CN109030663A

CN109030663A - 一种uhplc法检测复方甘草片中化学成分的方法

Info

Publication number: CN109030663A
Application number: CN201811113098.6A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 高小惠; 王洪静; 段国蕾; 董艳萍
Original assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Current assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109030663B

Abstract

本发明公开了一种UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法包括检测复方甘草片化学成分和检测复方甘草片血浆代谢成分。本发明检测方法运行时间短，且对复方甘草片样品中的众多组分具有良好的分离度。进一步，该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，适用于复方甘草片的化学成分检测，且同时适用于复方甘草片血浆代谢成分的检测。能够对复方甘草片样品中的成分进行迅速、全面地检测，对复方甘草片样品中的众多组分具有良好的分离度；尤其是能够检测到第二供试品溶液中复杂的微量的入血成分，且分离度良好。因此，采用本发明的方法进行检测，有利于对复方甘草片样品中的组分进行全面阐述。

Description

一种UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，进一步属于医药检测技术领域，具体涉及一种UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法。

背景技术

复方甘草片是由甘草浸膏粉、阿片粉、樟脑、八角茴香油、苯甲酸钠等组成的复方制剂，收载于中国药典2015年版二部，为保护性祛痰镇咳药，临床上用于一般性咳嗽及上呼吸道感染、急性气管炎初期等的咳嗽治疗，能有效缓解症状。

现代研究表明，复方甘草片中的主要成分是生物碱类、黄酮类及萜类成分，能够预防全身麻醉气管插管后咽喉痛和咳嗽的作用，也可能通过调节树突细胞的成熟状态减轻了气道的反应，从而达到镇咳祛痰的作用。

建立合适的化学成分的检测方法是对药物进行质量控制的重要方面。目前已公开了多种复方甘草片的化学成分的检测方法，但尚未见针对复方甘草片的血浆中代谢物的检测方法。

关于复方甘草片的化学成分的检测方法，孙国祥等公开了用HPLC指纹图谱对复方甘草片实施全质量控制方法（HPLC指纹图谱对复方甘草片实施全质量控制方法，中南药学，2008年03期），采用双定性双定量相似度作为评价指标,建立了复方甘草片HPLC指纹图谱的全质量控制方法。该方法采用RP-HPLC法以Century SIL C18BDS柱(200mm×4.6mm,5μm);以色谱指纹图谱相对指数Fr为指标优化选择指纹图谱检测条件,确定流动相为1%醋酸水-1%醋酸乙腈低压梯度洗脱,紫外检测波长:254nm,柱温:(30.00±0.15)℃,进样量:5μL。该方法所建立HPLC指纹图谱具有较好的精密度和重现性,适用于复方甘草片的质量控制，并认为双定性双定量相似度法是宏观定性定量评价中药制剂质量的最合理、最客观的指纹图谱评价技术。

杨红娟等公开了RP-HPLC同时测定复方甘草片中4个成分含量的方法（杨红娟等，RP-HPLC同时测定复方甘草片中4个成分的含量，药物分析杂志，2013年01期），其采用高效液相色谱法同时测定复方甘草片中吗啡、磷酸可待因、甘草苷和甘草酸的含量，具体采用PhenomenexLuna-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH至4.0)为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长为220 nm(0～23min,检测吗啡和可待因)、254 nm(23～50 min,检测甘草苷和甘草酸),柱温为35℃。

赵月然等公开了HPLC法同时测定复方甘草片中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸的方法（HPLC法同时测定复方甘草片中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸，中成药，2014年04期）。该方法采用Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液,梯度洗脱;检测波长为276 nm(0~16 min)、360 nm(16~24 min)、276 nm(24~28 min)、254 nm(28~38 min);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃。

建立合适的化学成分的检测方法对于药物的质量控制、药理、药效、体内代谢及药效物质基础等方面研究和应用具有重要意义。现有的复方甘草片的化学成分检测方法多为高效液相色谱法，保留时间较长，至少需要四十分钟，甚至一百分钟。另外，现有方法多局限于对复方甘草片中一个或数个指标成分的含量测定，难以对复方甘草片中的化学成分进行全面阐述。此外，现有技术不能对复方甘草片的血浆代谢成分进行检测。因此开发一种能解决上述技术问题的检测方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种UHPLC法检测复方甘草片样品中化学成分的方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法包括检测复方甘草片化学成分和检测复方甘草片血浆代谢成分，具体包括以下步骤：

