CN117771284A - 小贯众提取物的制法、检测方法以及特征图谱的构建方法 - Google Patents

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CN117771284A CN202410002390.XA CN202410002390A CN117771284A CN 117771284 A CN117771284 A CN 117771284A CN 202410002390 A CN202410002390 A CN 202410002390A CN 117771284 A CN117771284 A CN 117771284A
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许洋木
何燕玲
梁玉婷
安加文
娄涛涛
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李慧馨
孙宜春
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Abstract

本发明涉及中药分析领域，具体涉及小贯众提取物的制法、检测方法以及特征图谱的构建方法。该制备方法包括将小贯众药材进行两次水煎煮并过滤得到煎煮液，将煎煮液经浓缩、干燥得到小贯众提取物。所述小贯众提取物的出膏率高，原儿茶酸的质量含量和转移率均较高。本发明提供的原儿茶酸质量含量和/或转移率检测方法以及特征图谱的构建方法，专属性好，重复性良好，稳定性好。为小贯众提取物的质量控制提供了一个标准，实现了小贯众提取物及其制剂整体的质量控制和有效监督。

Description

小贯众提取物的制法、检测方法以及特征图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及中药分析领域，具体涉及小贯众提取物的制法、检测方法以及特征图谱的构建方法。
背景技术
小贯众为鳞毛蕨科植物贯众Cyrtomium fortunei J.Sm.的干燥根茎及叶柄基部。春、秋两季采挖，除去叶、须根及泥沙，晒干。本品亦为我省少数民族用药。收入2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》：清热解毒，凉血止血，杀虫。用于感冒头痛，黄疸，吐血，衄血，经多，血崩，肠道寄生虫。其分布于华东、中南、西南及河北、山西、陕西、甘肃等地。主要含有含贯众甙(cyrtomin)，异槲皮甙(isoquercitrin)，紫云英甙(astragalin)，贯众素(cyrtominetin)等成分。
目前商品中的贯众，涉及小贯众的甚少，只是部分地区的民间应用。目前尚无国家药材标准，仅以《贵州省中药材、民族药材质量标准》等地方中药材标准有收载，但较为粗疏，难以有效评价小贯众提取物及其制剂等的质量。
迄今为止，未见关于小贯众化学成分以及检测方法的文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种小贯众提取物的制备方法及其检测方法以及特征图谱的构建方法，可为小贯众提取物及其提取物制剂的质量评价提供质量控制手段。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种小贯众提取物，包括将小贯众药材进行两次水煎煮并过滤得到煎煮液，将煎煮液经浓缩、干燥得到小贯众提取物。
在本发明的一些实施方式中，第一次水煎煮加6～9倍量的水，优选第一次水煎煮时间为36～50min；第二次水煎煮加5～7倍量的水，优选第二次水煎煮时间为25～35min。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥为冷冻干燥，分成三个阶段：a.预冻：预冻温度为-55～-50℃；b.一次干燥：干燥温度-45～0℃；c.二次干燥进行解析：干燥温度为10～30℃；
优选地，所述预冻时间为2～5小时，优选为3小时；所述一次干燥时间为35～45小时，优选为39小时；所述二次干燥时间为5～7小时，优选为6小时；
更优选地，所述一次干燥的真空度为0～0.2mbar。
在本发明的一些实施方式中，所述浓缩的温度为60～65℃；优选地，浓缩至浓缩液密度为1.05～1.08g/mL。
第二方面，本发明还提供一种小贯众提取物，其由上述制备方法制得；
优选地，按干燥品计，所述小贯众提取物中原儿茶酸质量含量为1.82-5.00mg/g，更优选地，原儿茶酸的转移率为20.14-56.56％。
第三方面，本发明还提供上述小贯众提取物中原儿茶酸质量含量和/或原儿茶酸转移率的检测方法，其包括下述步骤：
(1)参照物溶液的制备
称取原儿茶酸对照品，加入溶剂制成溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取小贯众提取物，加入溶剂进行提取；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
在本发明的一些实施方式中，上述制备方法中，步骤(1)和(2)中所述溶剂选自稀乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇和100％甲醇中的一种或两种以上，优选为稀乙醇，和/或，
步骤(2)中所述提取采用回流提取、振摇提取或超声提取中一种，优选为超声提取，优选地，步骤(2)中所述提取时间为15-60min，优选为15min，和/或，
步骤(3)所述有机溶剂选自乙腈或甲醇，优选为乙腈，优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱的条件为：在0-5min，流动相A为5％，流动相B为95％，5-15min，流动相A为5％→9％，流动相B为95％→91％，15-15.1min，流动相A为9％→5％，流动相B为91％→95％，15.1-20min，流动相A为5％，流动相B为95％。
第四方面，本发明还提供上述小贯众提取物的特征图谱的构建方法，其包含下述步骤：
(1)参照物溶液的制备
称取原儿茶酸对照品，加入溶剂制成溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取小贯众提取物，加入溶剂进行提取；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相A，以水相为流动相B进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
在本发明的一些实施方式中，上述制备方法中，步骤(1)和(2)中的溶剂选自水、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇和100％甲醇中的一种或两种以上，优选为100％甲醇，和/或，
步骤(2)中所述提取采用回流提取、振摇提取或超声提取中一种，优选为超声提取；优选地，步骤(2)中所述提取时间为15～60min，优选为30min，和/或，
步骤(3)所述有机溶剂选自乙腈或甲醇，优选为乙腈；优选地，步骤(3)所述水相选自水、0.1％甲酸溶液、0.1％磷酸溶液和0.1％乙酸溶液中的一种，优选为0.1％磷酸溶液；更优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱的条件为：在0-5min，流动相A为5％，流动相B为95％，5-21min，流动相A为5％→12％，流动相B为95％→88％，21-24min，流动相A为12％→16％，流动相B为88％→84％，24-34min，流动相A为16％→18％，流动相B为84→82％，34-38min，流动相A为18％→60％，流动相B为82％→40％，38-38.2min，流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％，38.2-40min，流动相A为5％，流动相B为95％。
第五方面，本发明还提供一种上述小贯众提取物的鉴定方法，包括通过薄层色谱法鉴定所述小贯众提取物；所述薄层色谱法包括如下步骤：a.制备小贯众提取物供试品溶液和小贯众对照品溶液；b.将小贯众提取物供试品溶液和小贯众对照品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，加展开剂展开，取出晾干，喷以显色剂使斑点显色，检测，即得；
优选地，所述小贯众提取物供试品溶液通过包括如下步骤制得，取小贯众提取物0.1-1g，加甲醇溶解，经超声处理后过滤即得；优选所述小贯众对照品溶液通过包括如下步骤制得，取小贯众药材1-3g，加水加热回流、过滤，滤液蒸干得到残渣，用甲醇溶解残渣即得；
更优选地，所述展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水，进一步优选地，所述甲苯、乙酸乙酯、甲酸和水的体积比为1:12:2.5:3。
第六方面，本发明还提供上述小贯众提取物在用于制备保健食品、中药药品的用途；优选地，所述中药药品为标准汤剂、胶囊剂、片剂、冲剂或配方颗粒。
第七方面，本发明还提供一种标准汤剂，其通过上述的小贯众提取物制备得到。
第八方面，本发明还提供一种配方颗粒，其将上述小贯众提取物通过添加辅料制得。
第九方面，本发明还提供上述小贯众提取物中原儿茶酸质量含量和/或原儿茶酸转移率的测定方法或者上述小贯众提取物的特征图谱的构建方法在小贯众提取物及其制剂中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明小贯众提取物的制备方法，出膏率为6.3～16.8％，出膏率较高，所制得小贯众提取物中原儿茶酸的质量含量为1.82-5.00mg/g，原儿茶酸的转移率为20.14-56.56％，原儿茶酸的含量和转移率均较高，加速稳定和长期稳定性试验结果表明，本发明制得的小贯众提取物各项指标都很稳定。
2.本发明建立的特征图谱方法，采用超高相液相色谱，具有简便、稳定、精密度高及重现性好等特点，而且所得提取物指纹图谱的峰多，峰型好，易于鉴别，准确可靠。可为小贯众提取物及其提取物制剂的质量评价提供质量控制手段。并且，该特征图谱的构建方法简单、省时、环保，对一批制剂的分析仅用30min，能大大缩短检测分析时间，提高生产效率，使得大样本抽样检测，快速监控产品的质量成为可能。
