CN113063872B - 三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱和质量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱和质量分析方法，属于药品分析技术领域,首先建立了三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱，利用三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱与镇痛抗炎建立谱效关系，并基于所述谱效关系建立三七姜质量评价标准；阐明三七姜乙酸乙酯部位中的化学成分与镇痛抗炎药效之间的相关性；对三七姜提取物的药效研究，探讨三七姜外用药理作用位，为之后的深入研究提供科学依据。

Description

三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱和质量分析方法

技术领域

本发明属于药品分析技术领域，尤其是涉及一种三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱和质量分析方法。

背景技术

三七姜在《广西中草药》中记载有活血散瘀、消肿止痛之功。《广西民族药简编》载：外用捣烂敷患处治跌打损伤。《全国中草药汇编》中记载主治跌打损伤，风湿骨痛。《中华本草》记载：治疗跌打损伤，外用酒炒热敷患处。现代药理研究，三七姜醇提物具有抗炎作用。民间常以三七姜根茎入药作为野生草药使用后，发现对风湿性骨关节疼痛有一定疗效。用于治疗风湿骨痛，吐血衄血，月经过多等疾病，炒炭后研粉撒患处用于散淤消肿、活血止血、行气止痛、跌打损伤、虫咬蛇伤、外伤出血等。

近年来，中药指纹图谱分析技术的广泛应用推动了其发展，不仅提升了中药材和中成药的质量标准也让产品整体质量水平得以进步。但目前没有关于三七姜指纹图谱的研究，且目前对指纹图谱的评价多采用相似度分析作为基本评价方法，对三七姜的外用功能相关方面的研究报道较少。

因此，为了筛选出三七姜的药效活性部，对三七姜提取物的药效研究，探讨三七姜外用药理作用位，为之后的深入研究提供科学依据，需要对三七姜有效药用部位进行研究、确立标准指纹图谱和质量分析方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱和质量分析方法，确定了三七姜的标准指纹图谱，通过对三七姜乙酸乙酯部位的镇痛抗炎药效与指纹图谱建立谱效关系的分析，阐明三七姜乙酸乙酯部位中的化学成分与镇痛抗炎药效之间的相关性。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱，是采用如下方法构建的：

(1)供试品溶液的制备：

①制备三七姜乙醇提取物：称取三七姜粗粉，粉碎后过16目筛，加入其7-8倍体积量的80％乙醇溶液，加热回流提取2h，重复3次，滤过并收集滤液，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得到乙醇总提取物；

②提取乙酸乙酯部位：将所述乙醇总提取物用纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取至溶液颜色至澄清透明，得到乙酸乙酯萃取部位的药液，减压浓缩，放置水浴蒸干，即得到乙酸乙酯部位提取物，备用；

③制备供试品溶液：取乙酸乙酯部位提取物0.1g，精密称定，用5mL甲醇超声提取5min，加甲醇定容至10mL，过滤，将所述滤液13000r/min离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：各称取对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对羟基苯甲醛对照品，分别加甲醇溶解制备质量浓度分别为0.212、0.236、0.149mg/mL的混合对照品溶液；

(3)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，按照如下色谱条件进行色谱图采集，采用液相工作站对色谱图处理，再导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件中，得到对指纹图谱；所述色谱条件为：进样量10μL；以乙腈为流动相B，0.1％磷酸溶液或0.1％甲酸溶液或0.1％冰醋酸溶液为流动相A，进行梯度洗脱:0min→20min、10％→60％B，20min→50min、60％→80％B，50min→65min、80％→100％B，65min→75min、100％B，流速：0.8～1.2mL/min，柱温30℃，检测波长260nm。

进一步地，所述流动相A为0.1％磷酸溶液；所述流速为0.8mL/min。

进一步地，所述色谱柱为规格为4.6×250mm、5μm的C₁₈键合硅胶柱。

进一步地，所述指纹图谱标定18个色谱峰为共有指纹峰，2号峰为对羟基苯甲酸峰。

进一步地，是利用三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱与镇痛抗炎建立谱效关系，并基于所述谱效关系建立三七姜质量评价标准。

进一步地，所述三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱与镇痛抗炎建立谱效关系，是利用Pearson相关系数法和灰色关联度法共同建立；所述三七姜镇痛抗炎的研究包括耳廓肿胀度，扭体次数研究。

