CN109828045A - 一种超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法，待测酒样经甲醇萃取后，采取BEH C₁₈合相专用色谱柱为分离柱，以二氧化碳(A)+异丙醇(B)为流动相进行梯度洗脱，样品经超高效合相色谱(UPC²)分离后，采用QDa质谱检测器进行检测。本发明方法简单快捷、准确可靠，可用于同时检测白酒中13种异黄酮的含量。

Description

一种超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种 异黄酮的方法

技术领域

本发明涉及一种超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法，属于酒类分析技术领域。

背景技术

异黄酮主要存在于大豆、红三叶草以及葛根的植物中。这些植物中发现的12种主要异黄酮为黄豆苷元、黄豆黄素、染料木素及其各自的葡萄糖苷以及丙二酰基和乙酰基葡萄糖苷衍生物。这些类激素化合物通常作为补救措施用于减轻绝经期和绝经后症状。它们甚至还可降低亚洲的乳腺癌发病率，并减缓阿尔茨海默病的进展。

USP1和AOAC2等机构已建立分析膳食补充剂中异黄酮的标准方法。这些方法采用配备C18色谱柱以及紫外和可见光(UV-Vis)光谱的反相LC进行分离和定量。由于这些化合物具有结构相似性，因此这些方法的色谱运行时间通常会超过70min。因此，开发更快速的异黄酮分析方法是十分必要的。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，旨在提供一种超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法。本发明可以为酒类产品中异黄酮检测的准确判定、快速检测提供科学依据。

本发明所述13种异黄酮为黄豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、黄豆苷元、黄豆黄素、染料木素、芹菜素、丙二酰基黄豆苷、丙二酰基黄豆黄苷、乙酰基黄豆苷、乙酰基黄豆黄苷、乙酰基染料木苷以及丙二酰基染料木苷。

本发明将USP方法(异黄酮粉末提取物)转换至配备合相BEH C18色谱柱(2.7μm，3x100mm)的ACQUITY UPC²系统，建立了一种同时检测酒类产品中13种异黄酮的方法。本发明前处理简单，检测方法科学准确，而且流动相添加剂从0.05％磷酸变为0.1％甲酸，得到兼容MS的添加剂。

本发明所用仪器为：配有QDa检测器的超高效合相色谱仪、色谱柱为BEH C18色谱柱(3.0×100mm，1.7μm)；涡旋仪及移液枪。

本发明超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法，包括如下步骤：

步骤1：13种异黄酮类物质的标准曲线的绘制

取黄豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、黄豆苷元、黄豆黄素、染料木素、芹菜素、丙二酰基黄豆苷、丙二酰基黄豆黄苷、乙酰基黄豆苷、乙酰基黄豆黄苷、乙酰基染料木苷以及丙二酰基染料木苷配制质量浓度范围在12.5～250ng/mL的混合系列标准工作溶液，然后分别取各混合系列标准工作溶液1～1.5mL进样，用UPC²串接QDa检测器检测，以待测物的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，获得13种异黄酮物质的线性回归方程，各线性回归方程所对应的曲线，即为相应异黄酮的标准曲线；

混合系列标准工作溶液中各组分的质量浓度控制在12.5～250ng/mL，各组分在混合系列标准工作溶液中的质量浓度分别至少为六个不同的点值。

所述13种异黄酮对应的线性回归方程及相关系数r²见表1。

表1：13种异黄酮的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限

步骤2：待测酒样的前处理

准确量取1.0～5.0mL待测白酒酒样于10mL塑料离心管中，加入8～10mL 80vt％的甲醇溶液，涡旋1～5min，1000转/分钟离心5～10min，0.22μm滤膜针头过滤器过滤，获得待测样品，待进样；

步骤3：待测酒样的检测

取步骤2前处理后的待测样品1.0～2.0mL，进行UPC²检测，通过使用QDa扫描检测，获得待测样品的色谱图，对待测白酒酒样根据选择离子进行定性分析，然后根据13种异黄酮的标准曲线对待测酒样进行定量分析。

本发明检测条件设定如下：

超高效合相色谱仪的检测条件为：

色谱柱为BEH C₁₈色谱柱(3.0×100mm，1.7μm)；柱温为30～50℃；

样品室温度为10～20℃；

流动相：A相为二氧化碳，B相为异丙醇；流速为2～3mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；进样量为1～3μL；检测所用时间为8～15min；ABPR压力为1885～2200psi；

梯度洗脱参数设置如下：0min，异丙醇的体积分数为5-10％；0-4min，异丙醇的体积分数从5-10％升至80-90％，并保持0.5min；4.5-8.5min，异丙醇的体积分数从80-90％降至5-10％；8.5-12.0min，异丙醇的体积分数保持5-10％。