3.本发明为小贯众提取物的质量控制提供了一个标准，实现了小贯众提取物及其制剂整体的质量控制和有效监督。
附图说明
图1为测定实施例一制得小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的超高效液相色谱图；
图2为小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的测定方法专属性考察超高效液相色谱图；
图3为小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的测定方法峰纯度考察超高效液相色谱图；
图4为小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的测定方法线性关系考察图；
图5为实施例一小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的检测方法中不同色谱柱的超高效液相色谱图；
图6为实施例一小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的检测方法中不同色谱仪的超高效液相色谱图；
图7为实施例一小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的检测方法中不同柱温的超高效液相色谱图；
图8为实施例一小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及转移率的检测方法中不同流速的超高效液相色谱图；
图9为小贯众提取物在190-400nm范围内的DAD光谱；
图10为实施例一小贯众提取物特征图谱检测方法中流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液和甲醇-0.1％磷酸溶液的超高效液相色谱图；
图11为实施例一小贯众提取物特征图谱检测方法中不同流动相的超高效液相色谱图；
图12为实施例一制得小贯众提取物的特征图谱；
图13为小贯众提取物特征图谱检测方法专属性考察色谱图；
图14为小贯众提取物特征图谱检测方法整体性考察色谱图；
图15为实施例一小贯众提取物物特征图谱检测方法中不同色谱柱的超高效液相色谱图；
图16为实施例一小贯众提取物物特征图谱检测方法中不同柱温的超高效液相色谱图；
图17为实施例一小贯众提取物特征图谱检测方法中不同流速的超高效液相色谱图；
图18为小贯众提取物共有峰测定结果；
图19为实施例五制备小贯众配方颗粒的特征图谱；
图20为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中不同点样量的薄层色谱图；
图21为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法专属性考察薄层色谱图；
图22-1为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中展开温度为5℃的薄层色谱图，图22-2为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中展开温度为25℃的薄层色谱图；图22-3为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中展开温度为35℃的薄层色谱图；
图23-1为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中展开湿度为33％的薄层色谱图；图23-2为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中展开湿度为66％的薄层色谱图；图23-3为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中展开湿度为88％的薄层色谱图；
图24-1为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中硅胶薄层板为青岛海洋硅胶G板的薄层色谱图；图24-2为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中硅胶薄层板为国药集团化学试剂硅胶G板的薄层色谱图；图24-3为小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法中硅胶薄层板为德国Merck板的薄层色谱图；
图25为小贯众配方颗粒的薄层色谱鉴定结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
术语“稀乙醇”是采用《中国药典一部》中附录XVB试液进行制备，即取乙醇529ml，加水稀释至1000ml，即得。本液在20℃时含C2H5 OH应为49.5％～50.5％(ml/ml)。
第一方面，在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供一种小贯众提取物的制备方法，包括将小贯众药材进行两次水煎煮并过滤得到煎煮液，将煎煮液经浓缩、冷冻干燥得到小贯众提取物。
在本发明的一些实施方式中，其中，小贯众药材在加水煎煮之前，进行适度破碎，并进行浸泡，浸泡时间为20-40min。
根据本发明，所述过滤为趁热过滤，所述过滤采用100-300目筛网进行过滤，优选为300目进行过滤。
其中，所述筛网为泰勒筛网(美国泰勒公司)或滤布(新乡中新化工有限责任公司)。
在本发明的一些实施方式中，第一次水煎煮加6～9倍量的水，优选为8倍量的水，优选地，第一次水煎煮时间为36～50min，优选为40min；第二次水煎煮加5～7倍量的水，优选为6倍量的水；优选地，第二次水煎煮时间为25～35min，优选为30min。
在本发明的一些实施方式中，煎煮液的浓缩采用减压浓缩，具体地，在温度为60-65℃下进行浓缩，浓缩至密度为1.05-1.08g/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述冻冻干燥分成三个阶段：a.预冻：预冻温度为-55～-50℃；b.一次干燥：干燥温度-45～0℃；c.二次干燥进行解析：干燥温度为10～30℃；
其中，预冻时间为2～5小时，优选为3小时；一次干燥时间为35-45小时，优选为39小时，一次干燥的真空度为0-0.2mbar；二次干燥时间为5～7小时，优选为6小时，二次干燥的真空度为0mbar；
为了有利于冻干粉形态完好、颜色均匀和保留有效物质，提高小贯众提取物的稳定性，一次干燥过程中，在-45℃冷冻2-3h，在-35℃冷冻6-7h，在-30℃冷冻18-20h，在-25℃冷冻9-10h，在-20℃冷冻2-3h，在-10℃冷冻1-2h，在0℃冷冻1-2h。
第二方面，本发明还提供了一种小贯众提取物，由上述制备方法制得。
在本发明的一些实施方式中，所述小贯众提取物中原儿茶酸含量为1.82-5.00mg/g，更优选地，原儿茶酸的转移率为20.14-56.56％。
可以理解的是，该小贯众提取物可以直接作为标准汤剂，也可以添加其他辅料制作成配方颗粒。
第三方面，本发明还提供一种小贯众提取物中原儿茶酸质量含量和/或原儿茶酸转移率的检测方法，包括下述步骤：
(1)参照物溶液的制备
称取原儿茶酸对照品，加入溶剂制成溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取原儿茶酸提取物，加入溶剂进行提取；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所述梯度洗脱的条件为：在0-5min，流动相A为5％，流动相B为95％，5-15min，流动相A为5％→9％，流动相B为95％→91％，15.0-15.1min，流动相A为9％→5％，流动相B为91％→95％，15.1-20min，流动相A为5％，流动相B为95％。
在本发明的一些实施方式中，上述参照物溶液的制备方法为：取原儿茶酸对照品适量，精密测定，加溶剂制成每1mL含原儿茶酸16μg的溶液。其中，所述溶剂选自稀乙醇、75％(v/v)乙醇、95％(v/v)乙醇、50％(v/v)甲醇、75％(v/v)甲醇和100％甲醇，优选为稀乙醇。
在本发明的一些实施方式中，上述供试品溶液的制备方法为：取小贯众提取物，精密称定0.1-0.15g，加入25mL溶剂，称定重量，采用回流或振摇或超声方式进行提取，优选为超声提取，再称定重量，用溶剂补足减失重量，摇匀，过滤得到滤液。其中，所述溶剂选自稀乙醇、75％(v/v)乙醇、95％(v/v)乙醇、50％(v/v)甲醇、75％甲醇(v/v)和100％甲醇，优选为稀乙醇。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱可以为岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ(柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.9μm))、迪马DikmaEndeavorsil C18(柱长150mm，内径2.1mm，粒径为1.8μm)或赛默飞Acclaimvanquish C18(柱长150mm，内径2.1mm，粒径为1.8μm)；优选为岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ(柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.9μm)。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱的柱温为30-40℃，优选为40℃。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所使用的流速可以为0.25-0.35ml/min，优选为0.3ml/min。
本发明还提供一种小贯众提取物的特征图谱的构建方法，包含下述步骤：
