CN104267128A - 一种利用uplc快速测定豆制品中6种大豆异黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用UPLC快速测定豆制品中6种大豆异黄酮的方法，属于分析化学技术领域。测试豆制品种类包括豆浆、豆腐、素鸡、豆干、百叶、腐竹等，测定大豆苷，大豆苷元，黄豆黄苷，黄豆黄素，染料木苷，染料木素6种大豆异黄酮。首先用甲醇溶液对豆制品中的大豆异黄酮进行提取，收集上清液后，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清液，进行UPLC检测。本发明采用UPLC达到对豆制品中主要的6种大豆异黄酮的组成和含量的快速测定，本方法样品前处理简单，分析速度快，重复性、准确性高，为豆制品质量评价与控制提供高效准确的分析方法手段。

Description

一种利用UPLC快速测定豆制品中6种大豆异黄酮的方法

技术领域

    一种利用UPLC快速测定豆制品中6种大豆异黄酮的方法，属于分析化学技术领域。具体设计一种利用UPLC（超高效液相色谱）测定豆浆、豆腐、素鸡、豆干、百叶、腐竹等豆制品中大豆苷，大豆苷元，黄豆黄苷，黄豆黄素，染料木苷，染料木素6种大豆异黄酮的方法。

背景技术

    大豆异黄酮是指以3-苯并吡喃酮为母核的一系列化合物，包括3种游离型的甙元和结合型的糖苷。糖苷型大豆异黄酮包括葡萄糖甙，乙酰化糖甙和丙二酰化的糖苷等四种。异黄酮甙元比异黄酮葡萄糖苷有更广泛和明显的生物活性和更高的吸收利用率。大豆异黄酮主要来源于豆科植物的荚豆类，其中以大豆中含量最高，是一种天然雌激素，具有抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、预防骨质疏松、神经保护和抗神经退变的作用、抗菌消炎、提高免疫力的作用、防辐射及雌激素样作用。豆制品的食用，尤其是豆浆、豆腐等中国传统食品，是我国人民群众摄入大豆异黄酮重要且主要的途径。

现国内外大豆异黄酮的化学定性、定量检测及分离技术涉及光谱分析、色谱分析、电泳分析，现在多采用HPLC法。UPLC（超高效液相色谱法）具有比HPLC（高效液相色谱法）更快分析速度、更高灵敏度、更高分离度和更小溶剂用量，从而使分析具有优越的效率、准确性、经济性，被越来越广泛的应用于食品安全、食品质量评价与监督、环境检测、药品监督等分析测试领域中。

目前，大豆异黄酮的检测主要集中在大豆中，而对豆制品中大豆异黄酮定性定量的报道较少。如J.C.Gasparetto，F.S.F.Smolarek，T.M.G. de Francisco，L.C.Miranda等人用HPLC-PDA对大豆中6种主要的大豆异黄酮进行了定量分析，而国内李艳，李沁媛，谭涛，张建红等采用HPLC-PDA对豆腐、豆芽、豆干中染料木苷、大豆黄素、染料木素进行测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用UPLC快速测定豆浆、豆腐、素鸡、豆干、百叶、腐竹等豆制品中6种大豆异黄酮的方法。

    本发明采用UPLC同时分离测定6种大豆异黄酮物质，达到对不同豆制品中大豆异黄酮的快速定量，本方法前处理简单，成本低，可同时测定，实现对不同豆制品质量及营养价值的准确评价和监控。

  为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

    一种利用UPLC快速测定豆制品中6种大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：

（1）标准品：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素6种标准品均购自阿拉丁公司；

（2）样品前处理：取 0.1 mL豆浆加入0.9 mL甲醇，或0.1g固体豆制品加入1 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测；

（3）色谱条件

色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈A相及0.1 %甲酸B相，流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 % B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 % A；流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL；

（4）大豆异黄酮含量测定方法的建立

分别称取大豆苷，大豆苷元，黄豆黄苷，黄豆黄素，染料木苷，染料木素6种标准品5 mg （精确到0.01mg），置于25 mL容量瓶中，用甲醇与水的体积比为3:2的甲醇-水溶液定容，配成混合标准样品储备液，于-20℃保存；

用甲醇-水溶液逐级稀释使6种大豆异黄酮含量分别为0.15-20 mg/L；然后以每个浓度下的标准溶液所得的260nm处积分峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，分别建立标准曲线；在检测样品时，根据样品所得的260nm处积分峰面积，分别从标准曲线中读出样品中6种大豆异黄酮的含量。