设定QDa检测器的条件为：

系统：ACQUITY QDa质谱检测器，Performance模式；

离子化方式：ESI+；

监测方式：离子监测(SIR)；

喷雾电压：1.3kV；

离子源温度：550～600℃；

选择离子监测方式的各异黄酮物质的质谱参数表如表2所示。

表2：选择离子监测方式的质谱参数表

序号	异黄酮名称	选择离子(m/z)	锥孔电压(v)
				1	黄豆苷	417.1	2
2	黄豆黄苷	447.0	5
				3	染料木苷	433.1	10
4	黄豆苷元	254.9	5
				5	黄豆黄素	285.0	5
6	染料木素	270.9	10
				7	芹菜素(IS)	270.9	15
8	丙二酰基黄豆苷	503.4	6
				9	丙二酰基黄豆黄苷	533.1	12
10	乙酰基黄豆苷	459.1	8
				11	乙酰基黄豆黄苷	489.0	25
12	丙二酰基染料木苷	519.0	16
				13	乙酰基染料木苷	475.1	25

对本发明方法作如下灵敏度测试：灵敏度测试包括仪器的灵敏度与方法的灵敏度，仪器的灵敏度用仪器的检出限表示，取信噪比≥3的异黄酮的混合标准溶液的最小浓度为仪器检出限；方法的灵敏度用方法的定量限表示，取信噪比≥9的异黄酮混合标准溶液的最小浓度为方法定量限。所得的相关数据见表1。

对本发明方法作如下准确性及重现性实验：选用同一个白酒样品经前处理后作为空白样品，分为3份，分别加入混合标准工作溶液进行加标回收实验，计算回收率；选取1个保健酒样品按照同一前处理方法处理6个，分别进行实验，通过计算其相对标准偏差(RSD)的范围来判断分析方法的重现性。方法的准确性用回收率来表示，见表3，方法的重现性用相对标准偏差(RSD)来表示，见表4。可以看出回收率在80～120％，RSD＜10％。

表3：13种异黄酮的加标回收率实验

表4：13种异黄酮的重现性实验

本发明使用QDa质谱检测器检测，采用选择离子扫描模式(SIR)，灵敏度满足酒类样品低限量检测要求，同时该检测器使用方便，即插即用，不需要进行调谐，能够快速的检测酒类产品中13种异黄酮。13种异黄酮的检出限量完全能够满足酒类样品的低含量测定要求，各化合物回收率、重现性均满足定量测试要求。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明建立了一种利用超高效合相色谱串接QDa检测器同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法，能够准确地对酒类产品中的异黄酮进行定性、定量，为酒类产品及膳食中异黄酮的准确判定、快速检测提供科学依据。

2、本发明超高效合相色谱串接QDa质谱检测器操作简单快捷、准确可靠、重复性好。

3、本发明BEH C₁₈合相专用色谱柱(3.0×100mm，1.7μm)与CO₂和异丙醇流动相的选择对酒类产品中13种异黄酮达到了优异的分离效果。

4、本发明通过使用QDa检测器，不需要复杂的前处理条件，经过萃取后，直接进样测试异黄酮。

5、本发明的检测方法是一项环保的“绿色”技术。分析中采用的主要流动相二氧化碳来自于其它工业释放的回收二氧化碳，实验中的使用二氧化碳不会再产生新的温室气体。使用此方法时，每次进样所消耗的改性剂(异丙醇)仅为0.9～1.0mL，与同类检测方法相比，降低了85～90％的有机溶剂使用量。

6、本发明通过减少实验室消耗品的使用可以节约成本。

7、流动相添加剂从0.05％磷酸变为0.1％甲酸，得到兼容MS的添加剂。

附图说明

图1为13种异黄酮标准工作溶液的液相色谱图。图1中峰的出峰顺序依次为：1黄豆苷；2黄豆黄苷；3染料木苷；4丙二酰基黄豆苷；5丙二酰基黄豆黄苷；6乙酰基黄豆苷；7乙酰基黄豆黄苷；8丙二酰基染料木苷；9黄豆苷元；10黄豆黄素；11乙酰基染料木苷；12染料木素；13芹菜素。

具体实施方式

为阐明对本发明的理解，下面结合具体的实施例对本发明技术方案做进一步的阐述。

本实施例按如下步骤对酒类产品中13种异黄酮进行测定：

所用仪器为：超高效合相色谱仪(配有QDa检测器)；BEH C₁₈合相专用色谱柱(3.0×100mm，1.7μm)；涡旋仪；移液枪。

具体步骤为：

1、13种异黄酮类物质的标准曲线的绘制

取黄豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、黄豆苷元、黄豆黄素、染料木素、芹菜素、丙二酰基黄豆苷、丙二酰基黄豆黄苷、乙酰基黄豆苷、乙酰基黄豆黄苷、乙酰基染料木苷以及丙二酰基染料木苷，配制1～2mg/L的储备液，然后分别将其稀释5个不同浓度值的混合系列标准工作溶液，然后分别取1.0～2.0mL混合系列标准工作溶液进样，用超高效合相色谱仪串接QDa质谱仪检测(谱图如图1所示)，以待测物的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，获得13种异黄酮的线性回归方程，各线性回归方程所对应的曲线，即为相应异黄酮的标准曲线；所述13种异黄酮对应的线性回归方程及相关系数r²见表1。

