CN105777692A - 大豆异黄酮组分提取及测定方法 - Google Patents

大豆异黄酮组分提取及测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属涉及一种大豆异黄酮组分提取方法，包括以下步骤：（1）向所得大豆粉中加入20～30倍于其重量的体积百分浓度为90%的甲醇溶液；（2）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下超声波处理，再离心4～6min，所得上清液即为大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷的提取液；（3）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下机械震荡，再离心4～6min，所得上清液即为染料木素、黄豆苷元的提取液。提取之后再进行组分测定，包括制作标准曲线、组分测定等步骤。本发明对大豆提取物中异黄酮组分的高效液相色谱测定方法进行了系统的研究，并对样品的前处理条件进行探索，可有效测定大豆提取物中各异黄酮组分的含量。

Description

大豆异黄酮组分提取及测定方法
技术领域
本发明属于农作物提取技术领域，具体涉及一种大豆异黄酮组分提取及测定方法。
背景技术
大豆异黄酮是黄酮类化合物，是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质。由于是从植物中提取，且与雌激素有相似结构，因此，大豆异黄酮又称植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性等，是天然的癌症化学预防剂。随着人们生活水平的提高，对天然生物活性物质的需求正逐渐增大，大豆异黄酮对人体生理代谢有益的调节作用及丰富的大豆资源，为其开发利用展示了广泛的市场前景，目前正越来越受到世界各国的关注。大豆异黄酮是多酚类混合物，大豆异黄酮的组成、存在形式主要包括染料木素、大豆黄素和黄豆黄素，天然情况下它们主要以7-0-葡萄糖甙形式存在。大豆提取物中大豆异黄酮的含量是产品质量的关键指标之一，也是大豆异黄酮产品研究开发中首先必需解决的问题。
我国大豆资源丰富，有很大的发展潜力。大豆在我国的可种植地区广泛，但是种植具有较强的区域性，俗话“百里不引豆”，因此，不同地区生产的大豆质量参差不齐，其异黄酮含量也有很大差异。目前，国家标准依据不同指标将大豆划分等级，但未对异黄酮的含量进行规定。不同等级的大豆价格差异大，鉴于异黄酮的高附加值，把异黄酮含量列入划分大豆等级的标准具有实际意义。因此，首先就需要建立一种简便、快捷的测定异黄酮含量的方法，目前的测定方法主要有比色法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、HPLC法等，比色法干扰多，专一性差，测定结果偏差较大，并需要进行较为复杂的样品前处理；纸色谱法及薄层色谱法存在分离效果差，定量不准确等缺点，气相色谱法采用了样品衍生后进行测定，存在操作繁琐，条件不易控制、杂质干扰严重等问题。
发明内容
针对上述问题，本发明对大豆提取物中异黄酮组分的高效液相色谱测定方法进行了系统的研究，并对样品的前处理条件进行探索，提供了一种大豆异黄酮组分含量的测定方法，可有效测定大豆提取物中各异黄酮组分的含量，为大豆品质分级提供可靠的依据。
为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
设计一种大豆异黄酮组分提取方法，包括以下步骤：
（1）将大豆粉碎，过0.35μm筛，向所得大豆粉中加入20～30倍（优选25倍）于其重量的体积百分浓度为90%的甲醇溶液；
（2）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下超声波处理70～80min，再以8000～12000rpm的离心速度离心4～6min，去除固余物，所得上清液即为大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷的提取液；
（3）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下机械震荡70～80min，再以8000～12000rpm的离心速度离心4～6min，去除固余物，所得上清液即为染料木素、黄豆苷元的提取液。
研究表明大豆异黄酮主要包括染料木素、大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷，这几种成分可以表征出异黄酮含量的高低，并用以评价大豆品质高低。
设计一种测定大豆异黄酮组分含量的方法，包括以下步骤：
（1）制作异黄酮各个组分的标准曲线：
将异黄酮各个组分的标准品分别溶于无水甲醇中，作为标准溶液，并配置成一定的梯度浓度，再利用液相色谱分别制作出各组分对应的标准曲线；
（2）异黄酮组分测定
分别取权利要求1中步骤（2）和步骤（3）所得上清液送入液相色谱仪器，结合上步所得大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、染料木素、黄豆苷元的标准曲线，得到各组分含量。
液相色谱仪检测条件如下：色谱柱：安捷伦L1260，EclipseXDB-C18-USPL1分析柱，规格（mm）：4.6×250，粒径：5μm；柱温：40～42℃；进样体积：10μL；保留时间：35min；流动相：0.1%(v/v)乙酸水溶液(A)和100%甲醇(B)；流速：1mL/min；梯度洗脱：0～20min、29～71%B(v/v)，20~20.01min、70～90%B(v/v)，20.01～22min、90～90%B(v/v)，22.0~22.01min、90～30%B(v/v)，22.01～33.0min、30～30%B(v/v)。