(1)参照物溶液的制备
称取原儿茶酸对照品，加入溶剂制成溶液；
(2)供试品溶液的制备
取小贯众提取物，加入溶剂进行提取；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相A，以水相为流动相B进行梯度洗脱，分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
在本发明的一些实施方式中，上述参照物溶液的制备方法为：取原儿茶酸对照品适量，精密测定，加溶剂制成每1mL含原儿茶酸16μg的溶液。其中，所述溶剂选自水、50％(v/v)乙醇、75％(v/v)乙醇、95％(v/v)乙醇、50％(v/v)甲醇、75％(v/v)甲醇和100％甲醇中的一种或两种以上，优选为100％甲醇。
上述供试品溶液的制备方法为：取小贯众提取物，精密称定0.1-0.15g，加入25mL溶剂，称定重量，采用回流或振荡溶解或超声方式进行提取，优选为超声提取，再称定重量，用溶剂补足减失重量，摇匀，过滤得到滤液。其中，所述溶剂选自水、50％(v/v)乙醇、75％(v/v)乙醇、95％(v/v)乙醇、50％(v/v)甲醇、75％(v/v)甲醇和100％甲醇中的一种或两种以上，优选为100％甲醇。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所述流动相A为乙腈或甲醇，优选为乙腈。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，水相可以为水、0.1％甲酸溶液、0.1％磷酸溶液和0.1％乙酸溶液中的一种，优选为0.1％磷酸溶液，其中，所述梯度洗脱的条件为：在0-5min，流动相A为5％，流动相B为95％，5-21min，流动相A为5％→12％，流动相B为95％→88％，21-24min，流动相A为12％→16％，流动相B为88％→84％，24-34min，流动相A为16％→18％，流动相B为84→82％，34-38min，流动相A为18％→60％，流动相B为82％→40％，38-38.2min，流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％，38.2-40min，流动相A为5％，流动相B为95％。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱可以为Dikma C18-A(柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.8μm)、Waters ACQUITYHSS T3(柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.8μm)或Shim-pack GIST-HP C18-AQ(柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.9μm)，优选为Shim-pack GIST-HP C18-AQ(柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.9μm)。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱的柱温为30-40℃，优选为40℃。
在本发明的一些实施方式中，进行超高效液相色谱分析时，所使用的流速可以为0.2-0.3ml/min，优选为0.3ml/min。
本发明还提供上述的小贯众提取物的薄层色谱鉴定方法，所述薄层色谱法包括如下步骤：a.制备小贯众提取物供试品溶液和小贯众对照品溶液；b.将小贯众提取物供试品溶液和小贯众对照品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，加展开剂展开，取出晾干，喷以显色剂使斑点显色，检测，即得；
优选地，所述小贯众提取物供试品溶液通过包括如下步骤制得，取小贯众提取物0.1-1g，加甲醇溶解，经超声处理后过滤即得；优选所述小贯众对照品溶液通过包括如下步骤制得，取小贯众药材1-3g，加水加热回流、过滤，滤液蒸干得到残渣，用甲醇溶解残渣即得；
更优选地，所述展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水，进一步优选地，所述甲苯、乙酸乙酯、甲酸和水的体积比为1:12:2.5:3。
本发明还提供上述小贯众提取物在用于制备保健食品、中药药品的用途；优选地，所述中药药品为标准汤剂、胶囊剂、片剂、冲剂或配方颗粒。
本发明还提供一种标准汤剂，通过上述的小贯众提取物制备得到。
本发明还提供一种小贯众配方颗粒，其包括将小贯众提取物与药用辅料经干法制粒得到。
干法制粒主要是指不用润湿剂或液态粘合剂而制成的颗粒，它是把药物和辅料混合均匀，压缩成大的片状或条带状后，粉碎程所需大小颗粒的方法。该法靠压缩力使离子间产生结合力，其制备方法有重压法和辊压法。与传统的湿法制粒相比，省去了制软材、干燥、整粒的过程，工艺简单，并且克服了辅料用量大的缺点，能大大提高载药量。而中药配方颗粒的相关法规要求中药配方颗粒成品仅尽量不加或少加辅料，所以，宜选择干法制粒为中药配方颗粒的制粒方法。所述药用辅料包括但不限麦芽糊精、硬脂酸镁、二氧化硅、滑石粉或微晶纤维素，可改变粉体性质，改善物料外观和流动性，便于贮存和运输、溶解度、孔隙率和比表面积等的控制。考虑到颗粒粒度、流动性、一次成品率、堆密度、溶化性等综合性能，在干法制粒中加入辅料的量应≦0.3％(以清膏的重量计)。用料过多时会带来一些性能上的缺陷，比如硬脂酸镁用量过多时，由于其疏水性，会使得溶出迟缓。
本发明还提供上述原儿茶酸质量含量和/或原儿茶酸转移率的的测定方法或者上述小贯众提取物特征图谱的构建方法在小贯众提取物及其制剂中的应用。
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的有益效果。
本发明中使用的原料或试剂均购自市场主流厂家，未注明生产厂商者或者未注明浓度者，均为可以常规获取的分析纯级的原料或试剂，只要能起到预期的作用，并无特别限制。
本实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
以下，利用实施例、对比例更具体说明本发明，但本发明的技术范围不限定于这些示例。需要说明的是，只要不是特别地记载，那么本发明中使用的全部的百分率、份、比率基于质量。其中，实施例和对比例所用到的原料信息和试验设备的信息分别如表1和表2所示：
表1本发明所用到的原料信息
原料名称 纯度/批号 出售厂家
小贯众饮片 YP2106-1 贵州剑河久甲村
小贯众饮片 YP2106-2 贵州剑河久吉村
小贯众饮片 YP2106-3 贵州剑河基佑村
小贯众饮片 YP2106-4 贵州剑河展风村
小贯众饮片 YP2106-5 贵州剑河巫亮村
小贯众饮片 YP2106-6 贵州剑河坪夏村
小贯众饮片 YP2106-7 贵州剑河牙么村
小贯众饮片 YP2106-8 贵州剑河章沟村
小贯众饮片 YP2106-9 贵州剑河平乌村
小贯众饮片 YP2106-10 贵州剑河敏洞乡
小贯众饮片 YP2106-11 贵州剑河麻风村
小贯众饮片 YP2106-12 贵州剑河南明镇
小贯众饮片 YP2106-13 贵州剑河升洞村
小贯众饮片 YP2106-14 贵州剑河平教村
小贯众饮片 YP2106-15 贵州长顺九寨村
原儿茶酸 111809-201906 中国食品药品检定研究所
表2本发明所用的实验设备的信息
下述实施例中小贯众浓缩液含固率采用如下方法测定：
参照2020年版《中国药典》第四部通则2201浸出物测定法中“热浸法”浸出物含量的测定：精密称取浓缩液10g，置已恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，计算得到浓缩液含固率。
实施例一
1.小贯众提取物的制备方法
(1)取小贯众饮片(批号YP2106-1)100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮直接加入8倍量水中，浸泡30分钟，武火(500W)煮沸后文火(200W)保持微沸40分钟，煎液经300目筛网趁热过滤；第二次煎煮加6倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸30分钟，煎液用300目筛网趁热过滤，合并两次滤液；
(2)将滤液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090MPa)至100ml的浸膏，测量其密度为1.06g/mL、出膏率为13.62％；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为1ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，先进行预冻，预冻温度为-50℃，预冻时间为3小时，然后进行一次干燥，干燥温度依次为-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-10℃和0℃，真空度为0.2mbar，干燥时间分别为2小时、6小时、18小时、9小时、2小时、1小时和1小时，接着进行二次干燥，干燥温度依次为10℃、20℃和30℃，真空度为0mbar，干燥时间分别为1小时、1小时和4小时，取出，轧铝盖，得到小贯众提取物，所述小贯众浸膏的出膏率按下述公式计算，
出膏率＝浸膏重量*浸膏含固率/饮片投料量*100％。
2.小贯众提取物中原儿茶酸质量含量及其转移率的测定方法
2.1对检测方法的条件的优化
2.1.1参照物溶液的制备
取原儿茶酸对照品适量，精密称定，置于已编号的10ml容量瓶内，加稀乙醇制成每1ml含原儿茶酸16μg参照物溶液，摇匀，即得。
2.1.2供试品溶液的制备
取上述制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，置于具塞锥形瓶内，加入25mL溶剂，称定重量，提取处理一段时间，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内。
