CN112147253A - 一种灵芝酒中42种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灵芝酒中42种有效成分的UPC2‑PDA‑Q‑Tof/MS检测方法，通过标准品的准备、样品前处理、色谱条件、质谱条件和定性定量方法的建立等步骤快速测定42种灵芝有效成分。本发明前处理简单，线性相关系数大于0.99，回收率85％‑115％之间，相对标准偏差在10％以内，说明本发明方法能运用于灵芝酒中有效成分的定性定量分析，可为灵芝酒的质量把控提供重要参考意义。

Description

一种灵芝酒中42种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法
技术领域
本发明属于功能酒领域，具体涉及一种灵芝酒中42种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS 检测方法。
背景技术
我国酿酒历史悠久，品种繁多，以白酒、果酒和米酒居多，但是这类酒一般度数偏高，过量饮用会对身体产生危害。随着人们对自身健康的关注，各种低度数的药酒应运而生，灵芝酒就是其中之一。灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。灵芝是中医药宝库中的珍品，素有“仙草”之誉。古今药理与临床研究均证明，灵芝确有防病治病、延年益寿之功效。《本草经集注》曰：此六芝皆仙草之类，俗所稀见，族种甚多，形色环异，并载《芝草图》中。现代药理学与临床实践进一步证实了灵芝的药理作用，并证实灵芝多糖是灵芝扶正固本、滋补强壮、延年益寿的主要成分。国内对灵芝的研究颇多，现已探明其化学成分已超过200 种，主要活性成分近白种。
人们将灵芝和酒结合在一起制作灵芝酒，灵芝酒制作简单，同时兼具灵芝的营养成分，长期适量饮用有一定的养生保健作用。然而，在目前灵芝酒的制作过程中，出现了各种各样、五花八门的工艺，有直接浸泡的，有煮酒的，有粉碎浸泡的，有高度、低度浸泡的的，有减压萃取的，还有加菌发酵的，但是各种提取方式对有效成分的提取率差异很大，而且灵芝有效成分种类多，各种物质的溶出情况不尽相同，这也阻碍了灵芝酒的发展。
目前现有资料显示灵芝有效成分的检测方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，质谱法，薄层色谱法等，检测通量少，不能整体反应出灵芝有效成分的含量，且效率低，费时。
超临界流体色谱法(Supercritical Fluid Chromatography，SFC)技术是以超临界状态的 CO2为流动相，在超临界状态下的CO2，黏度系数较低、传质性能好、分离效率高且绿色环保，这些优势都突破了传统液相色谱局限性。优以超高效合相色谱(UltraPerformance Convergence Chromatography，UPC2)为代表的新型色谱分离技术弥补了这传统色谱的限制，在流动相上将GC和LC技术结合，分离分析能力兼具GC、LC的两项优势。高分辨飞行时间质谱(Time of Flight Mass Spectrometer，TOF)具有分辨率高、速度快、质量上限高、分析通量高等优点，可实现高达几百种物质的采集分析。
发明内容
本发明针对上述现有技术的问题，提供了一种灵芝酒中42种有效成分的 UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法。本发明方法能够准确、快速、稳定、高效的对灵芝酒中有效成分进行定性定量分析，为灵芝酒的质量把控提供重要参考意义。
本发明灵芝酒中42种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法，首先将灵芝酒待测酒样冷冻干燥成固体，以甲酸-水-甲醇混合溶液溶解后过0.22μm滤膜，经UPC2 BEH柱进行梯度洗脱分离，同时采集UPC2-PDA模式及MS模式数据，ESI正负离子模式下分别监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过MS模式标准曲线线性回归方程对各有效成分进行定量。
本发明灵芝酒中42种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法，包括如下步骤：
步骤1：前处理
将灵芝酒待测酒样冷冻干燥成固体，以0.4％甲酸-5％水-94.6％甲醇混合溶液溶解后过 0.22μm滤膜；
步骤2：标准品的配制
分别配制1g/L的β-谷甾醇、灵芝醛A、灵芝酸S、灵芝醇A、灵芝酸Y、丹芝醇B、灵芝酸X、灵芝醇F、硬脂酸、油酸、胡萝卜苷、灵芝马酮、灵芝酮三醇、棕榈酸、灵芝酸F、灵芝酸C1、灵芝烯酸D、赤芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸F、灵芝酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸H甲酯、灵芝酸C2、灵芝烯酸C、灵芝烯酸E、灵芝孢子酸A、灵芝酸K、灵芝酸H、灵芝内酯B、灵芝酸C6甲酯、灵芝酸I、灵芝酸G、sinensine、灵芝碱甲、安息香酸、烟酸、甜菜碱、肉毒碱、甘露醇、及赤芝孢子内酯A的标准溶液，溶剂为甲酸-水-甲醇溶液，将42种灵芝有效成分的标准溶液混合并逐级稀释，获得不同浓度的混合标准品溶液；