所述染料木素的检测波长：260nm，大豆苷的检测波长：248nm，黄豆黄苷的检测波长：257nm，黄豆苷元的检测波长：250nm，染料木苷的检测波长：260nm。
优选的，步骤（2）所述液相色谱的条件如下：流动相比例：71%甲醇，流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，柱温40～42℃。
本发明具有以下积极有益技术效果：
本发明对大豆提取物中异黄酮组分的高效液相色谱测定方法进行了长期系统的分析研究，并对样品的前处理条件进行了大量的有益的探索试验，提供了一种快速、简便、高效、准确测定大豆异黄酮组分含量的方法，可有效测定大豆提取物中各异黄酮组分的含量，能为大豆品质分级提供可靠的依据。
附图说明
图1为本发明染料木素的HPLC图；
图2为本发明染料木素的标准曲线图；
图3为本发明大豆苷的HPLC图；
图4为本发明大豆苷的标准曲线图；
图5为本发明黄豆黄苷的HPLC图；
图6为本发明黄豆黄苷的标准曲线图；
图7为本发明黄豆苷元的HPLC图；
图8为本发明黄豆苷元的标准曲线图；
图9为本发明染料木苷的HPLC图；
图10为本发明染料木苷的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。
大豆样品：豫豆22号；
仪器：安捷伦L1260高效液相色谱仪，AL204梅特勒-托利多电子天平（万分之一），数显恒温超声波（KQ3200DE），电热恒温干燥箱（DHG-9053A），摇床（IS-RDD3）。
药品及溶剂：HPLC分析使用的流动相甲醇、纯水为色谱级，甲醇、无水乙醇为分析纯，异黄酮组分标准品购置于中国药品生物制品检定所和Sigma公司。
实施例1
一种大豆异黄酮组分含量的测定方法，包括以下步骤：
一、异黄酮各个组分标准曲线的制作：
色谱柱：安捷伦L1260，EclipseXDB-C18-USPL1分析柱，规格（mm）：4.6×250，粒径：5μm；柱温：42℃；染料木素的检测波长：260nm，大豆苷的检测波长：248nm，黄豆黄苷的检测波长：257nm，黄豆苷元的检测波长：250nm，染料木苷的检测波长：260nm；进样体积：10μL；保留时间：35min；流动相：0.1%(v/v)乙酸水溶液(A)和100%甲醇(B)；流速：1mL/min；梯度洗脱：0～20min、29～71%B(v/v)，20～20.01min、70～90%B(v/v)，20.01～22min、90～90%B(v/v)，22.0～22.01min、90～30%B(v/v)，22.01～33.0min、30～30%B(v/v)。
准确称取各个异黄酮标准品5mg，置于100mL容量瓶中，用无水甲醇（色谱纯）溶解（超声波助溶）并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，滤液作为染料木素标准溶液，浓度为50μg/mL。
（1）染料木素
移取染料木素溶液0、1、2、3、4、5mL，分别置于50mL容量瓶中，用无水甲醇定容，浓度分别为0、1、2、3、4、5μg/mL的溶液，4℃下避光保存备用，高效液相色谱测定之前用0.45μm的滤膜过滤除菌；检测波长：260nm。
得到染料木素HPLC图和标准曲线图见图1、2，线性关系方程为：A=0.0079B+0.0061，其中B为峰面积，A为染料木素含量。
（2）大豆苷
移取大豆苷溶液0、2、4、6、8、10mL，分别置于50mL容量瓶中，用无水甲醇定容，浓度分别为0、2、4、6、8、10μg/mL的溶液，-20℃下避光保存备用，高效液相色谱测定之前用0.45μm的滤膜过滤除菌；检测波长：248nm。
得到大豆苷HPLC图和标准曲线图见图3、4，线性关系方程为：A=0.0227B+0.1097，其中B为峰面积，A为大豆苷含量。
（3）黄豆黄苷
移取大豆苷溶液0、0.4、0.6、0.8、1mL，分别置于50mL容量瓶中，用无水甲醇定容，浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1μg/mL的溶液，-20℃下避光保存备用，高效液相色谱测定之前用0.45μm的滤膜过滤除菌；检测波长：257nm。
得到黄豆黄苷HPLC图和标准曲线图见图5、6，线性关系方程为：A=0.0372B-0.0042，其中B为峰面积，A为黄豆黄苷含量。
（4）黄豆苷元
移取黄豆苷元溶液0、2、4、6、8、10mL，分别置于50mL容量瓶中，用无水甲醇定容，浓度分别为0、2、4、6、8、10μg/mL的溶液，-20℃下避光保存备用，高效液相色谱测定之前用0.45μm的滤膜过滤除菌；检测波长：250nm。
得到黄豆苷元HPLC图和标准曲线图见图7、8，线性关系方程为：A=0.0202B-0.0182，其中B为峰面积，A为黄豆苷元含量。
（5）染料木苷
移取染料木苷溶液0、2、4、6、8、10mL，分别置于50mL容量瓶中，用无水甲醇定容，浓度分别为0、2、4、6、8、10μg/mL的溶液，-20℃下避光保存备用，高效液相色谱测定之前用0.45μm的滤膜过滤除菌；检测波长：260nm。
得到染料木苷HPLC图和标准曲线图见图9、10，线性关系方程为：A=0.0202B-0.0182，其中B为峰面积，A为染料木苷含量。
二、异黄酮组分的提取与测定
豫豆22号，用鼎昊源中通量组织研磨仪（TL2010S）粉碎30s，用0.35μm的筛子过筛，用万分之一的天平称取大豆粉样品。
（1）柱温对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉，加入5mL90%的甲醇溶液，60℃条件下超声80min，样品离心速度10000rpm，离心时间5min；流动相比例：71%甲醇，流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件下，研究不同柱温对大豆异黄酮含量的影响。