本发明提供所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析，其特征在于，所述灰色关联度分析法为：将镇痛抗炎试验中三七姜乙酸乙酯部位提取物对机体各药效指标抑制率设置为参考系列耳廓肿胀度实验为λ₀₁、扭体次数实验为λ₀₂，将不同供试品三七姜指纹图谱18个共有峰峰面积设置为比较数列，记为λ_i，i＝1，2，3…18，计算λ₀₁、λ₀₂与λ_i(k)的关联度，并对关联度大小进行排序以判别各峰面积对药效指标的影响力。

进一步地，所述Pearson相关系数分析法为：将不同供试品三七姜指纹图谱18个共有峰值的峰面积为自变量，依次用α₁-α₁₈表示；所述耳廓肿胀度β₁、扭体次数β₂为因变量，采用SPSS23.0统计软件，得到指纹图谱中各色谱峰与药效的Pearson相关系数。

进一步地，所述三七姜质量评价标准是：选择灰色关联度分析中关联度大于0.65，且Pearson相关系数法分析中对三七姜镇痛、抗炎药效的相关呈负相关的指纹峰为特征峰，通过计算所选择特征峰占总峰面积的比例来制定三七姜质量评价标准。所选择特征峰占总峰面积的比例越高，则三七姜质量越好。

本发明提供所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，是运用聚类分析法和主成分分析法对不同产地三七姜的指纹图谱共同进行分析，其中，所述聚类分析法是以所述指纹图谱的18个共有峰的峰面积数据，运用SPSS 23.0软件进行聚类分析，以欧式距离作为度量标准，得出树状聚类图,对不同供试品进行质量评价；所述主成分分析法是以所述指纹图谱的18个共有峰的峰面积数据，采用SPSS 23.0统计软件对数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，选取特征值大于1为主成分，将数据矩阵进行在SPSS23.0中以主成分的空间散点坐标系建立3D分布图空间图进行分类，对不同三七姜供试品进行主成分分析。

进一步地于，所述三七姜质量分析标准是：选择聚类分析中欧式距离为15时，且通过主成分分析法所得空间得分图中的分类，即可得到不同三七姜供试品的质量分类。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明选取三七姜乙酸乙酯部位为研究对象，以对羟基苯甲酸对照峰，通过液相色谱做出标准的指纹图谱，经过研究发现对羟基苯甲酸在本发明的色谱条件下不受供试样品的干扰，且分离度较好，峰高也较为明显，因此以对羟基苯甲酸作为参照峰，能够清楚的得到指纹图谱，所述对羟基苯甲酸作为参照峰在样品色谱图中标记为2号峰。

2.本发明以三七姜不同部位提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响、对醋酸致小鼠扭体反应的影响为研究，利用Pearson相关系数法和灰色关联度法共同建立与所述三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱与镇痛抗炎建立谱效关系，推断三七姜乙酸乙酯部位镇痛抗炎药效物质基础是通过其有效成分群共同作用的结果，虽然其特征峰与其药效的关联度存在差异，但其关联结果都复合灰色关联度法标准，这些关联度较高的包括已知成分原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛可能是其发挥药效的主要成分，在一定程度上能起到镇痛抗炎的功效；并以这些成分为基础，评价了三七姜的质量和品质。

3.本发明过对三七姜的三个活性部位指纹图谱的色谱条件分别从不同型号的色谱柱、流动相、检测波长、柱温、流速、进样量等几个方面进行了考察，确定了最佳的色谱条件。同时，方法学考察对精密度、重复性和稳定性试验进行了考察，结果均符合相关要求。并采用相似度评价软件对三七姜10个产地不同部位指纹图谱进行了分析，结果相似度都大于0.9，均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定。

4.本发明运用SPSS23.0软件对10批不同产地三七姜不同部位指纹图谱进行聚类分析和主成分分析，结果得到聚类分析和主成分分析结果相一致。本发明结合相似度评价、聚类分析和主成分分析分别对10批不同产地三七姜的活性部位指纹图谱进行了综合评价，能够较为全面的反映药材的质量信息，对不同质量的三七姜进行合理的分类，为建立三七姜药材的谱效关系提供理论依据。

附图说明

图1为不同产地三七姜乙酸乙酯部位匹配叠加色谱图(图中S1-南宁武鸣区S2-桂林平乐县S3-柳州鹿寨县S4-贺州昭平县S5-梧州藤县S6-玉林兴业县S7-河池东兰县S8-来宾忻城县S9-崇左龙州县S10-百色西林县R-对照图谱)。

