CN108982685A - 生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法 - Google Patents

生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理；和(2)采用超高效液相色谱‑质谱联用仪检测所述待测溶液。本发明的检测方法能够检测到生物样品中较多的染料木素代谢产物，从而为阐明染料木素的代谢途径奠定基础。

Description

生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法
技术领域
本发明涉及生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法。
背景技术
染料木素(Genistein，GS)，又称5，7，4′-三羟基异黄酮、染料木苷元、金雀异黄素、染料木黄酮，存在于各类可食性植物中，尤其在葛根、苜蓿、燕麦、槐角、小麦、大麦和广豆根中含量较高。染料木素作为一种活性功能较高的天然酪氨酸激酶，又因其具有与雌激素相似的结构，被称为“植物雌激素”。近年来研究发现染料木素还具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤和防治骨质疏松等活性。目前染料木素已广泛应用于医药、保健品等领域。
目前未发现对染料木素代谢产物的检测方法的报道，其代谢产物成分也未见报道，因而无法确定染料木素在体内的代谢过程。因此，需要一种染料木素的代谢产物的检测方法，以利于阐明染料木素在体内的代谢产物及代谢机制。
发明内容
本发明的目的是建立一种生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法，该方法能够检测到较多的染料木素代谢产物，从而为阐明染料木素的代谢途径奠定基础。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：
(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收染料木素后的含有染料木素及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；
(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：
色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.2vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～3min，5vol％～18vol％B；2～12min，18vol％～55vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：5μL；
质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～500；分辨率40000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的3个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：35～45％。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指生物体正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，涡旋振荡时间为2～10min，离心转速为10000～18000r/min，离心时间为8～20min。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～2倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，12000～14000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1.67倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，13500r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的检测方法，优选地，所述C18固相萃取柱为Grace PureTMSPE C18-Low固相萃取小柱；所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述归一化碰撞能量：38～42％。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述归一化碰撞能量为39～40％。
根据本发明的检测方法，优选地，所述检测方法还包括如下步骤：
(3)对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～25]，H[0～45]，O[0～15]，N[0～5]，S[0～3]，环和不饱和键数[0～20]，质量精度误差在10ppm以内。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述质谱仪为高分辨质谱仪。
本发明的检测方法能够对生物样品中的染料木素及其众多代谢产物进行有效检测。根据本发明优选的实施方式，能够从含药血浆样品和含药尿液样品中检测到包括原型在内的31个染料木素代谢产物。本发明的检测方法为阐明染料木素的体内代谢机制奠定基础，并为进一步进行染料木素的体内药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明提供一种生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)对生物样品的处理步骤，和(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的步骤。任选地，包括(3)对质谱数据进行数据处理的步骤。
<生物样品的处理步骤>
本发明中，生物样品包括含药生物样品，含药生物样品是指生物体(例如人或动物)吸收染料木素后的含有染料木素及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品。
本发明中，生物样品还可以包括空白生物样品，空白生物样品是指生物体(例如人或动物)正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
本发明中，所述动物优选为哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴等。
本发明的含药血浆样品可以通过如下制备方法得到：将含有染料木素及其代谢产物的血液置于肝素钠抗凝EP管中，静置，离心，上清液即为所述血浆样品。其中，静置时间可以为8～120min，优选为8～60min，更优选为10～20min。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明的空白血浆样品可以通过如下制备方法得到：将空白血液(人或动物正常饮食下的血液)置于肝素钠抗凝EP管中，静置，离心，上清液即为所述血浆样品。其中，静置时间可以为8～120min，优选为8～60min，更优选为10～20min。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明的含药尿液样品可以通过如下制备方法得到：将含有染料木素及其代谢产物的尿液离心，上清液即为所述尿液样品。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明的空白尿液样品可以通过如下制备方法得到：将空白尿液离心，上清液即为所述尿液样品。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积、优选为0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积、优选为0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积、优选为0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％、优选为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。所述生物样品为含药生物样品或空白生物样品，相应地，所述待测溶液为含药待测溶液或空白待测溶液。