比较35℃、37℃、40℃、42℃、45℃等5种柱温对大豆异黄酮提取量的影响（表1）。结果表明，在45℃条件下，大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷含量最高，但是染料木素和黄豆苷元未被分离出来。在35和37℃条件下，只有大豆苷、黄豆黄苷和染料木素被检测出来。在40和42℃条件下，5个异黄酮组分均被分离出来，且含量差异不显著，但是42℃柱温条件下分离出来的5种异黄酮组分相对高于40℃柱温，因此，可选择42℃作为最佳柱温。
表1：柱温对样品异黄酮含量的影响
。
（2）流动相比例对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉，加入5mL90%的甲醇溶液，60℃条件下超声80min，样品离心速度10000rpm，离心时间5min；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件在，研究不同流动相比例对大豆异黄酮提取量的影响。
比较72%、71%、70%、69%、68%等5种流动相比例对大豆异黄酮提取量的影响（表2）。结果表明，68%甲醇为流动相时，未能分离出染料木素和黄豆苷元。在流动相比例为69～72%甲醇的条件下，5种异黄酮组分均被检测到，其中以72%甲醇检测到的含量最高，但是其峰值较差和对称因子较大；因此，选择71%甲醇作为最佳流动相比例。
表2：流动相比例对样品异黄酮含量的影响
。
（3）提取液比例对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉，分别加入5mL不同浓度的甲醇溶液，60℃条件下超声80min，样品离心速度10000rpm，离心时间为5min；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件，研究不同提取液比例对大豆异黄酮提取量的影响（表6）。
比较100%、90%、80%、70%、60%、50%等提取液比例对大豆异黄酮提取量的影响。结果表明，在50~90%甲醇提取液下，随着甲醇浓度的下降，5种异黄酮组分呈下降趋势，以90%甲醇为提取液是含量最高，并且高于100%甲醇为提取液。因此，可选择90%甲醇作为最佳提取液比例。
表3：提取液比例对样品异黄酮含量的影响
。
（4）料液比对异黄酮含量的影响
取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g大豆粉，分别加入5mL90%的甲醇溶液，60℃条件下超声80min，样品离心速度10000rpm，离心时间为5min；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件在，研究料液比对大豆异黄酮提取量的影响（表5）。
比较0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g等样品量对大豆异黄酮提取量的影响。结果表明，在0.1g的样品量下，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷和染料木素等被检测出来，而黄豆苷元未被检测出来。0.2g条件下检测到的5种异黄酮组分最高于其他配料比。因此，选择0.2g/5mL为最佳料液比配比。
表4：料液比对样品异黄酮含量的影响
。
（5）样品离心时间对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉，加入5mL90%的甲醇溶液，60℃条件下超声80min，样品离心速度10000rpm；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件在，研究样品离心时间对大豆异黄酮提取量的影响（表3）。
比较3min、5min、7min等3种样品离心时间对大豆异黄酮提取量的影响。结果表明，3种样品离心时间下5种异黄酮组分差异不显著，所以选择5min作为样品离心时间；因为5min条件下，样品杂质沉淀较好，上清液中杂质相对较少，用除菌器过滤效果较好。
表5：样品离心时间异黄酮含量的影响
。
（6）离心速度对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉，分别加入5mL90%甲醇溶液，60℃条件下超声80min，样品用不同离心速度，离心时间为5min；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件在，研究离心速度对大豆异黄酮提取量的影响（表7）。
比较5000rpm、8000rpm、10000rpm等3种离心速度对大豆异黄酮提取量的影响。结果表明，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、染料木素和黄豆苷元等5种异黄酮组分随着离心速度的增加而增加，选择10000rpm作为最佳离心速度。
表6：离心速度对样品异黄酮含量的影响
。
（7）超声时间对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉，加入5mL90%的甲醇溶液，60℃条件下超声，样品离心速度10000rpm，离心时间为5min；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件在，研究超声时间对大豆异黄酮提取量的影响（表4）。