2.1.3超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ，柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.9μm)；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速0.3ml/min，检测波长为259nm。理论板数按原儿茶酸峰计算应不低于3000。分别吸取10μL2.1.1中参照物溶液、2.1.2中供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行分析。
表3洗脱梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-5 5 95
5-15 5→9 95→91
15-15.1 9→5 91→95
15.1-20 5 95
2.1.4原儿茶酸的质量含量和原儿茶酸的转移率按下述公式计算：
其中，
w原儿茶酸＝A供×C对×V供×10-3/(m供×A对)
w饮＝A饮供×C对×V饮供×10-3/(m饮供×A对)
原儿茶酸转移率＝(m提×w原儿茶酸)/(m饮×w饮)
式中：
w原儿茶酸——小贯众提取物中原儿茶酸的质量含量，mg/g；
w饮——小贯众饮片中原儿茶酸的质量含量，mg/g；
A对——参照物溶液的超高效液相色谱谱图中原儿茶酸对应吸收峰面积；
A供——供试品溶液的超高效液相色谱谱图中原儿茶酸对应吸收峰面积；
A饮供——饮片供试品溶液的超高效液相色谱谱图中原儿茶酸对应吸收峰面积；
C对——参照物溶液对照品的浓度，μg/mL；
m供——供试品溶液中小贯众提取物的绝干质量，g；
m饮供——饮片供试品溶液溶液中小贯众饮片的绝干质量，g；
V供——供试品溶液的体积，ml；
V饮供——饮片供试品溶液的体积，ml；
m提——制得小贯众提取物的绝干质量，g；
m饮——原料小贯众饮片的绝干质量，g。
2.1.5制备条件的优化
Ⅰ不同提取溶剂的考察
取实施例一制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，每份平行2个样品，分别置于具塞锥形瓶内，依次精密加入25ml水、50％(v/v)乙醇、75％(v/v)乙醇、95％(v/v)乙醇、50％(v/v)甲醇、75％(v/v)甲醇和100％甲醇，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)15min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪中，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，以原儿茶酸计，按照上述方法计算不同提取溶剂对其含量的影响，确定最佳的提取溶剂，具体结果详见表4：
表4不同提取溶剂对小贯众提取物中原儿茶酸含量的影响
由表4可知：不同溶剂对小贯众提取物中原儿茶酸的质量含量影响差异显著，综合考虑其含量及目标峰峰形，选择50％(v/v)乙醇做为提取溶剂。
Ⅱ提取方式的考察
取实施例一制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，共3份，每份平行2个样品，分别置于具塞锥形品内，依次精密加入25mL50％(v/v)乙醇，称定重量，分别超声(功率500W，频率40kHz)30min、回流处理30min、振摇处理30min，取出冷却至室温后，用50％(v/v)乙醇补重，混匀，过滤，收集续滤液。取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得各供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，以原儿茶酸计，按照上述方法计算不同提取方式对其含量的影响，确定最佳的提取方式，具体结果详见表5所示：
表5不同提取方式对小贯众提取物中原儿茶酸含量的影响
由表5可知：不同提取方式对小贯众提取物中原儿茶酸的含量影响差异并不明显，综合考虑样品处理效率，选择超声提取进行提取。
Ⅲ不同提取时间的考察
取实施例一制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，共3份，每份平行2个样品，分别置具塞锥形品内，依次精密加入25mL50％(v/v)乙醇，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)15min、30min、60min，取出冷却至室温后，用50％(v/v)乙醇补重，混匀，过滤，收集滤液。取适量滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得各供试品溶液，备用。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，以原儿茶酸计，按照上述方法计算不同提取时间对其含量的影响。具体结果详见表6所示：
表6不同提取时间对小贯众提取物中原儿茶酸含量的影响
由表6结果可知：不同提取时间对小贯众提取物中原儿茶酸含量影响差异不显著，综合考虑时间成本及其含量差异，选择超声提取15min。
采用上述进行优化的条件制备小贯众提取物供试品溶液和小贯众饮片供试品溶液，方法如下：
小贯众提取物供试品溶液的制备
取实施例一制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，置于具塞锥形瓶内，加入25mL50％乙醇，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)15min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得小贯众提取物供试品溶液。
小贯众饮片供试品溶液的制备
取小贯众饮片(批号YP2106-1)约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶内，加入25mL50％(v/v)乙醇，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)15min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，过0.22μm的微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得小贯众饮片供试品溶液。
按照2.1.3超高效液相色谱分析中的色谱分析方法分别对上述优化后条件制得小贯众提取物供试品溶液和小贯众饮片供试品溶液进行色谱分析，实施例一制备的小贯众提取物超高效液相色谱谱图如图1所示，根据原儿茶酸质量含量计算公式及原儿茶酸转移率的计算公式，得出原儿茶酸的质量含量为3.9mg/g，原儿茶酸的转移率为36.56％。
2.2对检测方法的方法学的考察
2.2.1专属性考察
分别精密吸取上述2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液、
2.1.1中原儿茶酸参照物溶液与50％(v/v)乙醇各2μl，按照上述2.1.3色谱条件进行测定，结果见图2。
由图2可知，该分析方法对小贯众提取物中原儿茶酸的含量测定的专属性良好。
2.2.2峰纯度
分别精密吸取2μl上述2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液、2.1.1中原儿茶酸对照品溶液，按照上述2.1.3色谱条件进行测定，即得目标峰的峰纯度，结果见图3和表7所示。
表7标峰以及峰纯度的匹配值
由图3以及表7可知：该指标成分的纯度值为1000，大于996，表明其峰纯度符合分析要求。
2.2.3线性关系考察
精密称取原儿茶酸参照物适量，置已编号的20ml容量瓶内，加50％(v/v)乙醇制成每1ml含原儿茶酸0.1mg参照物溶液，摇匀，即得参照物储备液，置冰箱内备用。
取原儿茶酸参照物储备液并将其稀释为200、40、20、10、5、4、2倍，即得不同浓度原儿茶酸对照品溶液，按照2.1.3色谱条件进行上机检测，以浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，考察原儿茶酸的线性范围。线性考察结果见图4和表8所示。
表8原儿茶酸线性考察
编号 原儿茶酸浓度(μg/ml) 峰面积值(mAU)
原儿茶酸-1 0.49998 0.36205
原儿茶酸-2 2.4999 0.85875
原儿茶酸-3 4.9998 1.6056
原儿茶酸-4 9.9996 3.3376
原儿茶酸-5 19.999 6.6900
原儿茶酸-6 24.999 8.37245
由图4和表8可知，原儿茶酸在0.49998μg/ml～49.999μg/ml范围内其浓度与峰面积值呈良好的线性关系，相关系数r＝0.9998。
2.2.4精密度考察
取2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液，平行6份，每份进样2针，分别进样2μL，注入超高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算原儿茶酸含量，以原儿茶酸计，采用外标一点法进行计算目标峰的RSD(％)值，具体结果详见如表9所示。
表9小贯众提取物含量测定方法精密度实验结果
由表9可知，目标峰原儿茶酸的RSD(％)值为0.84，小于2.0％，表明该方法精密度良好。
2.2.5稳定性考察
取实施例一制备的小贯众提取物，按照2.1中优化后的条件制备小贯众提取物的供试品溶液，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，分别在供试品溶液制备后的0，1，2，4，6，8，12，24小时进样，进样体积2μl，按照上述方法计算原儿茶酸含量，以原儿茶酸计，采用外标一点法进行计算目标峰含量的RSD(％)值，具体结果详见表10所示。
表10稳定性考察
由表10可知，目标峰原儿茶酸在24h内含量的的RSD(％)值为1.99％，小于2.0％，说明该溶液在24小时内稳定性良好。
