CN110376294A - 一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法 - Google Patents

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    • G01N30/02—Column chromatography

Abstract

本发明涉及中药制剂的质量检测方法，具体公开一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法。所述瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，至少包括以下步骤：将瓜蒌配方颗粒内容物以甲醇为提取溶剂提取，过滤，所得滤液即为供试品溶液；以腺嘌呤和尿苷为对照品，分别采用甲醇溶解，得腺嘌呤对照品溶液和尿苷对照品溶液；采用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.1‑0.2％的甲酸水溶液；梯度洗脱，检测波长为260nm；柱温为20‑30℃；流速0.5‑1.5mL/min。本发明提供的瓜蒌配方颗粒的指纹图谱的构建方法，有利于从整体上更好地控制产品的质量。

Description

一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及中药制剂的质量检测方法，尤其涉及一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法。
背景技术
中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，是一种综合的，可量化的鉴定手段。目前，以指纹图谱作为中药提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识。
高效液相色谱法是鉴别化合物和确定物质结构的常用手段之一。在药物分析中，以液相色谱具有的“指纹”特性作为药物鉴定的依据，是各国药典共同采用的方法。但由于中药材、中药饮片和中成药本身都是远比西药复杂得多的混合物体系，图谱解析困难，使常规液相色谱法在较长时期内未能在中药质量控制和管理中发挥其应有的作用。
目前，药典对瓜蒌配方颗粒的含量测定指标性成分并无确切规定，因此建立瓜蒌配方颗粒的指纹图谱，为全面建立瓜蒌配方颗粒的质量控制标准提供科学依据。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，为全面建立瓜蒌配方颗粒的质量控制标准提供科学依据。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，至少包括以下步骤：
步骤a、将瓜蒌配方颗粒内容物以甲醇为提取溶剂提取，过滤，所得滤液即为供试品溶液；
步骤b、以腺嘌呤和尿苷为对照品，分别采用甲醇溶解，得腺嘌呤对照品溶液和尿苷对照品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.1-0.2％的甲酸水溶液；梯度洗脱，检测波长为260nm；柱温为20-30℃；流速0.5-1.5mL/min。
相对于现有技术，本发明提供的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，具有以下优势：
本发明以瓜蒌配方颗粒中含量较多的腺嘌呤和尿苷为对照品，建立瓜蒌配方颗粒的高效液相指纹图谱检测方法，不仅能从色谱的整体面貌上体现瓜蒌配方颗粒有效成分含量情况，有效的表征其质量，还有利于从整体上更好地控制产品的质量，为药品的生产和临床应用提供了有效保障。
本发明提供的方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，能够快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
C18色谱柱为GL Sciences InertSustain AQ-C18(4.6×250nm,5μm)色谱柱或Agilent Zorbax Eclipse plus C18(4.6×250nm，5μm)。AQ-C18色谱柱，内径为4.6mm，柱长为250mm，填料粒度为5μm，优选的柱内径、柱长、填料粒径与流速相配合，可以避免管壁效应。
优选地，所述指纹图谱有12个特征共有峰，其中2号色谱峰为腺嘌呤，3号色谱峰为尿苷，以腺嘌呤为参照峰，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：
峰1：0.51；峰2：1.00；峰3：1.62；峰4：2.34；峰5：2.68；峰6：2.98；峰7：3.14；峰8：3.73；峰9：5.10；峰10：5.21；峰11：5.67；峰12：6.96。
本发明使用前述方法测定共10个批次的瓜蒌配方颗粒，得到10批次的重瓜蒌配方颗粒指纹图谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》相似度软件，对10批次瓜蒌配方颗粒HPLC图谱进行相似度评价，不同批次瓜蒌配方颗粒指纹图谱的相似度大于0.9，说明各批次的样品色谱模式相似，其化学成分一致性较好。
指纹图谱注重各特征峰的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，标定了12个共有峰，反应信息比较完全，保证了产品质量的长期稳定性，疗效的安全性和可靠性。
优选地，所述柱温为25℃。
优选地，所述流动相B为体积比为0.1％的甲酸水溶液。
优选地，所述流速为0.8mL/min，进样量为10-20μL。
选择0.8mL/min的流速，待测溶液的保留时间和分离效果更为理想。
所述进样量优选为10μL，该进样量可以使峰面积大小适中，测量结果更为准确。
优选地，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0-15min，2％-13％流动相A；
15-25min，13％-18％流动相A；
25-45min，18％-40％流动相A；
45-80min，40％-75％流动相A。
由于待测溶液中成分复杂，用单一流动相可能无法良好分离各组分，使用优选的洗脱时间及流动相比例，可以使待测溶液中性质差异较大的组分根据各自的性质、按各自适宜的容量因子k实现良好的分离。
优选地，步骤a中，称取所述瓜蒌配方颗粒内容物1-3g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50％-100％的甲醇5-15mL，提取，摇匀，过滤，所得滤液即为所述供试品溶液。
优选地，步骤a中，称取所述瓜蒌配方颗粒的内容物2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇10mL，提取，摇匀，采用微孔滤膜，且所述滤膜孔径为0.45μm，所得滤液即为所述供试品溶液。
优选地，所述提取的方式为超声处理35-45min或加热回流50-70min。