A、供试品溶液制备：

取复方甘草片进行制备得到第一供试品溶液；取复方甘草片代谢成分的血浆进行制备得到第二供试品溶液；

制备方法具体为：

1）第一供试品溶液：取复方甘草片，粉碎，加入复方甘草片重量10~40倍的有机溶剂提取，提取液过滤，滤液为第一供试品溶液；

2）第二供试品溶液：将含有复方甘草片代谢成分的血浆上活化后的固相萃取柱，依次用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，挥干，加入体积百分数10%的乙腈水溶液复溶，涡旋3~5min后离心10~30min，取上清液为第二供试品溶液；

B、对照品溶液制备：对照品溶液为甘草素、异甘草素、甘草次酸、甘草苷、异甘草苷、甘草查尔酮B、芹糖甘草苷、甘草查尔酮A、光甘草定、芒柄花苷、次甘草查尔酮、芒柄花素和樟脑对照品中的一种或几种；

制备方法是将各对照品精密称定，加溶剂制成每种对照品浓度为10~500μg•mL-1的对照品溶液；所述的溶剂为体积百分数50~100%甲醇水溶液、50~100%乙醇水溶液或50~100%乙腈水溶液；

C、UHPLC测定：

UHPLC色谱条件如下：

色谱柱： C₁₈柱；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0 min，5% B；10min，42% B；15 min，46% B；20 min，55% B；25 min，65% B；30 min，100% B。流速为0.3 mL·min^-1；进样量0.5-20μL。

本发明检测方法运行时间短，且对复方甘草片样品中的众多组分具有良好的分离度。进一步，该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，适用于复方甘草片的化学成分检测，且同时适用于复方甘草片血浆代谢成分的检测。能够对复方甘草片样品中的成分进行迅速、全面地检测，对复方甘草片样品中的众多组分具有良好的分离度；尤其是能够检测到第二供试品溶液中复杂的微量的入血成分，且分离度良好。因此，采用本发明的方法进行检测，有利于对复方甘草片样品中的组分进行全面阐述。

采用本发明UHPLC法能够将复方甘草片样品中的众多组分有效分离开来，而进一步采用上述质谱条件能够对UHPLC法分离的复方甘草片样品中的组分进行有效检测，检测灵敏度高，且获得的成分多级信息丰富，能够实现对成分进行准确地分析鉴定。采用本发明的UHPLC-MS检测方法，能够鉴定复方甘草片样品中的50个以上的化合物。在一个实施方式中，对第一供试品溶液进行检测，共鉴定了55个化合物，包括42个黄酮类成分、9个萜类成分以及4个生物碱类成分。在另一个实施方式中，对第二供试品溶液进行检测，共鉴定了26个化合物，包括20个原型成分和6个代谢产物。

附图说明

图1为正离子模式下UHPLC-LTQ-Orbitrap分析复方甘草片总离子流图：

其中， A为13个对照品溶液，B为复方甘草片，C为血浆样品。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法包括检测复方甘草片化学成分和检测复方甘草片血浆代谢成分，具体包括以下步骤：

A、供试品溶液制备：

制备方法具体为：

C、UHPLC测定：

UHPLC色谱条件如下：

A步骤1）中所述的有机溶剂为体积百分数50~100%甲醇水溶液、50~100%乙醇水溶液或50~100%乙腈水溶液。

A步骤1）中所述的有机溶剂为体积百分数60~80%甲醇水溶液、60~80%乙醇水溶液或60~80%乙腈水溶液。

A步骤1）中所述的有机溶剂为体积百分数70%甲醇溶液。

A步骤2）中所述的含有复方甘草片代谢成分的血浆是通过以下方法获得，具体为动物或人口服给予复方甘草片，药物入血后取血样置于肝素钠抗凝EP管中，混合均匀，离心，取上清液得到。