2、待测酒样的前处理

准确量取1.0mL待测白酒酒样于10mL塑料离心管中，加入9mL(体积浓度)为80％的甲醇溶液，涡旋5min，1000转/分钟离心10min，0.22μm滤膜针头过滤器过滤，获得待测样品，待进样；

3、待测酒样的检测

取步骤2前处理后的待测样品1.0～2.0mL，进行UPC²检测，通过使用QDa扫描检测，获得待测样品的色谱图，对待测白酒酒样根据选择离子进行定性分析，然后根据13种异黄酮的标准曲线对待测酒样进行定量分析。

本发明检测条件设定如下：

超高效合相色谱仪的检测条件为：

色谱柱为BEH C18色谱柱(3.0×100mm,1.7μm)；柱温为45℃；

样品室温度为20℃；

流动相：A相为二氧化碳，B相为异丙醇；流速为2.0mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；进样量为2μL；检测所用时间为12min；ABPR压力为1885psi；洗脱方式为梯度洗脱；洗脱程序如下：0min，异丙醇的体积分数为10％；0-4min，异丙醇的体积分数从10％升至90％，并保持0.5min；4.5-8.5min，异丙醇的体积分数从90％降至10％；8.5-12.0min，异丙醇的体积分数保持10％。具体的，梯度洗脱各阶段的变化曲线均选择所用仪器中的曲线6。

设定QDa检测器的检测条件为：

系统：ACQUITY QDa质谱检测器，Performance模式；

离子化方式：ESI+；

监测方式：选择离子监测(SIR)；

喷雾电压：1.3kV；

离子源温度：600℃。

部分样品中13种异黄酮的含量如表5所示：

表5：3个保健酒中13种异黄酮的含量

Claims (4)

1.一种超高效合相色谱串接QDa同时快速检测酒类产品中13种异黄酮的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：13种异黄酮类物质的标准曲线的绘制

取黄豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、黄豆苷元、黄豆黄素、染料木素、芹菜素、丙二酰基黄豆苷、丙二酰基黄豆黄苷、乙酰基黄豆苷、乙酰基黄豆黄苷、乙酰基染料木苷以及丙二酰基染料木苷配制不同浓度的混合系列标准工作溶液，然后分别取各混合系列标准工作溶液1～1.5mL进样，用UPC²串接QDa检测器检测，以待测物的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，获得13种异黄酮物质的线性回归方程，各线性回归方程所对应的曲线，即为相应异黄酮的标准曲线；

步骤2：待测酒样的前处理

准确量取1.0～5.0mL待测白酒酒样于10mL塑料离心管中，加入8～10mL 80vt％的甲醇溶液，涡旋1～5min，1000转/分钟离心5～10min，0.22μm滤膜针头过滤器过滤，获得待测样品，待进样；

步骤3：待测酒样的检测

取步骤2前处理后的待测样品1.0～2.0mL，进行UPC²检测，通过使用QDa扫描检测，获得待测样品的色谱图，对待测白酒酒样根据选择离子进行定性分析，然后根据13种异黄酮的标准曲线对待测酒样进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

混合系列标准工作溶液中各组分的质量浓度控制在12.5～250ng/mL，各组分在混合系列标准工作溶液中的质量浓度分别至少为六个不同的点值。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

超高效合相色谱仪的检测条件为：

色谱柱为BEH C₁₈色谱柱，3.0×100mm，1.7μm；柱温为30～50℃；

样品室温度为10～20℃；

流动相：A相为二氧化碳，B相为异丙醇；流速为2～3mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；进样量为1～3μL；检测所用时间为8～15min；ABPR压力为1885～2200psi；

设定QDa检测器的条件为：

系统：ACQUITY QDa质谱检测器，Performance模式；

离子化方式：ESI+；

监测方式：SIR离子监测；

喷雾电压：1.3kV；

离子源温度：550～600℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

梯度洗脱参数设置如下：0min，异丙醇的体积分数为5-10％；0-4min，异丙醇的体积分数从5-10％升至80-90％，并保持0.5min；4.5-8.5min，异丙醇的体积分数从80-90％降至5-10％；8.5-12.0min，异丙醇的体积分数保持5-10％。