图2为三七姜乙酸乙酯部位提取物的对照指纹图谱。

图3为混合对照品的HPLC图。

图4为不同产地三七姜乙酸乙酯部位聚类分类结果图。

图5为不同产地三七姜乙酸乙酯部位特征值散点图。

图6为不同产地三七姜乙酸乙酯部位主成分分析空间得分图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不作为是对本发明的限制。

实施例1

三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱，是采用如下方法构建的：

(1)供试品溶液的制备：

①制备三七姜乙醇提取物：称取三七姜粗粉，粉碎后过16目筛，加入其7-8倍体积量的80％乙醇溶液，加热回流提取2h，重复3次，滤过并收集滤液，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得到乙醇总提取物；

②提取乙酸乙酯部位：将所述乙醇总提取物用纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取至溶液颜色至澄清透明，得到乙酸乙酯萃取部位的药液，减压浓缩，放置水浴蒸干，即得到乙酸乙酯部位提取物，备用；

③制备供试品溶液：取乙酸乙酯部位提取物0.1g，精密称定，用5mL甲醇超声提取5min，加甲醇定容至10mL，过滤，将所述滤液13000r/min离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：各称取对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对羟基苯甲醛对照品，分别加甲醇溶解制备质量浓度分别为0.212、0.236、0.149mg/mL的混合对照品溶液；

(3)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，按照如下色谱条件进行色谱图采集，所述色谱柱为规格为4.6×250mm、5μm的C₁₈键合硅胶柱；所述色谱条件为：进样量10μL；以乙腈为流动相B，0.1％磷酸溶液为流动相A，进行梯度洗脱:0min→20min、10％→60％B，20min→50min、60％→80％B，50min→65min、80％→100％B，65min→75min、100％B，流速：0.8mL/min，柱温30℃，检测波长260nm。

实施例2

与实施例1的区别在于，所述色谱条件调整为：进样量10μL；以乙腈为流动相B，0.1％甲酸溶液为流动相A，进行梯度洗脱:0min→20min、10％→60％B，20min→50min、60％→80％B，50min→65min、80％→100％B，65min→75min、100％B，流速：1.0mL/min。

实施例3

与实施例1的区别在于，所述色谱条件调整为：进样量10μL；以乙腈为流动相B，0.1％冰醋酸溶液为流动相A，进行梯度洗脱:0min→20min、10％→60％B，20min→50min、60％→80％B，50min→65min、80％→100％B，65min→75min、100％B，流速:1.2mL/mi。

一、方法学考察

1.精密度试验

取三七姜乙酸乙酯部位提取物，按实施例1方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录HPLC图，考察18个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

结果表明，以2号峰(羟基苯甲酸)为参照峰，各色谱峰的相对保留时间RSD的均值在0.04％～0.17％；各色谱峰相对峰面积RSD值在0.42％～1.79％，各色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.18％(n＝6)、各色谱峰相对峰面积的RSD均小于1.8％(n＝6)，表明仪器的精密度良好。

2.重复性试验

取三七姜乙酸乙酯部位提取物，精密称取6份，按实施例1方法制备供试品溶液，测定记录HPLC图，考察18个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，考察实验方法的重复性。

结果表明，以2号峰(羟基苯甲酸)为参照峰，6份样品中各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.09％～0.33％；各色谱峰相对峰面积RSD值在0.38％～1.76％，各色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.34％(n＝6)、相对峰面积的RSD均小于1.77％(n＝6)，表明实验重复性好。

3.稳定性试验

取三七姜乙酸乙酯部位提取物，按实施例1方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24h进行检测HPLC图，考察18个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，考察样品溶液的稳定性。

结果表明，以2号峰(羟基苯甲酸)为参照峰，各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.09％～0.33％；各色谱峰相对峰面积RSD值在0.58％～2.11％，各色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.34％(n＝6)、相对峰面积的RSD均小于2.12％(n＝6)，表明供试品于室温下放置24h内稳定性良好。

二、不同产地三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱采集

选取10广西各产地的三七姜乙酸乙酯提取物S1-S10进行下述试验，S1-S10产地依次为：南宁武鸣区、桂林平乐县、柳州鹿寨县、梧州藤县、玉林兴业县、河池东兰县、来宾忻城县、崇左龙州县、百色西林。