A步骤2）中所述的活化的固相萃取柱是依次用甲醇和水活化。

A步骤2）中所述的离心条件为温度4℃，转速14000rpm。

B步骤中所述有机溶剂为体积百分数80~100%甲醇水溶液、80~100%乙醇水溶液或80~100%乙腈水溶液。

所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，还包括质谱检测步骤，即所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法为UHPLC-MS法检测。

质谱条件如下：正离子检测模式：毛细管温度：350°C；鞘气流速：40.0 arb；辅助气流速：20.0 arb；喷雾电压：4 kV；毛细管电压：25 V；管透镜电压：110 V；样品采用FT进行FS扫描，分辨率为30000，扫描范围m/z 100～1000，隔离宽度2；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描（data dependent scan，DDS），选取上一级丰度最高的3个峰进行碰撞诱导解离（collision induced dissociation，CID）碎片扫描，归一化碰撞能量为35%，以离子阱打拿极检测碎片离子。

本发明所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，具体操作如下：

UHPLC色谱条件如下：

色谱柱： C₁₈柱；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0 min，5% B；10min，42% B；15 min，46% B；20 min，55% B；25 min，65% B；30 min，100% B。流速为0.3 mL·min^-1；进样量0.5-20μL。本发明中，色谱柱可以选用领域内常用的C18柱，优选为ACQUITYUHPLC BEH C₁₈（1.7µm, 2.1×100mm）。进样量优选为1-5μL，更优选为2μL。

需要说明的是，本申请中所述“复方甘草片样品”为第一供试品溶液或第二供试品溶液，第一供试品溶液是指复方甘草片用溶剂提取后得到的样品；第二供试品溶液是指复方甘草片口服吸收后的血浆样品。

本发明方法运行时间短，且对复方甘草片样品中的众多组分具有良好的分离度；尤其是能够检测到第二供试品溶液中复杂的微量的入血成分，且分离度良好。因此，采用本发明的方法进行检测，有利于对复方甘草片样品中的组分进行全面阐述。

本发明中，第一供试品溶液的制备方法：取复方甘草片，粉碎，加入复方甘草片重量10-40倍量的溶剂提取，提取液过滤，滤液为供试品溶液。所述溶剂选自50-100%甲醇水溶液、50-100%乙醇水溶液、50-100%乙腈水溶液，优选为60-80%甲醇水溶液、60-80%乙醇水溶液、60-80%乙腈水溶液，更优选为70%甲醇水溶液。所述溶剂的用量为复方甘草片重量的10-40倍量，优选为15-30倍量，更优选为18-25倍量，最优选为20倍量。所述提取方法优选为超声法；提取时间优选为5-40min，更优选为10-30min，再优选为15-20min。根据一个优选的实施方式，复方甘草片样品采用如下方法制成：取复方甘草片，研碎，加入20倍量70%甲醇超声20 min，过滤，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜得到。

本发明中，第二供试品溶液的制备方法：将含有复方甘草片代谢成分的血浆上活化后的固相萃取柱，依次用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，挥干，加入10%乙腈水溶液复溶，涡旋，离心，取上清液作为第二供试品溶液。根据一个优选的实施方式，依次用5 体积的甲醇和5 体积的水活化固相萃取柱，然后加入1 体积的血浆，最后用5 体积的水和3 体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，室温下用氮气吹干，残渣加入0.1体积的10%乙腈溶液复溶，涡旋4 min后离心20 min（14000 rpm，4℃），取上清液作为第二供试品溶液。

其中，含有复方甘草片代谢成分的血浆可通过如下方法获得：动物口服给予复方甘草片，药物入血后取血样置于肝素钠抗凝EP管中，混合均匀，离心，取上清液，得到第二供试品溶液。本申请中，所述动物可以为常规实验动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴等，也可以为人类，不做具体限制。该第二供试品溶液可置于-20℃冰箱保存备用。