优选地，所述提取的方式为超声处理40min或加热回流60min。
优选地，步骤b中，所述甲醇的体积浓度为70％-100％，且所述腺嘌呤对照品溶液的浓度为50μg/mL，所述尿苷对照品溶液的浓度为50μg/mL。
优选地，所述指纹图谱的理论塔板数按腺嘌呤计算不低于4000。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例2提供瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图；
图3是本发明实施例2提供的瓜蒌配方颗粒供试品溶液与对照品溶液的高效液相色谱对照图；
图4是本发明实施例3提供瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图；
图5是本发明实施例4提供瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图；
图6是本发明实施例5提供的10批样品的高效液相色谱图；
图7是本发明实施例5提供的瓜蒌配方颗粒指纹图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、称取所述瓜蒌配方颗粒内容物2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50％的甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，提取，摇匀，过滤，所得滤液即为所述供试品溶液；
步骤b、以腺嘌呤和尿苷为对照品，分别采用甲醇溶解，分别配置浓度为50μg/mL的腺嘌呤对照品溶液和尿苷对照品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：GLSciences InertSustain AQ-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为体积比为0.1％的甲酸水溶液；检测波长为260nm；柱温为25℃；流速0.8mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱程序为：0-15min，2％-8％流动相A；15-25min，8％-15％流动相A；25-45min，15％-40％流动相A；45-80min，40％-75％流动相A。理论塔板数按腺嘌呤计算≥4000，瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图如图1所示。
实施例2
本发明实施例提供一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、称取所述瓜蒌配方颗粒内容物2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，提取，摇匀，过滤，所得滤液即为所述供试品溶液；
步骤b、以腺嘌呤和尿苷为对照品，分别采用甲醇溶解，分别配置浓度为50μg/mL的腺嘌呤对照品溶液和尿苷对照品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：GLSciences InertSustain AQ-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为体积比为0.1％的甲酸水溶液；检测波长为260nm；柱温为25℃；流速0.8mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱程序为：0-15min，2％-8％流动相A；15-25min，8％-15％流动相A；25-45min，15％-40％流动相A；45-80min，40％-75％流动相A。理论塔板数按腺嘌呤计算≥4000，瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图如图2所示。腺嘌呤对照品溶液、尿苷对照品溶液和瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图如图3所示，色谱峰2为腺嘌呤，色谱峰3为尿苷。
实施例3
本发明实施例提供一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、称取所述瓜蒌配方颗粒内容物2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，提取，摇匀，过滤，所得滤液即为所述供试品溶液；
步骤b、以腺嘌呤和尿苷为对照品，分别采用体积浓度为70％甲醇溶解，分别配置浓度为50μg/mL的腺嘌呤对照品溶液和尿苷对照品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：Agilent Zorbax Eclipse plus C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为体积比为0.1％的甲酸水溶液；检测波长为260nm；柱温为20℃；流速0.8mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱程序为：0-15min，2％-8％流动相A；15-25min，8％-15％流动相A；25-45min，15％-40％流动相A；45-80min，40％-75％流动相A。理论塔板数按腺嘌呤计算≥4000，瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图如图4所示。
实施例4
本发明实施例提供一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、称取所述瓜蒌配方颗粒内容物2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇10mL，密塞，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，提取，摇匀，过滤，所得滤液即为所述供试品溶液；
步骤b、以腺嘌呤和尿苷为对照品，分别采用甲醇溶解，分别配置浓度为50μg/mL的腺嘌呤对照品溶液和尿苷对照品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：GLSciences InertSustain AQ-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为体积比为0.2％的甲酸水溶液；检测波长为260nm；柱温为25℃；流速1.5mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱程序为：0-15min，2％-8％流动相A；15-25min，8％-15％流动相A；25-45min，15％-40％流动相A；45-80min，40％-75％流动相A。理论塔板数按腺嘌呤计算≥4000，瓜蒌配方颗粒的高效液相色谱图如图5所示。