2.2.6重复性考察
取实施例一制备得到的小贯众提取物共6份，按2.1中优化后的条件制备成小贯众提取物供试品溶液，进样体积10μl。按2.1.3中色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算原儿茶酸含量，以原儿茶酸计，采用外标一点法进行计算目标峰含量的RSD(％)值，具体结果详见表11。
表11重复性实验结果
由表11可知，目标峰原儿茶酸含量的RSD(％)值为1.81％，小于2.0％，表明该方法的重复性良好。
2.2.7中间精密度考察
选择6个实验人员，分别在两个不同日期以及两台不同色谱仪(赛默飞ThermoVanquish F和安捷伦Agilent HPLC 1290InfinityⅡ)下操作，取2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液，按2.1.3色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算原儿茶酸含量，以供试品溶液中原儿茶酸计，采用外标一点法进行计算目标峰含量的RSD(％)值，具体结果详见表12。
表12测定方法中间精密度实验结果
由表12可知，目标峰原儿茶酸含量的中间精密度RSD(％)值为1.61％，均小于2.0％，表明该方法的中间精密度良好。
2.2.8准确度试验
取已知含量小贯众提取物(原儿茶酸含量4mg/g)约0.06g，精密称定共6份，依次分别精密加入50％(v/v)乙醇制备的原儿茶酸参照物1mL(浓度0.238mg/mL)，另精密加24mL50％(v/v)乙醇，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)15min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得小贯众提取物供试品溶液。分别精密吸取原儿茶酸参照物溶液与小贯众提取物供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算原儿茶酸含量，以原儿茶酸计，采用外标一点法进行计算目标峰的含量，并按以下列公式计算回收率及RSD(％)值，结果如表13所示。
表13含量测定方法加样回收实验结果
由表13可知：小贯众提取物中原儿茶酸的回收率范围在92％-105％范围之内，且RSD％(1.32％)小于2.0％，表明该含测方法的准确度良好。
2.2.9耐用性考察
2.2.9.1不同色谱柱考察
比较了岛津、迪马、赛默飞三种色谱柱对小贯众提取物中原儿茶酸色谱峰峰形及分离度的影响。
取2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液，按2.1.3中色谱条件测定，以原儿茶酸计，记录色谱数据。实验结果如图5以及表14所示。
表14不同色谱柱对小贯众提取物中原儿茶酸色谱峰的影响
由图5和表14结果可知，不同色柱对小贯众提取物中原儿茶酸的分离度、峰形及峰纯度的影响存在差异，且三种品牌的色谱柱对目标峰均能实现良好分离。根据实验结果参数，综合考虑本实验选用色谱柱岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ。
2.2.9.2不同色谱仪考察
根据实验室现有设备，选取赛默飞Thermo VanquishF超高效液相色谱仪与安捷伦Agilent UPLC 1290InfinityⅡ超高效液相色谱仪，比较两种色谱仪对小贯众提取物中原儿茶酸色谱峰峰形及分离度的影响。
取2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液，按2.1.3中色谱条件测定，以原儿茶酸计，记录色谱数据。实验结果如图6以及表15所示。
表15仪器耐用性考察结果
由图6以及表15可知，该分析方法不同色谱仪耐用性较好。色谱仪的变动能满足系统适应性要求。
2.2.9.3不同柱温考察
取2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液，按照2.1.3中色谱条件测定，比较30℃、35℃、40℃不同柱温对小贯众提取物中原儿茶酸色谱峰峰形及分离度的影响。实验结果如图7以及表16所示。
表16不同柱温对小贯众提取物含量测定方法的检测结果
柱温/℃ 指标成分 分离度/R 理论塔板数 纯度值
30 原儿茶酸 18.76 11983 971
35 原儿茶酸 12.54 11884 999
40 原儿茶酸 13.18 11839 999
由图7以及表16可知，三种柱温下色谱峰峰形及分离效果均较好，30℃条件下色谱图的基线无漂移，与其他两个温度相比较其峰形无显著差异。考虑到色谱柱的耐受性及分析所需时间，因此选择柱温为40℃。
2.2.9.4不同流速考察
取2.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液，按2.1.3中色谱条件测定，其中，流动相的流速分别选择0.25ml/min、0.3ml/min、0.35ml/min，比较0.25ml/min、0.3ml/min、0.35ml/min不同流速对小贯众提取物中原儿茶酸色谱峰峰形及分离度的影响。实验结果如图8以及表17所示。
表17不同流速对小贯众提取物含量测定方法的检测结果
流速/(ml/min) 指标成分 分离度/R 理论塔板数 纯度值
0.25 原儿茶酸 6.21 13387 999
0.30 原儿茶酸 13.18 11839 999
0.35 原儿茶酸 12.88 11513 999
由图8以及表17可知，三种流速下色谱峰形及分离效果均较好。流速为0.3ml/min时原儿茶酸的各项参数较好，基线无飘移，且峰形差异不显著，故本实验选择流速为0.3ml/min。
3.小贯众提取物的特征图谱的构建方法
3.1对构建方法的条件的优化
3.1.1参照品溶液的制备
取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原儿茶酸16μg的对照品溶液，摇匀，即得。
3.1.2供试品溶液的制备
取实施例一制得小贯众提取物约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入溶剂25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，即得，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内。
3.1.3超高效液相色谱分析
分别吸取2μL3.1.1中参照物溶液和3.1.2中供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行分析,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以有机相为流动相A，以水相为流动相B，按表18中的规定进行梯度洗脱；以一定的柱温和流速在一定的检测波长下进行测定。
表18梯度洗脱
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-5 5 95
5-21 5→12 95→88
21-24 12→16 88→84
24-34 16→18 84→82
34-38 18→60 82→40
38-38.2 60→5 40→95
38.2-40 5 95
3.1.4对构建方法的条件的优化
3.1.4.1检测波长的确定
取实施例一制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入100％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，即得，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，得到小贯众提取物供试品溶液，记录190-400nm范围内的吸收光谱，如图9所示。
由图9可知，在252nm波长下，小贯众提取物供试品溶液可以检测到的色谱峰信息较多且基线噪音干扰较小，因此选择252nm为检测波长。
3.1.4.2流动相的优化
①参照3.1.3的方法，色谱柱为岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ(150mm，2.1mm，1.9μm)；柱温40℃，流动相流速为0.3ml/min，小贯众提取物供试品溶液参照3.1.4.1中的制备方法，考察A为有机相(100％甲醇或100％乙腈)，B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱表如19所示，结果如图10所示。
表19梯度洗脱表
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～20 5→100 95→0
20～20.1 100→5 0→95
20.1～22 5 95
由图10可知，乙腈-0.1％磷酸溶液洗脱能力较甲醇-0.1％磷酸溶液强，故选择乙腈-0.1％磷酸溶液进行条件摸索，后期再对流动相中所用到的各种酸进行考察。后期再对流动相中所用到的各种酸进行考察。
②参照3.1.3中的方法，色谱柱为岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ(150mm，2.1mm，1.9μm)；柱温40℃，流动相流速为0.3ml/min，小贯众提取物供试品溶液参照3.1.4.1中的制备方法，分别采用乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％甲酸和乙腈-0.1％乙酸为流动相进行色谱分析，结果如图11所示。
由图11可知，加酸比不加酸峰型好，流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液系统时峰型最佳，故选择乙腈-0.1％磷酸溶液进行洗脱。
3.1.4.3不同提取溶剂的考察