与药物本身相比，药物入血后化学成分变化大，干扰多，药物本身的检测方法对其代谢成分的检测方法可借鉴性差。本申请发明人发现，当对复方甘草片血浆采用上述方法进行处理后，得到的第二供试品溶液采用本发明的UPLC法进行检测时，其中的各组分能够实现良好的分离。

上述UHPLC检测方法还可以包括将对照品溶液进样的步骤，其中对照品溶液可以含有甘草素，异甘草素，甘草次酸，甘草苷，异甘草苷，甘草查尔酮B，芹糖甘草苷，甘草查尔酮A，光甘草定，芒柄花苷，次甘草查尔酮，芒柄花素和樟脑对照品中的至少一种，优选2种以上，更优选5种以上，再优选8种以上。所述对照品溶液的制备方法可以为：将各对照品精密称定，加溶剂制成每种对照品浓度为10-500 μg·mL^-1 的对照品溶液。溶剂可以选自50-100%甲醇水溶液、50-100%乙醇水溶液、50-100%乙腈水溶液，优选为80-100%甲醇水溶液、80-100%乙醇水溶液、80-100%乙腈水溶液，更优选为甲醇或乙腈。每种对照品溶液的浓度可以为50-200μg·mL^-1 的，更优选为80-150μg·mL^-1 ，更优选为100μg·mL^-1 。采用上述对照品溶液进样，有利于复方甘草片样品中各组分的鉴定。

本发明还提供一种针对复方甘草片样品的化学成分的UHPLC-MS检测方法，其UHPLC方法如上所述，质谱条件如下：

正离子检测模式：毛细管温度：350°C；鞘气流速：40.0 arb；辅助气流速：20.0 arb；喷雾电压：4 kV；毛细管电压：25 V；管透镜电压：110 V；样品采用FT进行FS扫描，分辨率为30000，扫描范围m/z 100～1000，隔离宽度2；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描（datadependent scan，DDS），选取上一级丰度最高的3个峰进行碰撞诱导解离（collisioninduced dissociation，CID）碎片扫描，归一化碰撞能量为35%，以离子阱打拿极检测碎片离子。

上述UHPLC-MS检测方法还包括将对照品溶液进样的步骤，其中对照品溶液可以含有甘草素，异甘草素，甘草次酸，甘草苷，异甘草苷，甘草查尔酮B，芹糖甘草苷，甘草查尔酮A，光甘草定，芒柄花苷，次甘草查尔酮，芒柄花素和樟脑中的至少一种，优选2种以上，更优选5种以上，再优选8种以上。采用上述对照品溶液进样，有利于确定复方甘草片样品中各组分的鉴定。所述对照品溶液的制备方法可以为：将各对照品精密称定，加溶剂制成每种对照品浓度为10-500 μg·mL^-1 的对照品溶液。溶剂可以选自50-100%甲醇水溶液、50-100%乙醇水溶液、50-100%乙腈水溶液，优选为80-100%甲醇水溶液、80-100%乙醇水溶液、80-100%乙腈水溶液，更优选为甲醇或乙腈。每种对照品溶液的浓度可以为50-200μg·mL^-1 的，更优选为80-150μg·mL^-1 ，更优选为100μg·mL^-1 。采用上述对照品溶液进样，有利于复方甘草片样品中各组分的鉴定。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

一、仪器与材料

1．主要仪器

DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪与LTQ-Orbitrap XL质谱，配有电喷雾离子源（ESI），Xcalibur 2.1工作站（美国Thermo Scientific公司）；Sartorious BT 25S 型十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Acquity UPLC ® BEH C₁₈ column（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，Waters 公司，Milford，MA，USA），Millipore Synergy UV 型超纯水机（美国Millipore 公司）；GracePure^TM SPE C₁₈-Low固相萃取小柱（500 mg/3 mL）。

2. 实验材料

对照品：甘草素，异甘草素，甘草次酸，甘草苷，异甘草苷，甘草查尔酮B，芹糖甘草苷，甘草查尔酮A，光甘草定，芒柄花苷，次甘草查尔酮，芒柄花素和樟脑。所有对照品纯度均大于98%。

