，以5℃/min的速度升至240℃，最后，以25℃/min的速度升至290℃，保留9min；流速为1.0mL/min，载气为浓度≥99.999％的氦气；
通过GC-TOF/MS采集大鼠原发性痛经治疗血清样品的代谢图谱。
作为本发明的优选实施例，步骤(3)中，数据预处理的过程为：对采集的代谢图谱信息进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度的校正，获得包含化合物保留时间和峰面积信息的csv格式文件。
作为本发明的优选实施例，步骤(4)中，多变量统计分析的过程为：将分组后的数据进行无监督的主成分分析和有监督的偏最小二乘回归分析，对组别进行分类并判别组间差异，选择显著性差异P值小于0.05、VIP值大于1的变量作为生物标志物群。
一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型，其由上述的方法得到。
一种上述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型在筛选抗痛经药物中的应用。
一种上述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型在筛选抗原发性痛经药物中的应用。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明从整体的角度研究外界刺激对生物体内源性小分子的影响及变化规律，代谢组学方法与中药整体观相吻合，为中医证候和中药整体作用机制研究提供了新的研究思路和方法。
具体实施方式
本发明提供了一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法。
本发明的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，该方法为非疾病的治疗目的的方法，包括如下步骤：
(1)、给大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇，腹腔注射缩宫素得到(即复制)原发性痛经大鼠模型，灌胃给药加味没竭片；
(2)、通过GC-TOF/MS，造模后，采用加味没竭片对原发性痛经大鼠模型干预治疗，获得的血清进行代谢图谱信息的采集；
(3)、对步骤(2)中的代谢图谱信息进行数据预处理；
(4)、进行多变量统计分析，筛选有显著性差异的生物标志物群；
(5)、分析所述生物标志物群参与的代谢通路，探讨加味没竭片制备治疗原发性痛经的作用机制。
其中，在步骤(1)中，加味没竭片的制备过程为：按处方，将血竭、蒲黄、乳香、没药粉碎成细粉后备用；莪术粉碎成粗粉后，用水蒸气提取挥发油，蒸馏后的水溶液过滤，药渣、滤液分别收集；挥发油与β-环糊精、水混合并研磨进行包合，过滤，包合物真空干燥；药渣与浸泡的地龙、赤芍、三棱、土鳖虫加水煎煮，过滤，合并两次滤液，与上述莪术滤液合并后浓缩，加乙醇，静置，过滤，滤液回收乙醇并浓缩得流浸膏。
在步骤(2)中，代谢图谱信息的采集过程具体包括：
(2.1)、血清样品制备：取50μL血清，置于离心管中，加入200μL甲醇/氯仿溶剂(3:1，V/V)，涡旋振荡混匀，在4℃下，以12000rpm转速离心10min，取200μL上清液，置于高回收进样瓶中，进行GC-TOF/MS分析，既得；
(2.2)、设定GC-TOF/MS中的条件：
质谱仪：美国LECO公司Pegsus BT型TOF-MS仪器，质谱条件：接口温度：220℃；离子源温度：220℃；溶剂延时为6min，电离方式为电子电离，电子能量为70eV，全扫描方式，质谱扫描范围为30-550m/z，以每秒10张谱方式采集；
使用质控样品进行方法验证，质控样品由每个正常样品各取10μL混合而得；样品的检测过程中，每检测10个正常样品后运行1次QC样品以衡量系统的稳定性，样品的检测顺序为随机进行；
色谱柱：美国Agilent公司7890B GC的DB-5MS色谱柱，色谱条件：进样温度：270℃；不分流进样1.0μL；柱温：起始温度为90℃，保留1min，以8℃/min的速度升至170℃，然后，以5℃/min的速度升至240℃，最后，以25℃/min的速度升至290℃，保留9min；流速为1.0mL/min，载气为超纯氦气(≥99.999％)；
通过ChromaTOF for BT软件采集大鼠原发性痛经治疗血清样品的代谢图谱。
在步骤(3)中，数据预处理的过程为：基于ChromaTOF for BT软件对采集的代谢图谱信息进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度的校正等，获得包含化合物保留时间和峰面积信息的csv格式文件。
在步骤(4)中，多变量统计分析的过程为：设计好实验分组，将处理后的数据矩阵使用SIMCA 21.0软件进行多变量统计分析，进行无监督的主成分分析和有监督的偏最小二乘回归分析，对组别进行分类并判别组间差异，选择显著性差异P值小于0.05、VIP值大于1的变量作为生物标志物群，此时得到其保留时间和峰面积信息，基于生物学数据库筛选出加味没竭片治疗大鼠原发性痛经的内源性生物标志物并对其进行鉴定。
在步骤(5)中，通过Metaboanalyst网站分析其参与的代谢通路，探讨加味没竭片制备治疗原发性痛经的作用机制。
由上述的方法得到本发明的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型。
本发明的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型可以在筛选抗痛经药物中得以应用。
本发明的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型可以在筛选抗原发性痛经药物中得以应用。
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，该方法为非疾病的治疗目的的方法，包括如下步骤：