  本发明的有益效果：本发明显著优点在于根据不同产品，不同加工方式，所测得的多种大豆异黄酮含量分析，对豆制品质量得到快速、准确的识别和评价。本发明利用UPLC测定豆浆、豆腐或腐竹等中6种大豆异黄酮，此方法样品前处理简单、快速，成本低，可同时测定，实现对不同豆制品的识别，同种产品间质量的评价。

附图说明

图1是标准品UPLC图谱；其中1-大豆苷，2-黄豆黄苷，3-染料木苷，4-大豆苷元，5-黄豆黄素，6-染料木素。

具体实施方式

实施例1  豆浆中大豆异黄酮的测定

1、标样：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素购自阿拉丁公司。

2、样品前处理：取 0.1 mL豆浆加入0.9 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下离心机4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测。

3、色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈A相及0.1 %甲酸B相，流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 % B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 % A；

流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL。

表1 豆浆中大豆异黄酮的含量（mg/L）

实施例2 豆腐中大豆异黄酮的测定

1、标样：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素购自阿拉丁公司。

2、样品前处理：取 0.1g豆腐加入1 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下离心机4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测。

3、色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A相）及0.1 %甲酸（B相），流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 % B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 % A；流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL。

表2 豆腐中大豆异黄酮的含量（mg/kg）

实施例3 素鸡中大豆异黄酮的测定

1、标样：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素购自阿拉丁公司。

2、样品前处理：取 0.1g素鸡加入1 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下离心机4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测。

3、色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈A相及0.1 %甲酸B相，流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 %B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 % A；流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL。

表3 素鸡中大豆异黄酮的测定（mg/kg）

实施例4 百叶中大豆异黄酮的测定

1．标样：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素购自阿拉丁公司。

2、样品前处理：取 0.1g百叶加入1 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下离心机4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测。

3、色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈A相及0.1 %甲酸B相，流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 % B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 %A；流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL。

表4 百叶中大豆异黄酮的测定（mg/kg）

实施例5 豆干中大豆异黄酮的测定

1、标样：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素购自阿拉丁公司。

2、样品前处理：取 0.1g豆干加入1 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下离心机4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测。

3、色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A相）及0.1 %甲酸（B相），流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 % B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 % A；流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL。

表5 豆干中大豆异黄酮的测定（mg/kg）

实施例6 腐竹中大豆异黄酮的测定

1、标样：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素购自阿拉丁公司。

2、样品前处理：取 0.1g腐竹加入1 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下离心机4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测。

3、色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A相）及0.1 %甲酸（B相），流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 % B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 % A；流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL。

表6 腐竹中大豆异黄酮的测定（mg/kg）

表7  6种大豆异黄酮的线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种利用UPLC快速测定豆制品中6种大豆异黄酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）标准品：大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素6种标准品均购自阿拉丁公司；

（2）样品前处理：取 0.1 mL豆浆加入0.9 mL甲醇，或0.1g固体豆制品加入1 mL甲醇，超声53kHz提取5 min，涡旋混匀，室温下4000 r/min 离心 3 min，取上清，残渣再用甲醇重复提取2次，合并上清，氮气吹干，过0.22 μm滤膜，待测；

（3）色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18，2.1 mm×100 mm，1.7 μm，流动相为乙腈A相及0.1 %甲酸B相，流动梯度洗脱程序：0-0.5 min：10 % A+90 % B；0.5-10 min：10 % A+90% B - 45% A+55% B；10-13 min：45% A+55% B - 100 % A；流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测波长260 nm；进样量 1 μL；

（4）大豆异黄酮含量测定方法的建立：分别称取大豆苷，大豆苷元，黄豆黄苷，黄豆黄素，染料木苷，染料木素6种标准品各5 mg，精确到0.01mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇与水的体积比为3:2的甲醇-水溶液定容，配成混合标准样品储备液，于-20℃保存；

用甲醇-水溶液逐级稀释使6种大豆异黄酮含量分别为0.15-20 mg/L；然后以每个浓度下的标准溶液所得的260nm处积分峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，分别建立标准曲线；在检测样品时，根据样品所得的260nm处积分峰面积，分别从标准曲线中读出样品中6种大豆异黄酮的含量。