步骤3：标准谱图与标准曲线的绘制
将步骤2配制的不同浓度的混合标准品溶液进行色谱洗脱分离，利用PDA和MS模式进行采集，获得42种灵芝有效成分标准品的标准谱图，以每种有效成分的峰面积为纵坐标，该标准品的浓度为横坐标，获得相应的标准曲线，线性回归方程及相对标准偏差见下表1：
表1灵芝42种有效成分标准曲线
Figure RE-GDA0002741811300000021
Figure RE-GDA0002741811300000031
Figure RE-GDA0002741811300000041
步骤4：待测样品的检测
将经步骤1前处理后的待测酒样经UPC2 BEH柱进行梯度洗脱分离，同时采集UPC2-PDA 模式及MS模式数据，ESI正负离子模式下分别监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，利用保留时间和分子量进行定性，通过标准曲线线性回归方程进行定量。
本发明采用的色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPC2，BEH，2.1×50mm，1.7μm；
进样量：2μL；
柱温：55℃流动相：流动相A CO2，流动相B甲酸-水-甲醇混合溶液，流速：1.5mL/min；梯度洗脱程序为：初始条件为2％的流动相B，流动相B在2min内增加至50％，达到50％后保持1.5min，然后0.1min内流动相B返回到2％，重新平衡系统3.0min；整个循环时间为10.0min。
本发明检测条件设置如下：
PDA检测器波长：254nm；
MS模式；
ESI+电离模式条件：毛细管电压：3.0kV；取样锥孔电压：21V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000L/H；参比质量：亮氨酸脑啡呔[M+H]+＝556.2766；
ESI-电离模式条件：毛细管电压：2.5kV；取样锥孔电压：21V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000L/H；参比质量：亮氨酸脑啡呔[M-H]-＝554.2615；采集范围：m/z 50～1200。
为了确保定性的准确性，可通过TIC窗口提取PDA检测数据，利用PDA检测的保留时间、ESI检测的保留时间及分子量三个参考值，对比标准品和样品，以此确保定性的准确性。灵芝酸C1、灵芝烯酸D、赤芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸C2、灵芝酸G在254nm下的保留时间分别为1.06、1.11、1.13、1.24、2.28、2.89、3.12、 3.45、4.15，与ESI离子源检测的保留时间一致。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明前处理简单，线性相关系数大于0.99，回收率85％-115％之间，相对标准偏差在 10％以内，说明本发明方法能运用于灵芝酒中有效成分的定性定量分析，可为灵芝酒的质量把控提供重要参考意义。
附图说明
图1为灵芝酒ES+模式总离子流图。
图2为灵芝酒ES-模式总离子流图。
图3为灵芝酸A提取离子色谱图。
图4为灵芝酸C1、赤芝酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸C2、灵芝酸G在254nm 处的色谱图。
具体实施方式
为便于理解本发明，下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1.1试剂、药品
42种灵芝有效成分标准物质(纯度>95％，上海安谱/上海源叶)，单标储备溶液(400ug/L)，由50％甲醇水配置，-20℃避光保存。
1.2仪器设备
Waters ACQUITY
Figure RE-GDA0002741811300000051
I-Class系统
Figure RE-GDA0002741811300000052
G2-XS QTof质谱仪，配有光电二极管矩阵 (PDA)检测器、电喷雾离子源(ESI)；Waters ACQUITY
Figure RE-GDA0002741811300000053
I-Class系统UPC2合相色谱仪，配有515pump。
1.3样品前处理
将待测样品冷冻干燥后，加入2mL甲酸-水-甲醇混合溶液，混匀后过0.22μm滤膜待测。
1.4 UPC2-PDA-Q-TOF/MS检测