取实施例一制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，每份平行2个样品，分别置具塞锥形瓶内，分别精密加入25ml水、50％(v/v)乙醇、75％(v/v)乙醇、95％(v/v)乙醇、50％(v/v)甲醇、75％(v/v)甲醇、100％甲醇，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各供试品溶液。按照3.1.3中方法进样，色谱条件为：流动相A为100％乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ(150mm，2.1mm，1.9μm)；柱温为40℃，流速为0.3ml/min，记录峰面积。结果如表20所示。
表20不同提取方式的提取效率对比(峰面积/称样量)
特征峰 水 95％乙醇 75％乙醇 50％乙醇 100％甲醇 75％甲醇 50％甲醇
峰1 188 196 196 191 199 194 190
峰2 116 104 114 115 113 115 115
峰3 39 33 37 37 37 39 37
峰4 18 24 24 24 23 24 24
由表20可知，提取溶剂为100％甲醇时提取效率较高，因此选择100％甲醇作为提取溶剂。
采用上述优化后的条件来测定实施例一制得小贯众提取物的特征图谱，方法如下：
供试品溶液的制备
取实施例一制得小贯众提取物约0.12g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入100％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，即得，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，得到小贯众提取物供试品溶液。
分别吸取10μL3.1.1中参照物溶液和上述供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行分析,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ)；以100％乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按表18中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃，流速为0.3ml/min。结果如图12所示。
由图12可知，小贯众提取物的特征图谱中有4个特征峰，与参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其中，峰1(S)的相对保留时间为1.00，峰2的相对保留时间为2.15，峰3的相对保留时间为2.53，峰4的相对保留时间为4.27。
3.2对构建方法的方法学的考察
3.2.1专属性考察
分别吸取3.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液与100％甲醇溶剂各1μl，注入液相色谱仪中，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定。结果如图13所示。
由图13可知，溶剂对小贯众提取物图谱中的特征峰均没有干扰。
3.2.2整体性考察
吸取3.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液1μl，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，在梯度终点的流动相比例下延长一倍洗脱时间，特征图谱如图14所示。
由图14可知，该色谱条件延长一倍洗脱时间后无明显色谱峰，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则。
3.2.3精密度考察
吸取3.1中优化条件后制得的小贯众提取物供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，重复进样6次，进样量为1ul。考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性(标定4个特征峰，以峰1为参照峰)，实验结果如表21所示。
表21小贯众提取物特征图谱精密度结果(相对保留时间)
由表21可知，各色谱峰相对保留时间的RSD<3.0％，说明该仪器精密度良好。
3.2.4稳定性考察
取实施例一制备的小贯众提取物，按照3.1中优化后的条件制备小贯众提取物的供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，分别在供试品溶液制备后的0，2，4，6，8，12，24小时进样，进样体积1μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性(标定4个特征峰，以峰1为参照峰)，实验结果如表22所示。
表22小贯众提取物特征图谱稳定性结果(相对保留时间)
序号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD/％
峰1(S) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
峰2 2.17 2.17 2.17 2.17 2.17 2.16 2.17 0.19
峰3 2.56 2.56 2.56 2.56 2.56 2.55 2.56 0.23
峰4 4.32 4.31 4.32 4.32 4.31 4.29 4.31 0.30
由表22可知，色谱峰相对保留时间的RSD<3.0％，说明该样品溶液比较稳定。
3.2.5重复性考察
取实施例一制备得到的小贯众提取物共6份，按3.1中优化后的条件制备供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，进样体积1μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性(标定4个特征峰，以峰1为参照峰)，实验结果如表23所示。
表23小贯众提取物特征图谱重复性结果(相对保留时间)
序号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD％
峰1(S) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
峰2 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 0.04
峰3 2.55 2.55 2.55 2.55 2.55 2.55 2.55 0.05
峰4 4.30 4.31 4.30 4.31 4.30 4.31 4.31 0.04
由表23可知，各色谱峰相对保留时间的RSD<3.0％，说明该方法重复性良好。
3.2.6耐用性考察
3.5.6.1不同色谱柱考察
取实施例一制备得到的小贯众提取物，按3.1中优化后的条件制备供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，进样体积1μl，其中色谱柱分别为：色谱柱1-Shim-pack GIST-HP C18-AQ(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；色谱柱2-WatersACOUITYHSS T3(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；色谱柱3-DIKMAEndeavorsil C18(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，考察三根色谱柱对小贯众提取物特征图谱的出峰情况的影响。结果如图15以及表24所示。
表24小贯众提取物特征图谱色谱柱考察结果(相对保留时间)
由图15以及表24可知：色谱柱对特征图谱影响较大。采用1Shim-pack GIST-HPC18-AQ(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)的超高效液相色谱柱进行洗脱，色谱峰峰型较好，分离效果最佳，因此本方法采用型号为Shim-pack GIST-HP C18-AQ(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)的液相色谱柱。
3.2.6.2不同柱温考察
取实施例一制备得到的小贯众提取物，按3.1中优化后的条件制备供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，进样体积1μl，其中，柱温分别为30℃、35℃、40℃，比较30℃、35℃、40℃不同柱温对样品的分离效果，结果如图16和表25所示。
表25小贯众提取物特征图谱柱温考察结果(相对保留时间)
由图16和表25可知，柱温对出峰情况影响不大，但柱温为40℃时分离效果最佳，峰型较好，因此选择柱温40℃。
3.5.6.3不同流速考察
取实施例一制备得到的小贯众提取物，按3.1中优化后的条件制备供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，进样体积1μl，其中，流速为0.2ml/min、0.25ml/min、0.3ml/min，对不同流速(0.2ml/min、0.25ml/min、0.3ml/min)洗脱情况进行考察。结果如图17和表26所示。
表26小贯众提取物特征图谱流速考察结果(相对保留时间)
流速 峰1(S) 峰2 峰3 峰4
0.25ml/min 1.00 2.01 2.34 3.77
0.30ml/min 1.00 2.13 2.53 4.23
0.35ml/min 1.00 2.43 2.73 4.77
由图17和表26可知，流速对出峰情况影响不大，但当流速为0.3ml/min峰型最佳。因此选择0.3ml/min。
实施例二
1.小贯众标准汤剂的制备方法