1.相似度评价

对10批三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱进行相似度评价。具体操作：将各产地三七姜乙酸乙酯部位按照实施例1中方法得到色谱图，将所述色谱图采用AglientChemstation液相工作站转化为AIA格式后，保存并导出各产地图谱，导入相似度评价软件中：设置S1图谱为参照图谱(因S1图谱的色谱峰信号相对较强且峰形明显)，以中位数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.1，多点校正后选择全峰Mark峰匹配模式，点击生成对照指纹图谱(见图2)，进行数据匹配并计算相似度，最后导出数据和匹配图。10批导入图谱的相似度情况(见表1)，不同产地三七姜乙酸乙酯部位匹配叠加色谱图(见图1)。

表1 10批广西不同产地三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的相似度结果

图1为不同产地三七姜乙酸乙酯部位匹配叠加色谱图。图谱的建立使用国家药典颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012.1版》软件2号峰作为参照峰，总共标定18个色谱峰为共有指纹峰。10批样品的相似度在0.944～0.997范围内，说明10批三七姜乙酸乙酯提取物的图谱与对照指纹图谱具有较高的相似度，即各批样品的化学成分一致性较好。

2.指纹图谱共有峰的确定

共有峰的指认10批三七姜乙酸乙酯提取物含共有峰18个，通过与混合对照品溶液的保留时间对比，指认出其中3个共有峰，分别为原儿茶酸(1号峰)、对羟基苯甲酸(2号峰)、对羟基苯甲醛(4号峰)，因对羟基苯甲酸峰含量相对较高、分离度良好，且出峰稳定，故选择2号峰(对羟基苯甲酸)作为参照峰(S),见图3。

三、三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱与镇痛抗炎建立谱效关系

1.三七姜镇痛抗炎实验：

1)小鼠耳廓肿胀度实验：取KM雄性小鼠，体质量18～22g，随机分组，分笼饲养。分为空白对照组、阳性对照组、三七姜80％乙醇总提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物的高、中、低剂量组。给药组分别于动物右耳正反两面涂相应药物50μL(即：0.075g生药/耳、0.05g生药/耳、0.025g生药/耳)，阳性组给予复方醋酸地塞米松乳膏(0.06g/耳)，空白对照组同法涂抹生理盐水50μL。10min涂抹1次，定时定量涂药，连续涂药1h，共涂药6次。涂药后用生理盐水擦静右耳后再用干药棉擦干。10min后涂二甲苯20μL，于致炎后10min、2h各组小鼠右耳再次分别涂以相应量药物1次。于涂二甲苯4h后，用生理盐水擦静右耳后再用干药棉擦干。剪下双耳，对齐，用6mm打孔器取下圆型耳片，迅速于分析天平称量。各给药组与空白对照组比较，统计数据以

表示，统计方法用t检验法。并计算肿胀抑制率。耳肿胀抑制率(％)＝(空白对照组平均肿胀度－给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100％。结果见表2。

2)小鼠扭体次数实验：取KM小鼠，体重18～22g，雌雄各半，随机分组，分笼饲养，组别同2.2.1项。于实验前24h将小鼠腹部剃毛(面积约2cm×2cm)，每日腹部涂药0.3mL(使其均匀涂抹于剃毛部分为准)2次(即：0.45g生药/只、0.3g生药/只、0.15g生药/只)，共4d。各组分别给予相应药物，阳性组给予双氯芬酸二乙胺乳胶剂在腹部均匀涂抹(0.3g/只)，空白对照组给予同法涂抹生理盐水0.3mL，于末次给药后1h，各组小鼠均ip0.6％醋酸0.2ml/只，于注射后，观察小鼠在15min内的扭体数及扭体潜伏期。并计算各组扭体反应镇痛率。各给药组与空白对照组比较，统计数据以

表示，统计方法用t检验法。镇痛率(％)＝(空白对照组平均扭体次数－给药组平均扭体次数)/空白对照组平均扭体次数×100％。结果见表3。

表2三七姜不同产地乙酸乙酯对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

(n＝10)

注：与空白对照组相比，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

表3三七姜不同产地乙酸乙酯部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响

(n＝10)

