CN108426963A - 一种醋香附hplc指纹图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种醋香附HPLC指纹图谱的构建方法:将醋香附饮片粉末以甲醇提取获得供试品溶液;以α‑香附酮、香附烯酮、5‑羟甲基糠醛为对照品;测定10批以上醋香附并进行分析比较,得到由12个共有特征峰构成的醋香附HPLC指纹图谱。本发明构建指纹图谱的方法精密度、重现性及稳定性均良好;通过指纹图谱中共有峰的有无,可有效地对醋香附饮片的质量进行整体描述和评价,保证饮片质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。

Description

一种醋香附HPLC指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及中药质量检测技术领域,特别是涉及一种醋香附HPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
背景技术
香附为莎草科植物莎草Cyperusrotundus L.的干燥根茎,主要含有挥发油、黄酮、生物碱和三萜类化合物等。香附醋制后增强了疏肝理气止痛的作用,醋制品是中医临床常用的炮制规格。已经有现代研究比较了香附醋制前后α-香附酮、香附烯酮、圆柚酮、总黄酮、木犀草素、微量元素等含量的变化,但这些研究评价指标单一,或检测样本量较少,不足以表征香附醋制前后成分的差异变化,难以体现中药复杂成分的整体性和普遍性。2015年版《中国药典》一部香附项下收载有香附和醋香附2种炮制品,两者定性和定量指标基本相同,只是浸出物和挥发油限量稍有差别。可见,醋香附饮片的质量评价还缺乏专属性。目前,所见醋香附饮片指纹图谱的研究存在两个问题,一是所收集醋香附饮片不具有代表性,如醋香附样品多为实验室自制,即使从中药饮片GMP企业收集,所收集样本量较少;二是未对其中的特征峰进行归属。
发明内容
针对现有技术中缺乏能体现醋香附所含成分整体性和普遍性指纹图谱的问题,本发明提供一种醋香附HPLC指纹图谱的构建方法,可操作性强。
本发明的另一目的是采用上述方法获得的醋香附HPLC指纹图谱。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种醋香附HPLC指纹图谱的构建方法,包括以下步骤:
(1)精密称取醋香附饮片粉末0.5 g,精密加入甲醇20 mL,超声处理30 min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
(2)分别精密称取α-香附酮、香附烯酮、5-羟甲基糠醛对照品适量,加甲醇制成不同的对照品溶液;再分别精密量取以上3种对照品溶液适量,置同一量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度分别约为0.168mg/mL、0.070mg/mL、0.069mg/mL的混合对照品溶液混合对照品溶液;
(3)精密吸取对照品溶液或供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪;
色谱条件:
色谱柱:Intersil ODS-3 C18色谱柱,填料粒径5μm,柱长250mm,柱内径4.6mm;以甲醇为流动相A,以水为流动相B,梯度洗脱:
0-5 min,流动相A的体积百分含量由35%提高至54%;流动相B的体积百分含量由65%降低至46%;
5-80 min,流动相A的体积百分含量由54%提高至94%;流动相B的体积百分含量由46%降低至6%;
检测波长270nm,柱温:25℃,流速:1.0mL/min;
(4)测定10批以上醋香附饮片并进行分析比较,得到由其共有特征峰构成的醋香附HPLC指纹图谱。
步骤(1)中,所述粉末细度为过三号筛。
一种上述构建方法获得的醋香附HPLC指纹图谱,所述HPLC指纹图谱是由12个共有指纹峰构成,相对保留时间分别为0.076min,0.245min,0.261min,0.373min,0.515min,0.662min,0.732min,0.829min,0.840min,0.940min,1.000min,1.018min。
本发明具有以下优点:
本发明通过高效液相色谱建立了醋香附HPLC指纹图谱;构建指纹图谱的方法精密度、重现性及稳定性均良好;所构建指纹图谱能体现醋香附饮片所含成分的整体性和普遍性;通过指纹图谱中共有峰的有无,可有效地对醋香附饮片的质量进行整体描述和评价,保证其质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。
附图说明
图1为醋香附HPLC指纹图谱:其中,峰1为5-羟甲基糠醛、峰8为香附烯酮,峰11为α-香附酮;
图2为混合对照品的HPLC指纹图谱:其中,峰1为5-羟甲基糠醛、峰8为香附烯酮,峰11为α-香附酮;
图3为13批醋香附饮片HPLC图谱叠加图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 醋香附HPLC指纹图谱的构建
(1)精密称取醋香附饮片粉末0.5 g,精密加入甲醇20 mL,超声处理30 min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
(2)分别精密称取α-香附酮、香附烯酮、5-羟甲基糠醛对照品适量,加甲醇制成不同的对照品溶液;再分别精密量取以上3种对照品溶液适量,置同一量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度分别约为0.168mg/mL、0.070mg/mL、0.069mg/mL的混合对照品溶液混合对照品溶液;
(3)精密吸取对照品溶液或供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪;
色谱条件:
色谱柱:Intersil ODS-3 C18色谱柱,填料粒径5μm,柱长250mm,柱内径4.6mm;以甲醇为流动相A,以水为流动相B,梯度洗脱:
0-5 min,流动相A的体积百分含量由35%提高至54%;流动相B的体积百分含量由65%降低至46%;
5-80 min,流动相A的体积百分含量由54%提高至94%;流动相B的体积百分含量由46%降低至6%;
检测波长270nm,柱温:25℃,流速:1.0mL/min;
(4)测定13批醋香附饮片(来源见表1)并进行分析比较,得到由其共有特征峰构成的醋香附HPLC指纹图谱,如图1所示,包含12个共有特征峰,其中峰1为5-羟甲基糠醛、峰8为香附烯酮,峰11为α-香附酮;
选定13批样品,将其导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”,选取时间窗宽度为0.1min,以中位数生成对照谱图,经过多点校正后自动匹配,生成醋香附指纹图谱共有模式,以11号峰为参照峰,计算得出该标准指纹图谱具有的12个共有峰的相对保留时间见表2;13批醋香附饮片HPLC图谱与对照图谱之间的相似度依次为0.985,0.982,0.967,0.980,0.936,0.948,0.958,0.908,0.969,0.941,0.905,0.963,0.945。
表1 醋香附饮片收集情况
表2 13批醋香附样品共有峰
实施例2 标准指纹图谱构建方法的精密度
取实施例1中(1号样品)同一供试品溶液,连续进样6次,以11号峰为参照峰,计算出1-12号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值(表3、表4)均小于3%,同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.90,表明仪器方法稳定,精密度良好。
表3 同一供试品连续进样6次相对峰面积RSD
表4 同一供试品连续进样6次相对保留时间RSD
实施例3 标准指纹图谱构建方法的重复性
取实施例1中同一批醋香附饮片粉末(1号样品),精密称取6份,按实施例1中供试品制备方法平行制备6份供试品溶液,分别进样,以11号峰为参照峰,计算出1-12号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值(表5、表6)均小于3%,表明所述构建方法重现性良好。
表5 同一样品连续进样6次相对峰面积RSD
表6 同一供试品连续进样6次相对保留时间RSD
实施例4 标准指纹图谱的稳定性
取同一份供试品溶液(1号样品),分别于0,4,8,12,16,24h进样检测,以11号峰为参照峰,计算出1-12号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值(表7、表8)均小于3%,表明供试品溶液至少在24小时内稳定。
表7 同一供试品溶液24h内进样相对峰面积RSD
表8 同一供试品溶液24h内进样相对保留时间RSD