实施例5
本实施例提供了一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，具体如下：
采用实施例2所述瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，建立10批次瓜蒌配方颗粒的指纹图谱，如图6所示，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对10批样品的指纹图谱进行合成，如图7所示，生成有12个共有峰构成的瓜蒌配方颗粒HPLC指纹图谱，其中2号色谱峰为腺嘌呤，3号色谱峰为尿苷。以10批样品生成的对照图谱为参照，计算相似度，如表1所示，相似度均大于0.90。其中各批号分别为S1：15050611；S2：18072411；S3：18072511；S4：18072611；S5：18072711；S6：18072811；S7：18091631；S8：19022431；S9：19022331；S10：18092731。
表1 10批瓜蒌配方颗粒的相似度
实施例6精密度考察
取实施例2所制备的供试品溶液，并采用实施例2提供的高效液相的色谱条件，重复进样6次，每次进样10μL，考察特征共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果分别如表2、表3、表4所示，特征共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5％，相似度均大于0.99，表明该方法精密度好。
表2特征共有峰相对保留时间
表3特征共有峰相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD％
1 1.429 1.415 1.409 1.419 1.46 1.44 1.428 1.32
2 1 1 1 1 1 1 1 0
3 1.196 1.205 1.208 1.195 1.202 1.181 1.198 0.8
4 0.575 0.58 0.554 0.573 0.543 0.528 0.559 3.69
5 0.525 0.529 0.531 0.525 0.539 0.53 0.53 0.99
6 0.594 0.597 0.6 0.595 0.568 0.584 0.59 2.04
7 0.959 0.968 0.971 0.963 0.918 0.95 0.955 2.05
8 0.379 0.381 0.383 0.373 0.354 0.38 0.375 2.86
9 0.452 0.467 0.457 0.453 0.439 0.461 0.455 2.1
10 0.446 0.468 0.433 0.463 0.45 0.472 0.455 3.29
11 0.399 0.426 0.383 0.404 0.391 0.412 0.403 3.73
12 0.3 0.32 0.315 0.301 0.315 0.306 0.31 2.62
表4特征共有峰相似度
实施例7重复性考察
取同一批样品，按照实施例2所述瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法中的供试品制备方法制备6份供试品溶液，在实施例2所述瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法的色谱条件下进行重复性考察，结果如表5、表6、表7所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5％且相似度均大于0.99，表明方法重复性良好。
表5特征共有峰相对保留时间
峰号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
1 0.494 0.495 0.496 0.498 0.5 0.501 0.497 0.59％
S 1 1 1 1 1 1 1 0.00％
3 1.588 1.592 1.596 1.604 1.607 1.609 1.599 0.54％
4 2.317 2.318 2.322 2.33 2.33 2.334 2.325 0.31％
5 2.625 2.629 2.636 2.65 2.651 2.657 2.641 0.49％
6 2.915 2.921 2.93 2.946 2.949 2.956 2.936 0.57％
7 3.069 3.075 3.084 3.102 3.105 3.112 3.091 0.57％
8 3.647 3.654 3.665 3.686 3.69 3.698 3.673 0.57％
9 4.987 4.997 5.012 5.039 5.046 5.059 5.023 0.58％
10 5.095 5.105 5.12 5.148 5.153 5.166 5.131 0.56％
11 5.547 5.558 5.575 5.605 5.611 5.625 5.587 0.56％
12 6.804 6.816 6.838 6.875 6.883 6.902 6.853 0.58％
表6特征共有峰相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
1 1.419 1.46 1.44 1.521 1.531 1.521 1.482 3.27％
S 1 1 1 1 1 1 1 0.00％
3 1.195 1.202 1.181 1.279 1.28 1.296 1.239 4.15％
4 0.573 0.543 0.528 0.556 0.555 0.564 0.553 2.86％
5 0.525 0.539 0.53 0.557 0.555 0.576 0.547 3.48％
6 0.595 0.568 0.584 0.591 0.592 0.583 0.585 1.67％
7 0.963 0.918 0.95 1.018 1.023 1.029 0.984 4.71％
8 0.373 0.354 0.38 0.388 0.392 0.391 0.38 3.80％
9 0.453 0.439 0.448 0.41 0.411 0.417 0.43 4.49％
10 0.449 0.443 0.446 0.409 0.411 0.404 0.427 4.89％
11 0.3 0.287 0.288 0.31 0.318 0.317 0.303 4.58％
12 0.308 0.315 0.307 0.334 0.333 0.346 0.324 4.97％
表7特征共有峰相似度
实施例8稳定性考察
取实施例4制备的供试品溶液，采用实施例2所述瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法中的色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、12小时进行检测，每次进样10μL，考察共有峰的相对保留时间、相对峰面积及相似度。结果如表8、表9、表10所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5％，相似度均大于0.99，表明供试品溶液12小时内稳定。