注：与空白对照组相比，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

由表2～表3可得，相比于空白对照组，10批不同产地的三七姜乙酸乙酯提取物高剂量组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀以及对醋酸致小鼠扭体反应均具有极显著性差异(P＜0.01)。说明10批不同产地的三七姜乙酸乙酯提取物在镇痛抗炎作用上均能发挥较好的疗效。

2.Pearson相关系数法

基于皮尔逊相关系数的谱效相关性分析将10个不同产地三七姜乙酸乙酯提取物的18个共有色谱峰的峰面积与小鼠耳廓肿胀度(记为β₁)、小鼠扭体次数(记为β₂)导入SPSS23.0统计软件进行Pearson相关性分析，以10个产地的18个共有峰峰面积为自变量，药效指标为因变量，得到指纹图谱中各色谱峰与药效的Pearson相关系数。

1)指纹图谱与小鼠耳廓肿胀度(记为β₁)的相关性分析

利用SPSS23.0统计软件中的双变量相关分析，计算可得到18个共有峰与小鼠耳廓肿胀度的相关数据，见表4。

表4共有色谱峰与β₁的Pearson相关分析结果

^**在0.01水平(双侧)上显著相关

Pearson相关系数的绝对值越大，变量之间的相关性越大。由表4可见，共有峰与β₁的相关分析结果得到，色谱峰号10与β₁之间呈现显著负相关，相关系数为-0.853，色谱峰号18与β₁之间呈显著负相关，相关系数为-0.738。

2)指纹图谱与小鼠扭体次数(记为β₂)的相关性分析

利用SPSS23.0统计软件中的双变量相关分析，计算可得到18个共有峰与小鼠扭体次数的相关数据，见表5。

表5共有色谱峰与β₂的Pearson相关分析结果

^**在0.01水平(双侧)上显著相关

由表5可见，色谱峰号10与β₂之间呈现显著负相关，相关系数为-0.821，色谱峰号18与β₂之间呈显著负相关，相关系数为-0.809。说明色谱峰号10、色谱峰号18与镇痛抗炎作用具有显著相关性。

3.基于灰色关联度的谱效相关性分析

灰色关联度方法主要通过分析各组因素间数据变化过程中的相关联性，判断色谱峰与药效指标之间相关性的大小。当关联度＞0.6时，能判定该峰与药效之间的相关性。

1)原始数据的无量纲化

本实验将10个不同产地三七姜乙酸乙酯部位提取物对小鼠各药效指标设置为母序列λ₀，将10个产地三七姜药材指纹图谱18个共有峰峰面积设置为子序列，记为λ_i，i＝1，2，3…18。并将母序列与子序列灰关联度进行分析。基于子序列与母序列测量的单位或量纲不一致，因此需将原始数据进行无量纲化处理。本研究采用初值化变换法得到无量纲化数列。结果见表6。

表6 10个产地三七姜共有峰峰面积值无量纲化处理

2)绝对差值的计算

将表6中无量纲化处理后的子序列和母序列值代入灰色关联度公式Δi(k)＝│λ′0(k)-λ′i(k)│，求出绝对差最大值，记为Δ_max；绝对差最小值记为Δ_min，并Δ_{耳肿胀抑制}max＝1.7436，Δ_{耳肿胀抑制}min＝0.0053，Δ_扭体镇痛max＝1.7837，Δ_扭体抑制min＝0.0052。

3)18个共有峰与药效降低率的关联系数及关联度计算

将上述计算所得的两级最大差和最小差代入如下公式中：

ρ为分辨系数，在0～1内取值，ρ取值越小，关联度系数差异越大。当分辨系数ρ值取0.6，得到10个不同产地三七姜乙酸乙酯提取物指纹图谱18个共有峰与镇痛抗炎药效指标抑制率之间的关联系数。计算18个共有峰与2个药效指标降低率之间的关联度，用于评价三七姜药材指纹图谱18个共有峰与其镇痛抗炎作用的关联程度。

4)关联度排序

关联度排序以10个不同产地三七姜的乙酸乙酯提取物对小鼠的镇痛、抗炎指标作为参考序列，以峰面积作为比较序列。根据各比较序列与参考序列的关联度数据来确认各色谱峰对镇痛、抗炎作用的贡献大小，并对其进行排序，结果见表7。