将待测液通过超高效合相色谱系统对各化合物进行分离，采用配有电喷雾离子源的 UPC2-Q-Tof，分别采用ES+和ES-两种模式先后进行采集；色谱条件：色谱柱：ACQUITYUPC2，BEH，2.1×50mm，1.7μm。流动相：流动相A CO2，流动相B含0.4％甲酸、2％水的甲醇，流速：1.5mL/min，PDA设置波长254nm，梯度洗脱；初始条件为2％的流动相B。流动相B在2min内增加至50％，达到50％后保持1.5min。然后0.1min内流动相B返回到2％，重新平衡系统3.0min。整个循环时间为10.0min。进样量：2μL；柱温：55℃。
质谱条件：
Figure RE-GDA0002741811300000062
G2-XS QTof质谱仪；采集模式：MS模式；ESI+电离模式条件：毛细管电压：3.0kV；取样锥孔电压：40V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000L/H；参比质量：亮氨酸脑啡呔[M+H]+＝556.2766；ESI-电离模式条件：毛细管电压：2.5kV；取样锥孔电压：40V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000L/H；参比质量：亮氨酸脑啡呔[M-H]-＝554.2615。采集范围：m/z 50～1200。
1.5含量计算
根据各有效成分标准品制成各标准曲线，再利用标准曲线计算各样品中有效成分的含量。
各有效成分信息及标准曲线下表所示。
Figure RE-GDA0002741811300000061
Figure RE-GDA0002741811300000071
实施例1：浸泡酒样测定
浸泡酒样前处理：将市场购买的500g灵芝浸泡于5000mL白酒中，每天搅拌一次，30天后，取50mL灵芝酒于50mL离心管中冷冻干燥，加入2mL甲酸-水-甲醇混合溶液，混匀后过0.22μm滤膜待测；
浸泡酒样中42种有效成分的测定，将上述待测样品按照1.4的液相条件、质谱条件进行进样，结果如下：
经检测，500g灵芝直接浸泡于5000mL白酒30天后，检出含有β-谷甾醇96.5μg/L、灵芝醛A 416.12μg/L、灵芝酸S 693.45μg/L、灵芝醇A 715.46μg/L、灵芝酸Y 882.36μg/L、丹芝醇B 249.57μg/L、灵芝酸X346.32μg/L、灵芝醇F445.16μg/L、硬脂酸248.34μg/L、油酸674.19μg/L、灵芝马酮441.35μg/L、棕榈酸196.37μg/L、灵芝酸F4578.23μg/L、灵芝酸C1669.48μg/L、灵芝烯酸D 873.94μg/L、赤芝酸A697.54μg/L、灵芝酸B 4361.3μg/L、灵芝酸F3671.25μg/L、灵芝酸A 684.36μg/L、灵芝烯酸B 647.16μg/L、安息香酸694.37μg/L、灵芝烯酸A 3364.51μg/L、灵芝酸H甲酯487.38μg/L、灵芝酸C2 543.61μg/L、灵芝烯酸E 668.49μg/L、灵芝孢子酸A 8861.37μg/L、灵芝酸K 334.29μg/L、灵芝酸H 6794.51μg/L、灵芝内酯B5963.14μg/L、灵芝酸C6甲酯364.35μg/L、灵芝酸I 668.14μg/L、灵芝酸G 8841.38μg/L、灵芝碱甲6841.36μg/L、甜菜碱473.84μg/L、烟酸471.88μg/L、甘露醇6641.25μg/L、赤芝孢子内酯A224.26μg/L，其他物质未检出，由此可判定灵芝直接浸泡对其有效成分溶出有一定作用。
实施例2：提取液测定
灵芝提取液制备：将市场购买的4000g灵芝浸泡于45kg60％(V/V)酒精水溶液浸泡过夜，85℃加热真空回流提取4h，80℃加热浓缩3h，得到提取液3.5kg，
灵芝提取液前处理：取20mL灵芝提取液先用8层纱布过滤，8000r/min离心5分钟，再取10mL上清液于离心管中冷冻干燥，加入50mL甲酸-水-甲醇混合溶液，混匀后过0.22μm滤膜待测。
灵芝提取液中42种有效成分的测定，将上述待测样品按照1.4的液相条件、质谱条件进行进样，结果如下：
经检测，灵芝提取液中含有β-谷甾醇191.2μg/L、灵芝醛A 2251.14μg/L、灵芝酸S3214.2μg/L、灵芝醇A 1142.11μg/L、灵芝酸Y 4451.25μg/L、丹芝醇B 1454.24μg/L、灵芝酸X4412.88μg/L、灵芝醇F4415.14μg/L、硬脂酸147.21μg/L、油酸4424.22μg/L、胡萝卜苷2143.56μg/L、灵芝马酮5672.14μg/L、棕榈酸543.54μg/L、灵芝酸F4421.28μg/L、灵芝酸C17753.14μg/L、灵芝烯酸D 1142.5μg/L、赤芝酸A 1142.21μg/L、灵芝酸B 2245.25μg/L、灵芝酸F 8871.42μg/L、灵芝酸A 5584.53μg/L、灵芝烯酸B 4453.12μg/L、灵芝酮三醇2541.29μg/L、安息香酸6674.21μg/L、灵芝烯酸A 8412.45μg/L、灵芝酸H甲酯554.32μg/L、灵芝酸C22234.19μg/L、灵芝烯酸E 1542.68μg/L、灵芝孢子酸A 10543.25μg/L、灵芝酸K 5584.62μg/L、灵芝酸H 25413.27μg/L、灵芝内酯B 6684.51μg/L、灵芝酸C6甲酯684.35μg/L、灵芝酸I884.25μg/L、灵芝酸G 22451.58μg/L、sinensine245.36μg/L、灵芝碱甲44513.22μg/L、甜菜碱8543.27μg/L、烟酸7752.51μg/L、甘露醇42518.55μg/L、赤芝孢子内酯A546.58μg/L，其他物质未检出，相比于直接浸泡酒样，提取液中含有的胡萝卜苷、灵芝酮三醇、sinensine是直接浸泡无法溶出的，由此可判定提取液提取效果比浸泡更为理想。