Claims (3)

1.一种醋香附HPLC指纹图谱的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)精密称取醋香附饮片粉末0.5 g,精密加入甲醇20 mL,超声处理30 min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
(2)分别精密称取α-香附酮、香附烯酮、5-羟甲基糠醛对照品适量,加甲醇制成不同的对照品溶液;再分别精密量取以上3种对照品溶液适量,置同一量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度分别约为0.168mg/mL、0.070mg/mL、0.069mg/mL的混合对照品溶液混合对照品溶液;
(3)精密吸取对照品溶液或供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪;
色谱条件:
色谱柱:Intersil ODS-3 C18色谱柱,填料粒径5μm,柱长250mm,柱内径4.6mm;以甲醇为流动相A,以水为流动相B,梯度洗脱:
0-5 min,流动相A的体积百分含量由35%提高至54%;流动相B的体积百分含量由65%降低至46%;
5-80 min,流动相A的体积百分含量由54%提高至94%;流动相B的体积百分含量由46%降低至6%;
检测波长270nm,柱温:25℃,流速:1.0mL/min;
(4)测定10批以上醋香附饮片并进行分析比较,得到由其共有特征峰构成的醋香附HPLC指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,所述粉末细度为过三号筛。
3.一种如权利要求1或2任一构建方法获得的醋香附HPLC指纹图谱,其特征在于,所述HPLC指纹图谱是由12个共有指纹峰构成,相对保留时间分别为0.076min,0.245min,0.261min,0.373min,0.515min,0.662min,0.732min,0.829min,0.840min,0.940min,1.000min,1.018min。
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