表7不同产地三七姜特征峰与镇痛抗炎作用的关联度

由表7可以看出，10个不同产地指纹图谱的18个共有特征峰与二甲苯致小鼠耳轮廓肿胀的抑制率以及对醋酸致小鼠扭体的镇痛率的关联度均在0.65以上，各成分对抗炎作用贡献的大小顺序依次为：λ14＞λ1＞λ17＞λ9＞λ4＞λ2＞λ16＞λ7＞λ6＞λ5＞λ11＞λ12＞λ13＞λ3＞λ8＞λ15＞λ18＞λ10，各成分对镇痛作用贡献的大小顺序依次为：λ1＞λ17＞λ14＞λ9＞λ16＞λ2＞λ4＞λ7＞λ6＞λ5＞λ18＞λ15＞λ3＞λ11＞λ12＞λ13＞λ10＞λ8，由计算结果可知，第14、1(原儿茶酸)、17、9、4(对羟基苯甲醛)、2(对羟基苯甲酸)、16、7、6号共有峰与三七姜乙酸乙酯提取物抗炎药效关联度较其它共有峰关联度较高(关联度＞0.7)；第1(原儿茶酸)、17、14、9、16、2(对羟基苯甲酸)、4(对羟基苯甲醛)号共有峰与三七姜乙酸乙酯提取物镇痛药效关联度较其它共有峰关联度较高(关联度＞0.7)，实验结果表明这些关联度较高的峰包括已知成分原儿茶酸、对羟基甲酸、对羟基苯甲醛等，这些可能是其发挥药效的主要成分。

四、三七姜乙酸乙酯部位的质量分析

1.聚类分析

以18个共有峰的峰面积为原始数据，峰面积相关数据，见表8。运用IBM SPSS 23.0软件对10批三七姜药材进行聚类分析，采用组间平均数联结法，以Euclidean平方距离为度量标准，选用夹角余弦为测度，对10批广西不同产地的三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱数据进行分析，结果见图4。

表8 10批广西不同产地三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱共有峰面积

图4为不同产地三七姜乙酸乙酯部位聚类分类结果图。由表8和图4可见，以系统聚类法结合欧氏距离(d)为测度进行分析，当欧氏距离(d)为15时，10批三七姜药材乙酸乙酯部位分为三类：第一类：S5、S9、S10，第二类：S1、S6、S7、S8，第三类：S2、S3、S4。

2.主成分分析

1)采用SPSS23.0统计软件对原始数据进行标准化处理，再对其进行运算，以主成分的特征值及贡献率为依据，对10批不同产地的三七姜乙酸乙酯部位的18个共有峰进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及其方差，如表9。

表9特征值和方差贡献率

由表9可知，主成分个数的提取原则是取主成分对应的特征值大于1，故取前三个作为主成分，其累计方差贡献率为88.321％，大于理论要求的85％。结果得出第一主成分方差贡献率为54.002％；第二主成分方差贡献率为24.015％；第三主成分方差贡献率为10.304％。

将提取的18个成分和对应的特征值作碎石图，如图5。图5为不同产地三七姜乙酸乙酯部位特征值散点图。斜率越陡贡献越大，反之，斜率越缓贡献越小，通过由图5可见，前三个成分的斜率很陡，之后的成分点的趋势都比较平缓。

2)公共因子旋转矩阵旋转后的公共因子载荷矩阵见表10。对数据矩阵进行PCA后，得到个产地的变量得分，见表11，并在SPSS23.0中以第一、二、三主成分的空间散点坐标系建立3D分布图，得到10个产地样品的PCA空间得分图，见图6。

表10旋转成份矩阵^a

提取方法:主成份。

旋转法:具有Kaiser标准化的正交旋转法。

a.旋转在8次迭代后收敛。

表11三七姜乙酸乙酯部位各产地变量得分

由表10、表11可以得出1、2、3、4、5、10、18峰对第一主成分中的作用较小，其他显示出明显的正相负荷。同理，除1、7、9、10、13、14、15、16、17、18以外，其他峰对第二成分呈现出正相负荷的趋势；除1、2、3、4、5、17以外，其他峰对第三成分呈现出正相负荷的趋势。

图6为不同产地三七姜乙酸乙酯部位主成分分析空间得分图。由图6可见，将广西10批不同产地的三七姜药材乙酸乙酯部位大致分为三类：其中S5、S9、S10为第一大类、S1、S6、S7、S8为第二大类、S2、S3、S4为第三大类。其结果与聚类分析(d＝15)时结果一致。通过本发明方法能够有效的区别不同品质的三七姜。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，其特征在于，是利用三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱与镇痛抗炎建立谱效关系，并基于所述谱效关系建立三七姜质量评价标准；