(1)取小贯众饮片(YP2106-2)100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮直接加入到12倍小贯众饮片重量的水中，浸泡30分钟，武火(500W)煮沸后文火(200W)保持微沸35分钟，煎液经300目筛网趁热过滤；第二次煎煮加10倍小贯众饮片重量的水，武火加热煮沸后文火保持微沸25分钟，煎液用300目筛网趁热过滤，合并两次滤液；
(2)将滤液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090MPa)至100ml的浸膏，测量其密度为1.07g/ml、出膏率为13.86％；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为1ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，先进行预冻，预冻温度为-55℃，预冻时间为2小时，然后进行一次干燥，干燥温度依次为-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-10℃和0℃，真空度为0.2mbar，干燥时间分别为3小时、7小时、20小时、10小时、2小时、1小时和2小时，接着进行二次干燥，干燥温度依次为10℃、20℃和30℃，真空度为0mbar，干燥时间分别为1小时、1小时和5小时，取出，轧铝盖，得到小贯众标准汤剂。
2.原儿茶酸质量含量及转移率的检测
采用实施例一中的方法测得小贯众标准汤剂中原儿茶酸的质量含量为3.22mg/g，原儿茶酸的转移率为40.51％。
3.小贯众标准汤剂的特征图谱的测定方法
按照实施例一所示的检测方法测定小贯众标准汤剂的特征图谱，其包含四个峰，分别为峰1(S)的相对保留时间为1.00，峰2的相对保留时间为2.15，峰3的相对保留时间为2.53，峰4的相对保留时间为4.27。
实施例三共有峰的确定
按照实施例一中优化条件后的小贯众提取物的特征图谱的构建方法测定15批小贯众提取物样品和小贯众对照药材的超高效液相色谱图，其中，15批小贯众提取物采用15批不同来源的小贯众饮片按照实施例一的方法制得，小贯众对照药材供试品溶液的制备方法如下：取小贯众对照药材(批号为YP2106-1)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入100％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，得到小贯众对照药材供试品溶液。
采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择其共有峰，如图18和表27所示。
表27样品测定结果
由图18和表27可知，小贯众提取物供试品特征图谱中呈现4个特征峰，并与对照药材供试品色谱中的4个特征峰的保留时间相对应；以峰1为参照峰，15批小贯众提取物特征图谱的其余3个特征峰相对保留时间RSD值在0.24％-0.25％，均小于1.0％，符合小贯众提取物特征图谱的标准要求。
实施例四
1.小贯众配方颗粒制备方法
(1)取100g小贯众饮片(YP2106-1)，加水煎煮二次，煎煮前浸泡0.5小时，第一次加6倍水，加热至沸，保持微沸1.0小时，煎液经200目滤过。第二次加5倍水加热至沸，保持微沸0.5小时，煎液经200目晒网滤过，合并两次滤液。
(2)将滤液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.04～-0.08MPa)至100ml的浸膏，测量其密度为1.05g/ml，浸膏煮沸处理，使浸膏充分溶解后加入10g麦芽糊精混匀过六号筛(100目)后进行喷雾干燥，其中，物料温度：(80℃)，喷雾干燥进风温度(155℃)，出风温度(100℃)；加入适量二氧化硅和硬脂酸镁过五号筛(80目)，干粉与配料混合整粒过筛(上层10目，下层40目)；
(3)称取10g步骤(3)所得干膏粉，粉碎后过80目筛，加入0.01g二氧化硅和0.01g硬脂酸镁混匀，整粒过筛(上层10目，下层40目)，制得小贯众配方颗粒-1。
2.小贯众配方颗粒的特征图谱的检测
2.1参照品溶液的制备
取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加100％甲醇制成每1ml含原儿茶酸16μg的对照品溶液，摇匀，即得。
2.2供试品溶液的制备
取上述制得小贯众配方颗粒-1约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入100％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用100％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，即得，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内。
2.3超高效液相色谱分析
分别吸取2μL2.1中参照物溶液和2.2中供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行分析，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以100％乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表18中的规定进行梯度洗脱，流速为0.3ml/min，柱温为40℃，在252nm波长下进行测定。
按照上述方法测的小贯众配方颗粒的特征图谱如图19所示，其包含四个峰，分别为峰1(S)的相对保留时间为1.00，峰2的相对保留时间为2.15，峰3的相对保留时间为2.53，峰4的相对保留时间为4.27。
实施例五
1.小贯众配方颗粒的薄层色谱鉴定方法
1.1供试品溶液的制备
选用不同批次的小贯众饮片(批号YP2106-2和YP2106-3)，按照实施例四的方法制备小贯众配方颗粒-2和小贯众配方颗粒-3，分别称取0.2g小贯众配方颗粒-1、小贯众配方颗粒-2和小贯众配方颗粒-3，共3份，研细，加5ml100％甲醇溶解，超声处理10分钟，过滤，作为供试品溶液。
1.2小贯众对照品溶液
取1g小贯众饮片(YP2106-1)，加20mL水，加热回流30min，过滤，滤液蒸干收集残渣，加2mL100％甲醇溶解，作为小贯众对照品溶液。
1.3小贯众配方颗粒阴性样品溶液
分别称取0.2g麦芽糊精，研细，加5ml100％甲醇溶解，超声处理10分钟，过滤，作为供试品溶液。
1.4薄层色谱条件
薄层板为硅胶G薄层板；
展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(体积比为1:12:2.5:3)；
展开方式：采用双槽展开缸，展开距离为8cm，展开两次；
检视：喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光365nm下检视。
2.点样量的考察
取1.1小贯众配方颗粒-1的供试品溶液、1.2小贯众对照品溶液，对小贯众配方颗粒鉴定方法中点样量(2、4、8μL)进行考察，按上述薄层色谱条件展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光365nm下检视，薄层色谱图如图20所示。
由图20可见，当点样量为4μl时，供试品中与对照药材相应位置主斑点清晰，无其他干扰，因此后续鉴定选择点样量为4μl。
3.小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法专属性考察
分别吸取1.1小贯众配方颗粒供试品溶液、1.2小贯众对照品溶液及1.3小贯众配方颗粒阴性样品各4μl点于同一硅胶G薄层板上，按照上述薄层色谱条件展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光365nm下检视，薄层色谱图如图21所示。
由图21可见，小贯众配方颗粒色谱与小贯众对照药材色谱的相对应位置上显相同颜色的斑点，且阴性样品无干扰。说明该薄层方法专属性好。
4.小贯众配方颗粒薄层色谱鉴定方法耐用性考察
4.1不同温度的考察
分别吸取小贯众配方颗粒供试品溶液、小贯众对照品溶液及小贯众配方颗粒阴性样品各4μl点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件，分别在不同温度(5℃,25℃,35℃)条件下展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光365nm下检视，薄层色谱图见图22-1至图22-3。
由图22-1至图22-3可见，不同温度条件下，小贯众配方颗粒供试品色谱与对照品薄层色谱的相应位置上显相同颜色的荧光斑点，显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，表明温度对小贯众配方颗粒薄层鉴别无明显影响，说明该薄层鉴别方法对湿度的耐用性良好。
4.2不同湿度的考察
分别吸取小贯众配方颗粒供试品溶液、小贯众对照品溶液及小贯众配方颗粒阴性样品各4μl点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件，分别在不同湿度(RH：33％，RH：66％，RH：88％)条件下展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光365nm下检视，薄层色谱图见图23-1至图23-3。
由图23-1至图23-3可见，不同湿度条件下，小贯众配方颗粒供试品色谱与对照品薄层色谱的相应位置上显相同颜色的荧光斑点，且主要斑点均显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，表明湿度对小贯众配方颗粒薄层鉴别无明显影响，说明该薄层鉴别方法对湿度的耐用性良好。
4.3不同厂家薄层板的考察
分别吸取小贯众配方颗粒供试品溶液、小贯众对照品溶液及小贯众配方颗粒阴性样品各4μl点于不同厂家的薄层板(青岛海洋硅胶G板、国药集团化学试剂硅胶G板、德国Merck板)上，按上述薄层色谱条件，分别在同一温湿度条件下展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光365nm下检视，薄层色谱图如图24-1至图24-3。