复方甘草片由昆药集团股份有限公司（规格：100片/瓶，批号：Z53020718）提供；

乙腈和甲醇（质谱级，德国Merck公司），甲酸（色谱级，德国Merck公司）。

Sprague Dawley（SD）大鼠，雄性，体重（220~250g），购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。

二、实验方法

1、混合对照品溶液的制备

分别取上述13个对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度约为100μg·mL^-1的储备液；分别精密吸取各储备液适量，加甲醇定容于5 mL 容量瓶中，即得。

、供试品溶液的制备

取甘草片0.50 g，研碎，加入10 mL70%甲醇超声20 min，过滤，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得第一供试品溶液。

、色谱条件

色谱柱：ACQUITY UHPLC BEH C₁₈（1.7µm, 2.1×100mm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0 min，5% B；10 min，42% B；15 min，46% B；20 min，55% B；25 min，65%B；30 min，100% B。流速为0.3 mL·min^-1；进样量2μL。

、质谱条件

正离子检测模式：毛细管温度：350°C；鞘气流速：40.0 arb；辅助气流速：20.0 arb；喷雾电压：4 kV；毛细管电压：25 V；管透镜电压：110 V。样品采用FT进行FS扫描，分辨率为30000，扫描范围m/z 100～1000，隔离宽度2；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描（datadependent scan，DDS），选取上一级丰度最高的3个峰进行碰撞诱导解离（collisioninduced dissociation，CID）碎片扫描，归一化碰撞能量为35%，以离子阱打拿极检测碎片离子。

、动物实验与样品采集

SD大鼠8只（空白组、给药组各4只），饲养于室温22~26℃，湿度为40%~70%，12 h昼夜更替的动物室内，实验前适应性喂养一周，受试前禁食12 h，全程不禁水。

给药剂量：按612.5 mg·kg^-1灌胃给药，每日2次，每次2ml，连续灌胃3天。空白组给予等量的生理盐水。

血浆样品采集：空白组和给药组的大鼠最后一次灌胃后分别于0.5、1、2和4 h时间点眼眶取血0.5 mL，置于肝素钠抗凝EP管中，混合均匀，3500rpm离心10 min，分别合并4个时间点的上清液，即得空白血浆和含药血浆，于-20℃冰箱保存备用。

、大鼠血浆样品处理方法

依次用5 mL甲醇和5 mL水活化固相萃取柱，然后加入1 mL血浆，最后用5 mL水和3 mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，室温下用氮气吹干，残渣加入100 μL 10%乙腈溶液复溶，涡旋4min后离心20 min（14000 rpm，4℃），吸取上清液，即得第二供试品溶液。

三、实验结果

通过分析UHPLC-MS检测得到复方甘草片中各化学成分的准确相对分子质量、保留时间和质谱信息，并结合提取离子流图及与对照品、相关文献数据进行化学成分结构鉴定。最终，共从复方甘草片中鉴定化学成分55个；同时从给药后的大鼠血浆中鉴定了26个血中移行成分，包括20个原形成分及6个代谢产物，结果见图1和表1。

表1 UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS对复方甘草片中化学成分及血浆样品原型与代谢产物的鉴定分析

F和M_F分别为黄酮类化合物及其代谢产物；T和M_T分别为萜类化合物及其代谢产物；A为生物碱类化合物；^△与对照品比对。

四、方法学考察

本研究对本方法的精密度、重复性和稳定性进行了较为系统的考察。

1、精密度

取复方甘草片样品，根据第一供试品溶液制备方法的规定制备第一供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法连续进样6次，以甘草苷色谱峰为参照，计算复方甘草片中鉴定的55个化学成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并对其RSD进行评价。6次进样55个色谱峰的相对保留时间RSD低于0.5%，相对峰面积RSD低于2.0%。

取复方甘草片代谢成分的血浆样品，根据第二供试品溶液制备方法的规定制备第二供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法连续进样6次，以甘草苷色谱峰为参照，计算复方甘草片代谢成分的血浆样品鉴定的26个化学成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并对其RSD进行评价。6次进样26个色谱峰的相对保留时间RSD低于0.5%，相对峰面积RSD低于2.0%。