(1)、采用皮下注射苯甲酸雌二醇、腹腔注射缩宫素复制原发性痛经大鼠模型。取未孕雌性SD大鼠60只，在SPF级动物房中分笼适应性饲养1周后。从第1天开始，皮下注射苯甲酸雌二醇，连续10天，每日1次，末次给药1h后，腹腔注射缩宫素(10U/只)。
(2)、基于GC-TOF/MS联用技术，利用气相色谱的高灵敏度特性，采集大鼠原发性痛经血清样品的代谢图谱信息。
该图谱信息获取具体过程包括：
(2.1)、血清样品制备方法
将冻存大鼠血清室温解冻，取100μL血清，置于离心管中，加入300μL甲醇/氯仿溶剂(3:1，V/V)，涡旋振荡混匀，在4℃下，以12000rpm转速离心10min，取300μL上清液，置于1.5mL高回收进样瓶中，进行GC-TOF/MS分析，既得。
(2.2)、血清样品测定条件
(2.2.1)、质谱仪：美国LECO公司Pegsus BT型TOF-MS仪器，质谱条件：
接口温度：220℃；离子源温度：220℃；溶剂延时6min，电离方式EI，电子能量70eV，全扫描方式，质谱扫描范围为30-550m/z，以每秒10张谱方式采集；
使用质控样品进行方法验证，质控样品由每个正常样品各取10μL混合而得；样品的检测过程中，每检测10个正常样品后运行1次QC样品以衡量系统的稳定性，样品的检测顺序为随机进行；
(2.2.2)、色谱柱：美国Agilent公司7890B GC的DB-5MS色谱柱，色谱条件：
进样温度：270℃；不分流进样1.0μL；柱温：起始温度90℃，保留1min，以8℃/min的速度升至170℃，然后，以5℃/min的速度升至240℃，最后，以25℃/min的速度升至290℃，保留9min；流速1.0mL/min，载气为超纯氦气(≥99.999％)。
(2.2.3)、图谱采集软件
通过ChromaTOF for BT软件采集大鼠原发性痛经治疗血清样品的代谢图谱。
(3)、运用ChromaTOF for BT软件进行数据预处理；
基于ChromaTOF for BT软件对采集得到的谱图进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度的校正等，获得包含化合物保留时间和峰面积信息的csv格式文件。
(4)、利用SIMCA 21.0统计软件进行多变量统计分析，筛选出又显著性差异的生物标志物群。
设计好实验分组，将处理后的数据矩阵导入SIMCA 21.0统计软件进行多变量统计分析，进行无监督的主成分分析和有监督的偏最小二乘回归分析，对组别进行分类并判别组间差异，选择显著性差异P值小于0.05、VIP值大于1的变量作为生物标志物群，此时得到其保留时间和峰面积信息，基于生物学数据库筛选出加味没竭片治疗大鼠原发性痛经的内源性生物标志物并对其进行鉴定。
原发性痛经大鼠模型使得15个病理性生物标志物发生了显著波动，最终鉴定出3个病理性标志物，分别为亚油酸、延胡索酸和天冬氨酸。与正常组相比较，原发性痛经模型组病理性标志物均表现为上升趋势。
(5)、对步骤(4)筛选出的并确认的差异代谢标志物通过Metaboanalyst网站分析其参与的代谢通路，探讨加味没竭片治疗原发性痛经的作用机制。把差异代谢标志物放入Metaboanalyst网站自动给出代谢通路，然后结合相关代谢物数据库如HMBD(Human Metabolome Data base)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)等查询差异生物标志物的生物学功能并作出解释即可。原发性痛经模型引起大鼠体内的亚油酸、延胡索酸和天冬氨酸的差异性表达，根据其生物学功能，推测可能影响大鼠体内的脂质代谢和氨基酸合成。
本发明通过复制原发性痛经大鼠模型，观察给药后大鼠的痛经症状，检测内源性小分子代谢物的变化，并与前人的研究、临床的指标相对比，来判断模型研究的准确性，初步表明，大鼠进行苯甲酸雌二醇和缩宫素注射后各指标组间存在显著差异，因此判定原发性痛经模型成功建立。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，该方法为非疾病的治疗目的的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、给大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇，腹腔注射缩宫素得到原发性痛经大鼠模型，灌胃给药加味没竭片；
(2)、通过气相色谱-飞行时间质谱仪，采用加味没竭片对原发性痛经大鼠模型干预治疗，获得的血清进行代谢图谱信息的采集；
(3)、对步骤(2)中的代谢图谱信息进行数据预处理；
(4)、进行多变量统计分析，筛选有显著性差异的生物标志物群；
(5)、分析所述生物标志物群参与的代谢通路，探讨加味没竭片制备治疗原发性痛经的作用机制。
2.根据权利要求1所述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，其特征在于：步骤(1)中，所述加味没竭片的制备过程为：将血竭、蒲黄、乳香、没药粉碎成细粉后备用；莪术粉碎成粗粉后，用水蒸气提取挥发油，蒸馏后的水溶液过滤，药渣、滤液分别收集；挥发油与β-环糊精、水混合并研磨进行包合，过滤，包合物真空干燥；药渣与浸泡的地龙、赤芍、三棱、土鳖虫加水煎煮，过滤，合并滤液，与莪术滤液合并后浓缩，加乙醇，静置，过滤，滤液回收乙醇并浓缩。
3.根据权利要求1所述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，其特征在于：步骤(2)中，所述代谢图谱信息的采集过程具体包括：
(2.1)、血清样品制备：将冻存的原发性痛经大鼠模型的血清室温解冻，离心，加入甲醇/氯仿溶剂涡旋，再次离心，取上清液，回收即可；
(2.2)、设定气相色谱-飞行时间质谱仪中的质谱条件：接口温度：220℃；离子源温度：220℃；溶剂延时为6min，电离方式为电子电离，电子能量为70eV，全扫描方式，质谱扫描范围为30-550m/z，以每秒10张谱方式采集；
色谱条件：进样温度：270℃；不分流进样1.0μL；柱温：起始温度为90℃，保留1min，以8℃/min的速度升至170℃，然后，以5℃/min的速度升至240℃，最后，以25℃/min的速度升至290℃，保留9min；流速为1.0mL/min，载气为浓度≥99.999％的氦气；