由图24-1至图24-3可见，采用不同厂家的硅胶薄层板(青岛海洋硅胶G板、国药集团化学试剂硅胶G板、德国Merck板)，小贯众配方颗粒供试品色谱与对照品薄层色谱的主要斑点能相对应，无显著影响，说明该薄层色谱鉴定方法对不同厂家薄层硅胶G板的耐用性较好。
5.小贯众配方颗粒的薄层色谱鉴定
分别吸取4μl小贯众配方颗粒-1供试品溶液、小贯众配方颗粒-2供试品溶液、小贯众配方颗粒-3供试品溶液、小贯众对照品溶液及小贯众配方颗粒阴性样品点于同一硅胶G薄层板上，按照上述薄层色谱条件展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光365nm下检视，薄层色谱图如图25所示。
由图25可见，3批小贯众配方颗粒中供试品色谱在与小贯众对照品色谱的对应位置上呈相同颜色斑点，说明3批小贯众配方颗粒的薄层鉴别均符合规定。
综上，从上述色谱图斑点来看，小贯众配方颗粒斑点分离效果较好，且小贯众配方颗粒色谱与小贯众对照品色谱相对应位置上显相同颜色的荧光斑点。该方法能对失去饮片性状的小贯众配方颗粒进行有效的定性鉴别。通过薄层色谱方法学考察，该方法的专属性和耐用性良好，适用于小贯众配方颗粒的薄层色谱鉴别。
实验例一
按下述方法将实施例四制备得到的小贯众配方颗粒-1与实施例五制备得到的小贯众配方颗粒-2和小贯众配方颗粒-3进行加速稳定实验和长期稳定性试验；
1.加速稳定试验
分别取小贯众配方颗粒-1、小贯众配方颗粒-2和小贯众配方颗粒-3，按市售铝箔复合膜包装，于温度40℃±2℃、相对湿度75％±5％条件下放置6个月，在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，测试配方颗粒的形状、粒度、水分、溶化性、薄层色谱鉴定、微生物鲜度、特征图谱、浸出物和原儿茶酸含量的测定，结果如表28所示。
2.长期稳定性试验
分别取小贯众配方颗粒-1、小贯众配方颗粒-2和小贯众配方颗粒-3，用铝箔复合膜包装，于温度30℃±2℃、相对湿度65％±5％条件下放置12个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月取样一次，测试配方颗粒的形状、粒度、水分、溶化性、薄层色谱鉴定、微生物鲜度、特征图谱、浸出物和原儿茶酸含量的测定，结果如表29所示。
表28加速稳定性试验结果
表29长期稳定性试验结果
由表28和表29可知，加速稳定试验和长期稳定试验结果表明，含有本发明方法制得小贯众提取物的小贯众配方颗粒，水分含量稳定，耐吸潮，浸出物和原儿茶酸含量稳定。其中特征图谱按照实施例四中小贯众配方颗粒的特征谱图的检测方法进行，结果表明，稳定试验前后，小贯众配方颗粒的特征谱图也都满足要求，说明本发明制得小贯众提取物稳定性好，可用于小贯众提取物及其制剂的质量控制。
综上所述，本发明采用将小贯众加水煎煮，进行过滤得到滤液，将滤液进行浓缩干燥得到小贯众提取物，所制得小贯众提取物的出膏率为6.3-16.8％，将所制备得到的小贯众提取物使用超高效液相色谱分析进行原儿茶酸质量含量及其转移率的检测，其结果为：原儿茶酸的质量含量为1.82-5.00mg/g，原儿茶酸的转移率为20.14-56.56％。并且采用的检测方法精密度高，重复性好，24小时内供试品溶液的稳定性良好。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种小贯众提取物的制备方法，其特征在于，包括将小贯众药材进行两次水煎煮并过滤得到煎煮液，将煎煮液经浓缩、干燥得到小贯众提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，第一次水煎煮加6～9倍量的水，优选第一次水煎煮时间为36～50min；第二次水煎煮加5～7倍量的水，优选第二次水煎煮时间为25～35min。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述干燥为冷冻干燥，分成三个阶段：a.预冻：预冻温度为-55～-50℃；b.一次干燥：干燥温度-45～0℃；c.二次干燥进行解析：干燥温度为10～30℃；
优选地，所述预冻时间为2～5小时，优选为3小时；所述一次干燥时间为35～45小时，优选为39小时；所述二次干燥时间为5～7小时，优选为6小时；
更优选地，所述一次干燥的真空度为0～0.2mbar。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩的温度为60～65℃；优选地，浓缩至浓缩液密度为1.05～1.08g/mL。
5.一种小贯众提取物，其特征在于，由权利要求1～4任一项所述制备方法制得；
优选地，按干燥品计，所述小贯众提取物中原儿茶酸质量含量为1.82-5.00mg/g，更优选地，原儿茶酸的转移率为20.14-56.56％。
6.权利要求5所述小贯众提取物中原儿茶酸质量含量和/或原儿茶酸转移率的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)参照物溶液的制备
称取原儿茶酸对照品，加入溶剂制成溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取小贯众提取物，加入溶剂进行提取；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述溶剂选自稀乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇和100％甲醇中的一种或两种以上，优选为稀乙醇，和/或，
步骤(2)中所述提取采用回流提取、振摇提取或超声提取中一种，优选为超声提取，优选地，步骤(2)中所述提取时间为15-60min，优选为15min，和/或，
步骤(3)所述有机溶剂选自乙腈或甲醇，优选为乙腈，优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱的条件为：在0-5min，流动相A为5％，流动相B为95％，5-15min，流动相A为5％→9％，流动相B为95％→91％，15-15.1min，流动相A为9％→5％，流动相B为91％→95％，15.1-20min，流动相A为5％，流动相B为95％。
8.权利要求5所述小贯众提取物的特征图谱的构建方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)参照物溶液的制备
称取原儿茶酸对照品，加入溶剂制成溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取小贯众提取物，加入溶剂进行提取；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相A，以水相为流动相B进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
9.根据权利要求8所述的小贯众提取物特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中的溶剂选自水、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇和100％甲醇中的一种或两种以上，优选为100％甲醇，和/或，
步骤(2)中所述提取采用回流提取、振摇提取或超声提取中一种，优选为超声提取；优选地，步骤(2)中所述提取时间为15～60min，优选为30min，和/或，
步骤(3)所述有机溶剂选自乙腈或甲醇，优选为乙腈；优选地，步骤(3)所述水相选自水、0.1％甲酸溶液、0.1％磷酸溶液和0.1％乙酸溶液中的一种，优选为0.1％磷酸溶液；更优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱的条件为：在0-5min，流动相A为5％，流动相B为95％，5-21min，流动相A为5％→12％，流动相B为95％→88％，21-24min，流动相A为12％→16％，流动相B为88％→84％，24-34min，流动相A为16％→18％，流动相B为84→82％，34-38min，流动相A为18％→60％，流动相B为82％→40％，38-38.2min，流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％，38.2-40min，流动相A为5％，流动相B为95％。
10.权利要求5所述的小贯众提取物的鉴定方法，其特征在于，包括通过薄层色谱法鉴定所述小贯众提取物；所述薄层色谱法包括如下步骤：a.制备小贯众提取物供试品溶液和小贯众对照品溶液；b.将小贯众提取物供试品溶液和小贯众对照品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，加展开剂展开，取出晾干，喷以显色剂使斑点显色，检测，即得；
优选地，所述小贯众提取物供试品溶液通过包括如下步骤制得，取小贯众提取物0.1-1g，加甲醇溶解，经超声处理后过滤即得；优选所述小贯众对照品溶液通过包括如下步骤制得，取小贯众药材1-3g，加水加热回流、过滤，滤液蒸干得到残渣，用甲醇溶解残渣即得；
更优选地，所述展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水，进一步优选地，所述甲苯、乙酸乙酯、甲酸和水的体积比为1:12:2.5:3。
11.权利要求5所述小贯众提取物在用于制备保健食品、中药药品的用途；优选地，所述中药药品为标准汤剂、胶囊剂、片剂、冲剂或配方颗粒。
12.一种标准汤剂，其特征在于，通过权利要求5所述的小贯众提取物制备得到。
13.一种配方颗粒，其特征在于，根据权利要求5的小贯众提取物通过添加辅料制得。
14.权利要求6或7所述的小贯众提取物中原儿茶酸质量含量和/或原儿茶酸转移率的测定方法或者权利要求8或9所述的小贯众提取物特征图谱的构建方法在小贯众提取物及其制剂中的应用。
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