以上结果表明方法精密度良好。

2、重复性

取复方甘草片样品，根据第一供试品溶液制备方法的规定平行制备6份第一供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法分别进样，以甘草苷色谱峰为参照，计算复方甘草片中鉴定的55个化学成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并对其RSD进行评价。6次进样55个色谱峰的相对保留时间RSD低于0.5%，相对峰面积RSD低于2.0%。

取复方甘草片代谢成分的血浆样品，根据第二供试品溶液制备方法的规定平行制备6份第二供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法分别进样，以甘草苷色谱峰为参照，计算复方甘草片代谢成分的血浆样品鉴定的26个化学成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并对其RSD进行评价。6次进样26个色谱峰的相对保留时间RSD低于0.5%，相对峰面积RSD低于2.0%。

以上结果表明方法重复性良好。

3、稳定性

取复方甘草片样品，根据第一供试品溶液制备方法的规定制备第一供试品溶液，分别于制备后的0、3、6、9、12、24 小时按照色谱条件规定的分析方法进样，以甘草苷色谱峰为参照，计算复方甘草片中鉴定的55个化学成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并对其RSD进行评价。6次进样55个色谱峰的相对保留时间RSD低于0.5%，相对峰面积RSD低于2.0%。

取复方甘草片代谢成分的血浆样品，根据第二供试品溶液制备方法的规定制备第二供试品溶液，分别于制备后的0、3、6、9、12、24 小时按照色谱条件规定的分析方法进样，以甘草苷色谱峰为参照，计算复方甘草片代谢成分的血浆样品鉴定的26个化学成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并对其RSD进行评价。6次进样26个色谱峰的相对保留时间RSD低于0.5%，相对峰面积RSD低于2.0%。

以上结果表明方法于24小时内稳定性良好。

Claims

1.一种UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法包括检测复方甘草片化学成分和检测复方甘草片血浆代谢成分，具体包括以下步骤：

A、供试品溶液制备：

制备方法具体为：

C、UHPLC测定：

UHPLC色谱条件如下：

色谱柱： C₁₈柱；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0 min，5% B；10 min，42% B；15 min，46% B；20 min，55% B；25 min，65% B；30 min，100% B，流速为0.3 mL·min^-1；进样量0.5-20μL。

2.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于A步骤1）中所述的有机溶剂为体积百分数50~100%甲醇水溶液、50~100%乙醇水溶液或50~100%乙腈水溶液。

3.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于A步骤1）中所述的有机溶剂为体积百分数60~80%甲醇水溶液、60~80%乙醇水溶液或60~80%乙腈水溶液。

4.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于A步骤1）中所述的有机溶剂为体积百分数70%甲醇溶液。

5.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于A步骤2）中所述的含有复方甘草片代谢成分的血浆是通过以下方法获得，具体为动物或人口服给予复方甘草片，药物入血后取血样置于肝素钠抗凝EP管中，混合均匀，离心，取上清液得到。

6.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于A步骤2）中所述的活化的固相萃取柱是依次用甲醇和水活化。

7.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于A步骤2）中所述的离心条件为温度4℃，转速14000rpm。

8.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于B步骤中所述有机溶剂为体积百分数80~100%甲醇水溶液、80~100%乙醇水溶液或80~100%乙腈水溶液。

9.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于还包括质谱检测步骤，即所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法为UHPLC-MS法检测。

10.根据权利要求1所述的UHPLC法检测复方甘草片中化学成分的方法，其特征在于质谱条件如下：正离子检测模式：毛细管温度：350°C；鞘气流速：40.0 arb；辅助气流速：20.0arb；喷雾电压：4 kV；毛细管电压：25 V；管透镜电压：110 V；样品采用FT进行FS扫描，分辨率为30000，扫描范围m/z 100～1000，隔离宽度2；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描（data dependent scan，DDS），选取上一级丰度最高的3个峰进行碰撞诱导解离（collisioninduced dissociation，CID）碎片扫描，归一化碰撞能量为35%，以离子阱打拿极检测碎片离子。