本发明中，所述的C18固相萃取柱(SPE)可以采用现有文献公开的方法制备或者来自市售，优选采用Grace PureTMSPE C18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)。
本发明中，优选地，所述吹干的方式为常温下采用氮气吹干。
本发明中，所述涡旋振荡时间可以为2～10min，优选为3～6分钟，再优选为3～4min。离心转速可以为10000～18000r/min，优选为12000～16000r/min，更优选为12000～14000r/min。离心时间可以为8～20min，优选为10～18min，更优选为12～15min。
根据本发明优选的实施方式，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～2倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，12000～14000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的一个实施方式，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1.67倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，13500r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
采用本发明方法对生物样品进行处理，一方面能够特异性地除去生物样品中的蛋白等杂质组分，避免蛋白与反相色谱填料的死吸附而保护色谱柱，另一方面减少生物样品中的染料木素及其代谢产物的损失，并对待测溶液中的微量的染料木素及其代谢产物进行富集，从而得到适合采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的待测溶液。
<检测步骤>
本发明的检测方法采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-LTQ-Orbitrap)检测上述待测溶液。所述待测溶液为含药待测溶液或空白待测溶液。具体地，将含药待测溶液和空白待测溶液分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，分别得到相应的图谱，通过二者的对比，确定染料木素代谢产物的位置。这是本领域技术人员公知的，不再赘述。
本发明中，色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.2vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～3min，5vol％～18vol％B；2～12min，18vol％～55vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：5μL。
本发明中，所述色谱柱可以为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。
采用本发明的色谱条件，能够在短时间内实现染料木素及其众多代谢产物的有效分离，有利于进行质谱解析。
本发明中，质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～500；分辨率40000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的3个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：35～45％。
根据本发明优选的实施方式，质谱条件中，归一化碰撞能量为38～42％。更优选地，归一化碰撞能量为39～40％。发明人发现，对于染料木素及其代谢产物，在该条件下能够获得足够丰富的多级质谱碎片离子信息，同时还可保证碎片离子不会发生过度解离，有效地降低了化学成分的结构解析难度。
本发明中，所述质谱仪优选为高分辨质谱仪，例如美国Thermo Fisher公司的LTQ-Orbitrap XL质谱仪，其配有电喷雾离子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站。
采用本发明的质谱条件设定，能够得到足够丰富且总量合适的碎片离子信息，有利于后续对生物样品中染料木素及其代谢产物进行化学结构解析。
本发明的检测方法还可以包括如下步骤：
(3)质谱数据的处理步骤，包括：对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～25]，H[0～45]，O[0～15]，N[0～5]，S[0～3]，环和不饱和键数[0～20]，质量精度误差在10ppm以内。该步骤可以利用采用Xcalibur 2.1工作站进行。本发明的处理方法，特别是上述相关参数的设定，能够在不遗漏重要的碎片离子信息的基础上，使组分的化学结构解析难度有效降低。
采用本发明的检测方法，能够从含药血浆样品和含药尿液样品中共检测到包括原型在内的31个代谢产物，从而为染料木素的药效物质基础和作用机制研究奠定了基础，并为进一步进行染料木素的体内药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行示例性说明。
实施例1
1实验仪器及材料
DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱分析系统：美国Thermo Fisher公司；
LTQ-Orbitrap XL质谱仪：美国Thermo Fisher公司，配有电喷雾离子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站；
Grace PureTMSPE C18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)；
Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统：美国Millipore公司；
R200D型电子分析天平(1/10万)：德国Sartorius公司；
KQ-250DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
染料木素对照品：成都曼思特生物科技有限公司产品(纯度大于98％)；
甲酸(色谱纯)：德国Merck公司；
甲醇(质谱纯)和乙腈(质谱纯)：美国Thermo Fisher公司。
Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，体重220～250g)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2012-0001。
2实验方法
2.1生物样品的制备
称取350mg染料木素对照品，加入8mL 0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，摇匀，制成混悬液，作为给药样品。
实验前，将12只SD大鼠随机分为空白组(6只)和染料木素给药组(6只)，在动物房内适应性喂养1周。受试前，将大鼠置于代谢笼中，禁食12h，全程不禁水。给药组以200mg/kg的剂量给大鼠灌胃染料木素CMC-Na混悬液；空白组大鼠灌胃等体积0.5％CMC-Na溶液。
灌胃给药后的两组大鼠，分别于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0h于眼眶静脉丛下取血0.5mL，置于肝素钠抗凝EP管中，静置15min，离心15min(3000r/min，4℃)。合并上述5个时间点的上清液，涡旋振荡3min，分别得到空白血浆和含药血浆；收集大鼠0～24h内两组大鼠的尿液，离心15min(3000r/min，4℃)，取上清液，分别得到空白尿液和含药尿液。将生物样品-80℃冷冻储存，备用。
2.2生物样品的处理