通过气相色谱-飞行时间质谱仪采集大鼠原发性痛经治疗血清样品的代谢图谱。
4.根据权利要求1所述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，其特征在于：步骤(3)中，所述数据预处理的过程为：对采集的代谢图谱信息进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度的校正，获得包含化合物保留时间和峰面积信息的csv格式文件。
5.根据权利要求1所述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法，其特征在于：步骤(4)中，所述多变量统计分析的过程：将分组后的数据进行无监督的主成分分析和有监督的偏最小二乘回归分析，对组别进行分类并判别组间差异，选择显著性差异P值小于0.05、VIP值大于1的变量作为生物标志物群。
6.一种基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型，其特征在于：其由权利要求1-5任一项所述的方法得到。
7.一种如权利要求6所述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型在筛选抗痛经药物中的应用。
8.一种如权利要求6所述的基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型在筛选抗原发性痛经药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210084886.7A CN114487188A (zh) | 2022-01-25 | 2022-01-25 | 基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210084886.7A CN114487188A (zh) | 2022-01-25 | 2022-01-25 | 基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114487188A true CN114487188A (zh) | 2022-05-13 |
Family
ID=81474354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210084886.7A Pending CN114487188A (zh) | 2022-01-25 | 2022-01-25 | 基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114487188A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116159114A (zh) * | 2023-03-16 | 2023-05-26 | 上海交通大学 | 一种芪斛消积饮的新型发酵制备工艺及制品 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1371739A (zh) * | 2002-01-16 | 2002-10-02 | 深圳亿胜医药科技发展有限公司 | 加味没竭片配方及制备工艺 |
| CN102830193A (zh) * | 2011-06-16 | 2012-12-19 | 上海聚类生物科技有限公司 | 一种基于气相色谱-质谱技术进行血清代谢组学研究的方法 |
| CN105106862A (zh) * | 2015-09-24 | 2015-12-02 | 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 | 一种治疗妇女功能性痛经的中药组合物及其应用 |
| CN112274619A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-29 | 上海中医药大学 | 一种缓解痛经的组合物及其在制备药物、保健品或食品中的应用 |
| CN112505207A (zh) * | 2020-09-27 | 2021-03-16 | 江南大学 | 一种用于抗氧化活性物质筛选的生物代谢组学分析方法 |
| CN113281448A (zh) * | 2021-05-22 | 2021-08-20 | 江西中医药大学 | 基于心源性休克大鼠模型的代谢组学分析方法 |
-
2022
- 2022-01-25 CN CN202210084886.7A patent/CN114487188A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1371739A (zh) * | 2002-01-16 | 2002-10-02 | 深圳亿胜医药科技发展有限公司 | 加味没竭片配方及制备工艺 |
| CN102830193A (zh) * | 2011-06-16 | 2012-12-19 | 上海聚类生物科技有限公司 | 一种基于气相色谱-质谱技术进行血清代谢组学研究的方法 |
| CN105106862A (zh) * | 2015-09-24 | 2015-12-02 | 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 | 一种治疗妇女功能性痛经的中药组合物及其应用 |
| CN112505207A (zh) * | 2020-09-27 | 2021-03-16 | 江南大学 | 一种用于抗氧化活性物质筛选的生物代谢组学分析方法 |
| CN112274619A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-29 | 上海中医药大学 | 一种缓解痛经的组合物及其在制备药物、保健品或食品中的应用 |