表8特征共有峰相对保留时间
峰号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
1 0.493 0.493 0.492 0.498 0.5 0.501 0.496 0.80％
S 1 1 1 1 1 1 1 0.00％
3 1.586 1.586 1.581 1.604 1.607 1.609 1.596 0.78％
4 2.316 2.316 2.311 2.33 2.33 2.334 2.323 0.41％
5 2.622 2.622 2.614 2.65 2.651 2.657 2.636 0.71％
6 2.912 2.911 2.902 2.946 2.949 2.956 2.929 0.80％
7 3.065 3.065 3.055 3.102 3.105 3.112 3.084 0.81％
8 3.644 3.641 3.63 3.686 3.69 3.698 3.665 0.81％
9 4.981 4.978 4.964 5.039 5.046 5.059 5.011 0.82％
10 5.088 5.086 5.071 5.148 5.153 5.166 5.119 0.81％
11 5.54 5.537 5.521 5.605 5.611 5.625 5.573 0.81％
12 6.794 6.791 6.771 6.875 6.883 6.902 6.836 0.83％
表9特征共有峰相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
1 1.429 1.415 1.409 1.521 1.531 1.521 1.471 4.00％
S 1 1 1 1 1 1 1 0.00％
3 1.196 1.205 1.208 1.279 1.28 1.296 1.244 3.66％
4 0.575 0.58 0.554 0.556 0.555 0.564 0.564 1.98％
5 0.525 0.529 0.531 0.557 0.555 0.576 0.546 3.72％
6 0.594 0.597 0.6 0.591 0.592 0.583 0.593 0.99％
7 0.959 0.968 0.971 1.018 1.023 1.029 0.995 3.20％
8 0.379 0.381 0.383 0.388 0.392 0.391 0.386 1.41％
9 0.452 0.467 0.457 0.416 0.435 0.417 0.441 4.86％
10 0.446 0.458 0.433 0.409 0.411 0.417 0.429 4.68％
11 0.399 0.406 0.383 0.372 0.396 0.368 0.387 3.98％
12 0.302 0.32 0.315 0.334 0.333 0.346 0.325 4.85％
表10特征共有峰相似度
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：至少包括以下步骤：
步骤a、将瓜蒌配方颗粒内容物以甲醇为提取溶剂提取，过滤，所得滤液即为供试品溶液；
步骤b、以腺嘌呤和尿苷为对照品，分别采用甲醇溶解，得腺嘌呤对照品溶液和尿苷对照品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.1-0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱；检测波长为260nm；柱温为20-30℃；流速0.5-1.5mL/min。
2.如权利要求1所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述指纹图谱有12个特征共有峰，其中2号色谱峰为腺嘌呤，3号色谱峰为尿苷，以腺嘌呤为参照峰，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：
峰1：0.51；峰2：1.00；峰3：1.62；峰4：2.34；峰5：2.68；峰6：2.98；峰7：3.14；峰8：3.73；峰9：5.10；峰10：5.21；峰11：5.67；峰12：6.96。
3.如权利要求1所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述柱温为25℃；和/或
所述流动相B为体积比为0.1％的甲酸水溶液；和/或
所述流速为0.8mL/min，进样量为10-20μL。
4.如权利要求1所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0-15min，2％-13％流动相A；
15-25min，13％-18％流动相A；
25-45min，18％-40％流动相A；
45-80min，40％-75％流动相A。
5.如权利要求1所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤a中，称取所述瓜蒌配方颗粒内容物1-3g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50％-100％的甲醇5-15mL，提取，摇匀，过滤，所得滤液即为所述供试品溶液。
6.如权利要求4所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤a中，称取所述瓜蒌配方颗粒的内容物2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇10mL，提取，摇匀，采用微孔滤膜，且所述滤膜孔径为0.45μm，所得滤液即为所述供试品溶液。
7.如权利要求5或6所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述提取的方式为超声处理35-45min或加热回流50-70min。
8.如权利要求7所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述提取的方式为超声处理40min或加热回流60min。
9.如权利要求1所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤b中，所述甲醇的体积浓度为70％-100％，且所述腺嘌呤对照品溶液的浓度为50μg/mL，所述尿苷对照品溶液的浓度为50μg/mL。
10.如权利要求1所述的瓜蒌配方颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述指纹图谱的理论塔板数按腺嘌呤计算不低于4000。
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