取C18固相萃取柱，先用5mL甲醇进行活化，再用5mL去离子水进行平衡。取4℃下解冻的1mL尿液或血浆加入到固相萃取柱，依次以5mL去离子水和3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，于室温下用氮气吹干，残渣用80μL 5vol％乙腈溶液复溶，涡旋振荡3min，13500r/min离心15min，取上清液进行分析。
2.3液质联用分析条件
2.3.1色谱条件
色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.2vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～3min，5vol％～18vol％B；2～12min，18vol％～55vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：5μL；
2.3.2质谱条件
电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～500；分辨率40000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的3个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：39％。
2.4高分辨质谱数据处理
利用Xcalibur 2.1工作站对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～25]，H[0～45]，O[0～15]，N[0～5]，S[0～3]，环和不饱和键数[0～20]，质量精度误差在10ppm以内。
3实验结果
通过空白生物样品与含药生物样品图谱，结合色谱保留时间、精确分子量、多级碎片离子等信息的分析，共鉴定了原型在内的31个代谢产物，具体见表1和表2。
表1
序号 tR/min 分子式 相对分子质量 实验相对分子质量 误差
M0 7.99 C15H9O5 269.0444 269.0453 0.84
M1 3.84 C21H19O9 415.1023 415.10590 0.91
M2 3.84 C21H17O10 429.0815 429.0824 0.67
M3 3.85 C15H9O4 253.0495 253.0498 0.27
M4 3.94 C16H11O5 283.0600 283.0608 0.77
M5 4.40 C15H9O5 269.0444 269.0452 0.93
M6 4.59 C15H13O7S 337.0376 337.04047 1.32
M7 4.59 C15H11O4 255.0652 255.0661 0.98
M8 4.59 C21H19O10 431.0972 431.0983 0.67
M9 4.69 C15H9O5 269.0444 269.0453 1.04
M10 4.88 C15H9O7S 333.0063 333.0071 0.89
M11 5.06 C21H19O10 431.0972 431.0983 2.18
M12 5.25 C21H21O9 417.1180 417.1191 0.29
M13 5.25 C15H9O5 269.0444 269.0454 0.96
M14 5.49 C15H9O5 269.0444 269.0453 0.83
M15 5.59 C16H11O6 299.0550 299.0558 0.91
M16 6.43 C15H11O4 255.0651 255.0655 0.37
M17 6.43 C15H9O6 285.0393 285.0403 0.98
M18 6.68 C15H13O4 257.0808 257.0819 1.08
M19 6.68 C16H11O5 283.0600 283.0611 1.00
M20 6.79 C16H13O5 285.0757 285.0760 0.30
M21 6.90 C16H15O5 287.0913 287.0922 0.90
M22 7.66 C15H11O5 271.0600 271.0610 0.83
M23 8.19 C16H11O6 299.0550 299.0555 0.53
M24 8.39 C16H11O6 299.0550 299.0557 0.75
M25 8.73 C16H11O6 299.0550 299.0558 0.84
M26 9.64 C15H11O3 239.0702 239.0710 -0.87
M27 9.64 C15H13O4 257.0808 257.0817 0.90
M28 9.64 C16H15O5 287.0913 287.0921 0.79
M29 9.98 C16H11O4 267.0652 267.0660 0.89
M30 12.11 C15H11O4 255.0652 255.0661 0.99
表2
注：+表示检测到；-表示未检测到。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收染料木素后的含有染料木素及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；
(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：
色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.2vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～3min，5vol％～18vol％B；2～12min，18vol％～55vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：5μL；
质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～500；分辨率40000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的3个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：35～45％。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指生物体正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，涡旋振荡时间为2～10min，离心转速为10000～18000r/min，离心时间为8～20min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～2倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，12000～14000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1.67倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，13500r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述C18固相萃取柱为Grace PureTM SPE C18-Low固相萃取柱；所述色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述归一化碰撞能量：38～42％。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，归一化碰撞能量为39～40％。
9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：
(3)对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～25]，H[0～45]，O[0～15]，N[0～5]，S[0～3]，环和不饱和键数[0～20]，质量精度误差在10ppm以内。
10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述质谱仪为高分辨质谱仪。
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