三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱构建方法：

（1）供试品溶液的制备：

①制备三七姜乙醇提取物：称取三七姜粗粉，粉碎后过16目筛，加入其7-8倍体积量的80%乙醇溶液，加热回流提取2h，重复3次，滤过并收集滤液，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得到乙醇总提取物；

②提取乙酸乙酯部位：将所述乙醇总提取物用纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取至溶液颜色至澄清透明，得到乙酸乙酯萃取部位的药液，减压浓缩，放置水浴蒸干，即得到乙酸乙酯部位提取物，备用；

③制备供试品溶液：取乙酸乙酯部位提取物0.1g，精密称定，用5mL甲醇超声提取5min，加甲醇定容至10mL，过滤，将滤液13000r/min离心10 min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备：各称取对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对羟基苯甲醛对照品，分别加甲醇溶解制备质量浓度分别为 0.212、0.236、0.149 mg/mL的混合对照品溶液；

（3）采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，按照如下色谱条件进行色谱图采集，采用液相工作站对色谱图处理，再导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件中，得到指纹图谱；所述色谱条件为：进样量10μL；以乙腈为流动相B，0.1%磷酸溶液或0.1%甲酸溶液或0.1%冰醋酸溶液为流动相A，进行梯度洗脱:0min→20min、10%→60%B，20min→50min、60%→80% B，50min→65min、80%→100%B，65min→75min、100%B，流速：0.8～1.2mL/min，柱温30℃，检测波长260nm；

色谱柱为规格为4.6×250mm、5μm的 C₁₈键合硅胶柱；所述指纹图谱标定18个色谱峰为共有指纹峰，2号峰为对羟基苯甲酸峰。

2.根据权利要求1所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，其特征在于，所述三七姜乙酸乙酯部位的指纹图谱与镇痛抗炎建立谱效关系，是利用Pearson相关系数法和灰色关联度法共同建立；三七姜镇痛抗炎的研究包括耳廓肿胀度，扭体次数研究。

3.根据权利要求2所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，其特征在于，灰色关联度分析法为：将镇痛抗炎试验中三七姜乙酸乙酯部位提取物对机体各药效指标抑制率设置为参考系列耳廓肿胀度实验为λ₀₁、扭体次数实验为λ₀₂，将不同供试品三七姜指纹图谱18个共有峰峰面积设置为比较数列，记为λ_i，i=1，2，3…18，计算λ₀₁、λ₀₂与λ_i (k)的关联度，并对关联度大小进行排序以判别各峰面积对药效指标的影响力。

4.根据权利要求2所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，其特征在于，Pearson相关系数分析法为：将不同供试品三七姜指纹图谱18个共有峰值的峰面积为自变量，依次用α_1-α₁₈表示；所述耳廓肿胀度β₁、扭体次数β₂为因变量，采用SPSS23.0统计软件，得到指纹图谱中各色谱峰与药效的Pearson相关系数。

5.根据权利要求2所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，其特征在于，所述三七姜质量评价标准是：选择灰色关联度分析中关联度大于0.65，且Pearson相关系数法分析中对三七姜镇痛、抗炎药效的相关呈负相关的指纹峰为特征峰，通过计算所选择特征峰占总峰面积的比例来制定三七姜质量评价标准。

6.根据权利要求1所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，其特征在于，是运用聚类分析法和主成分分析法对不同产地三七姜的指纹图谱共同进行分析，其中，所述聚类分析法是以所述指纹图谱的18个共有峰的峰面积数据，运用SPSS 23.0软件进行聚类分析，以欧式距离作为度量标准，得出树状聚类图, 对不同供试品进行质量评价；所述主成分分析法是以所述指纹图谱的18个共有峰的峰面积数据，采用SPSS 23.0统计软件对数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，选取特征值大于1为主成分，将数据矩阵进行在SPSS 23.0中以主成分的空间散点坐标系建立3D分布图空间图进行分类，对不同三七姜供试品进行主成分分析。

7.根据权利要求6所述三七姜乙酸乙酯部位指纹图谱的质量分析方法，其特征在于，所述三七姜质量分析标准是：选择聚类分析中欧式距离为15时，且通过主成分分析法所得空间得分图中的分类，即可得到不同三七姜供试品的质量分类。

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