Claims (6)

1.一种灵芝酒中42种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法，其特征在于：
首先将灵芝酒待测酒样冷冻干燥成固体，以甲酸-水-甲醇混合溶液溶解后过0.22μm滤膜，经UPC2 BEH柱进行梯度洗脱分离，同时采集UPC2-PDA模式及MS模式数据，ESI正负离子模式下分别监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过MS模式标准曲线线性回归方程对各有效成分进行定量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：前处理
将灵芝酒待测酒样冷冻干燥成固体，以甲酸-水-甲醇混合溶液溶解后过0.22μm滤膜；
步骤2：标准品的配制
分别配制1g/L的β-谷甾醇、灵芝醛A、灵芝酸S、灵芝醇A、灵芝酸Y、丹芝醇B、灵芝酸X、灵芝醇F、硬脂酸、油酸、胡萝卜苷、灵芝马酮、灵芝酮三醇、棕榈酸、灵芝酸F、灵芝酸C1、灵芝烯酸D、赤芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸F、灵芝酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸H甲酯、灵芝酸C2、灵芝烯酸C、灵芝烯酸E、灵芝孢子酸A、灵芝酸K、灵芝酸H、灵芝内酯B、灵芝酸C6甲酯、灵芝酸I、灵芝酸G、sinensine、灵芝碱甲、安息香酸、烟酸、甜菜碱、肉毒碱、甘露醇、及赤芝孢子内酯A的标准溶液，溶剂为甲酸-水-甲醇溶液，将42种灵芝有效成分的标准溶液混合并逐级稀释，获得不同浓度的混合标准品溶液；
步骤3：标准谱图与标准曲线的绘制
将步骤2配制的不同浓度的混合标准品溶液进行色谱洗脱分离，利用PDA和MS模式进行采集，获得42种灵芝有效成分标准品的标准谱图，以每种有效成分的峰面积为纵坐标，该标准品的浓度为横坐标，获得相应的标准曲线以及线性回归方程；
步骤4：待测样品的检测
将经步骤1前处理后的待测酒样经UPC2 BEH柱进行梯度洗脱分离，同时采集UPC2-PDA模式及MS模式数据，ESI正负离子模式下分别监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，利用保留时间和分子量进行定性，通过标准曲线线性回归方程进行定量。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：
所述甲酸-水-甲醇混合溶液中，甲酸的浓度为0.4％，甲醇的浓度为94.6％，V/V，余量为水。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于色谱条件设置如下：
色谱柱：ACQUITY UPC2，BEH，2.1×50mm，1.7μm；
进样量：2μL；
柱温：55℃流动相：流动相A CO2，流动相B甲酸-水-甲醇混合溶液，流速：1.5mL/min；梯度洗脱程序为：初始条件为2％的流动相B，流动相B在2min内增加至50％，达到50％后保持1.5min，然后0.1min内流动相B返回到2％，重新平衡系统3.0min；整个循环时间为10.0min。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于检测条件设置如下：
PDA检测器波长：254nm；
MS模式；
ESI+电离模式条件：毛细管电压：3.0kV；取样锥孔电压：21V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000L/H；参比质量：亮氨酸脑啡呔[M+H]+＝556.2766；
ESI-电离模式条件：毛细管电压：2.5kV；取样锥孔电压：21V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000L/H；参比质量：亮氨酸脑啡呔[M-H]-＝554.2615；采集范围：m/z 50～1200。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：
步骤4中，为了确保定性的准确性，可通过TIC窗口提取PDA检测数据，利用PDA检测的保留时间、ESI检测的保留时间及分子量三个参考值，对比标准品和样品，以此确保定性的准确性。
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