| CN113281448A (zh) * | 2021-05-22 | 2021-08-20 | 江西中医药大学 | 基于心源性休克大鼠模型的代谢组学分析方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 周娴颖: "加味没竭片方对大鼠痛经模型的镇痛作用研究及其机理初探", 《中国药理学会第九届全国基础与临床生殖药理学术研讨会》, pages 49 * |
| 廖维, 王采文: "加味没竭片治疗原发性痛经疗效观察", 实用中医药杂志, no. 02 * |
| 朱英: "隔药灸神阙穴对原发性痛经模型大鼠血液代谢组学的影响", 《中医杂志》, vol. 59, no. 13, pages 1144 - 1148 * |
| 段昆;高霞;耿婷;陈夏霖;曹亮;肖伟;王振中;: "基于血清代谢组学技术探讨桂枝茯苓胶囊及其主要成分治疗原发性痛经的作用机制", 中国新药杂志, no. 18 * |
| 薛子钰;华永丽;李锦霞;姚万玲;纪鹏;王涛;魏彦明;: "当归不同炮制品挥发油给药大鼠的尿液代谢组学研究", 中国中药杂志, no. 05 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116159114A (zh) * | 2023-03-16 | 2023-05-26 | 上海交通大学 | 一种芪斛消积饮的新型发酵制备工艺及制品 |
| CN116159114B (zh) * | 2023-03-16 | 2023-11-28 | 上海交通大学 | 一种芪斛消积饮的发酵制备工艺及制品 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108508055B (zh) | 一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法 | |
| CN109030663B (zh) | 一种uhplc法检测复方甘草片中化学成分的方法 | |
| Tian et al. | Orthogonal test design for optimization of the extraction of polysaccharide from Paeonia sinjiangensis KY Pan | |
| Cho | Application of proteomics in Chinese medicine research | |
| CN114487188A (zh) | 基于加味没竭片制备治疗原发性痛经动物模型的代谢组学方法 | |
| Kan et al. | Identification of anti-inflammatory components in Panax ginseng of Sijunzi Decoction based on spectrum-effect relationship | |
| CN104881579B (zh) | 一种治疗气滞型胃脘痛中药组合物筛选方法 | |
| Liu et al. | A comprehensive quality evaluation method of different medicinal parts of Physalis Calyx seu Fructus by fingerprints, chemometrics, antioxidant activity, network pharmacology and molecular docking | |
| CN112285241A (zh) | 一种沙参麦冬汤的hplc指纹图谱的构建方法 | |
| CN113466471B (zh) | 胃粘膜损伤相关生物标志物、筛选方法及用途 | |
| CN111544498A (zh) | 当归芍药散的新用途 | |
| CN113063872B (zh) | 三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱和质量分析方法 | |
| CN114414671A (zh) | 两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法 | |
| CN106018647B (zh) | 一种建立葵花盘hplc标准指纹图谱的方法 | |
| CN109270203B (zh) | 颈腰康胶囊活性成分特征图谱的构建方法及颈腰康胶囊的质量检测方法 | |
| CN110441414B (zh) | 金水六君煎指纹图谱的建立方法 | |
| CN105999195A (zh) | 一种参枝苓制剂的制备方法 | |
| CN107247884B (zh) | 一种高血压病肝阳上亢证大鼠模型判别方法及其应用 | |
| CN112394118A (zh) | 当归补血复方制剂特征图谱及含量测定的方法 | |
| Lv et al. | Biomarkers based on multiplatform comprehensive analysis: A systematic analysis of Geng‐Nian‐Shu in perimenopausal syndrome | |
| CN103110712A (zh) | 固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用 | |
| CN114748465B (zh) | 一种用于治疗小儿哮喘的药物组合物及其用途 | |
| US20240325479A1 (en) | Total extract of Fructus Cnidii and its application and map construction method | |
| CN112924600B (zh) | 一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法 | |
| CN114295759B (zh) | 用于治疗偏头痛的细辛或细辛提取物的质量检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220513 |