比较20、40、60、70、80min等5种超声时间对大豆异黄酮提取量的影响。结果表明，随着超声时间的增加，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷和染料木素含量增加，而黄豆苷元随着超声时间的增加而下降。说明超声会破坏黄豆苷元物质。因此，选择80min作为最佳超声时间。
表7：样品超声时间对样品异黄酮含量的影响
。
（8）超声温度对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉，加入5mL90%的甲醇溶液，10、20、30、40、50、60、70、80℃条件下超声，样品离心速度10000rpm，离心时间为5min；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件在，研究超声温度对大豆异黄酮提取量的影响（表4）。
比较10、20、30、40、50、60、70、80℃等8种超声温度对大豆异黄酮提取量的影响。结果表明，在10~70℃随着超声温度的增加，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷和黄豆苷元含量增加，而染料木素随着超声温度的增加未有显著变化。但是由于提取液（80%甲醇）在70℃已沸腾，所以使用60℃提取，通过增加提取时间，同样可以达到70℃时的效果。
表8：样品超声温度对样品异黄酮含量的影响
。
（9）震荡时间对异黄酮含量的影响
取0.2g大豆粉、分别加入5mL90%甲醇溶液，20℃条件下分别震荡12h、24h、48h，离心速度8000rpm，离心时间为5min；柱温：42℃、流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，波长：248、250、257、260nm等条件在，研究震荡时间对大豆异黄酮提取量的影响（表7）。
在室温条件下，比较12h、24h、48h等3种震荡时间对大豆异黄酮提取量的影响。结果表明，异黄酮含量随着震荡时间的增加而增加；其中大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷等在震荡条件下的含量显著低于超声条件，而染料木素和黄豆苷元震荡条件下提取比超声条件下显著增加，说明超声会破坏染料木素和黄豆苷元。综上所述，建议采用，建议采用超声条件提取大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷；采用震荡方法提取染料木素和黄豆苷元。
表9：震荡时间对样品异黄酮含量的影响
。

Claims (6)

1.一种大豆异黄酮组分提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将大豆粉碎，过0.35μm筛，向所得大豆粉中加入20～30倍于其重量的体积百分浓度为90%的甲醇溶液；
（2）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下超声波处理70～80min，再以8000～12000rpm的离心速度离心4～6min，去固余物，所得上清液即为大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷的提取液；
（3）将步骤（1）所得混合物于60～70℃条件下机械震荡70～80min，再以8000～12000rpm的离心速度离心4～6min，去除固余物，所得上清液即为染料木素、黄豆苷元的提取液。
2.根据权利要求1所述大豆异黄酮组分提取方法，其特征在于：步骤（1）所述甲醇溶液是大豆粉重量的25倍。
3.一种大豆异黄酮组分测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制作标准曲线：
取异黄酮组分染料木素、大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、黄豆苷元的标准品分别溶于无水甲醇中，作为标准溶液，并配置成一定的梯度浓度，再利用液相色谱仪分别制作出各组分对应的标准曲线；
（2）异黄酮组分测定
分别取权利要求1中步骤（2）和步骤（3）所得上清液送入液相色谱仪，结合上步所得大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、染料木素、黄豆苷元的标准曲线，得到各组分含量。
4.根据权利要求3所述大豆异黄酮组分测定方法，其特征在于：在利用液相色谱仪制作标准曲线和组分测定过程中，所述染料木素的检测波长：260nm，所述大豆苷的检测波长：248nm，所述黄豆黄苷的检测波长：257nm，所述黄豆苷元的检测波长：250nm，所述染料木苷的检测波长：260nm。
5.根据权利要求3所述大豆异黄酮组分测定方法，其特征在于：所述液相色谱仪的参数为：色谱柱：安捷伦L1260，EclipseXDB-C18-USPL1分析柱，规格：4.6×250mm，粒径：5μm；柱温：40～42℃；进样体积：10μL；保留时间：35min；流速：1mL/min；流动相：体积百分浓度0.1%乙酸水溶液和100%甲醇；梯度洗脱：0～20min、体积百分比29～71%甲醇，20～20.01min、体积百分比70～90%甲醇，20.01～22min、体积百分比90～90%甲醇，22.0～22.01min、体积百分比90～30%甲醇，22.01～33.0min、体积百分比30～30%甲醇。
6.根据权利要求3所述大豆异黄酮组分测定方法，其特征在于：步骤（2）所述液相色谱仪的条件如下：流动相比例：体积百分浓度71%甲醇，流量：1mL/min，进样体积：10μL，保留时间：35min，柱温40～42℃。
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