CN115932091A - 一种酸橙枳实配方颗粒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药配方颗粒检测技术领域，公开了一种酸橙枳实配方颗粒的检测方法。该方法包括首先比较供试品溶液和对照药材溶液色谱中特征峰对应情况，然后进一步根据芸香柚皮苷与柚皮苷的峰面积比值α₁、新橙皮苷与橙皮苷的峰面积比值α₂对枳实配方颗粒进行检测，该UPLC检测方法准确性、重复性和分离度均较好，缩短了检测时间，操作简便。本发明以模拟配方颗粒提取溶液作为评价基准，能够精准检测配方颗粒是否为酸橙枳实配方颗粒，弥补了其基原鉴定技术领域的空缺，该方法可作为酸橙枳实配方颗粒的专属鉴别方法。

Description

一种酸橙枳实配方颗粒的检测方法

技术领域

本发明属于中药配方颗粒检测技术领域，尤其涉及一种酸橙枳实配方颗粒的检测方法。

背景技术

枳实为芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrussinensis Osbeck的干燥幼果。主产于江西、四川、福建、江苏等地。据考证，枳实始载于《神农本草经》，列为中品，具有破气消积、化痰散痞的功效，为中医临床常用药物。宋代之前使用的枳实一般是来源于芸香科枸橘属植物枸橘，宋代之后存在两种来源，但以酸橙为道地药材，“翻肚如盆口唇状”为酸橙的特征，明清以来酸橙为枳实的正品来源，而枸橘则次之。甜橙作为枳实药材来源收载始于1995年版《中华人民共和国药典》，由于甜橙和酸橙基原不同，其产地、生长条件和采收时间均有差异，导致酸橙和甜橙来源的枳实药材在化学成分组成及含量上存在较大差异，而临床使用上以酸橙为主。2020年版《中华人民共和国药典》枳实项下药材和饮片的性状项目未对酸橙和甜橙外观性状特征进行区分，其余检测项目亦未有参数区别。

现有技术对枳实药材有一定的研究，如《中草药》2022年第53(14)期《不同基原枳实药材的质量差异评价研究》中，选定了21个特征峰进行质量评价，但半数以上特征峰面积过小、或分离欠佳。《中国中药杂志》2016年第17期《不同品种枳实HPLC指纹图谱和成分含量差异性进行研究》记载了一种应用高效液相色谱法进行指纹图谱及成分含量的研究，酸橙枳实的指纹图谱确定了21个共有峰，指认了12个色谱峰，甜橙枳实的指纹图谱确定了22个共有峰，指认了11个色谱峰，并测定了其含量，但部分色谱峰的分离度较差；《中草药》2009年第9期《枳实的高效液相色谱指纹图谱》记载了应用高效液相色谱对枳实开展指纹图谱研究，采用单一波长，色谱峰信息量较少。中国专利201610138007.9(CN106525988A)涉及的是一种枳实药材指纹图谱的检测方法及标准指纹图谱，采用转换波长法进行检测，检测波长为280nm、215nm，试验发现采用215nm波长检测时因近末端吸收，杂质干扰及基线波动均较大。以上研究均基于枳实药材进行研究，未对枳实配方颗粒相关项目进行考察，配方颗粒为药材水溶性成分经提取浓缩后制得，受提取效率影响，其与对应药材中成分有所差异，目前对于枳实配方颗粒的基原鉴定问题，尚未见有检测方法公开报道。

我国中药配方颗粒于2021年11月1日起结束试点工作，现阶段标准研究及生产的主要技术参考依据为国家药监局发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，其中针对原料要求固定基原，即相同药材的不同植物或动物来源不可混用。药材炮制为饮片后，再制成中药配方颗粒其失去了外观性状等鉴别特征，工业化生产的提取、浓缩、干燥、制粒等环节导致化学成分发生变化，更增加了基原鉴定的难度。目前临床使用中，枳实(酸橙)与枳实(甜橙)在部分适应症的评价中有所差异，以枳实(酸橙)功效更为显著。现行枳实(酸橙)配方颗粒国家标准中，特征图谱项收载特征峰为6个，根据样品实测情况，其无法对酸橙和甜橙基原的配方颗粒进行有效区分。因此目前缺少一种简便、直观检测和区分枳实(酸橙)与枳实(甜橙)配方颗粒的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题，在于克服现有方法无法区分枳实(酸橙)配方颗粒与枳实(甜橙)配方颗粒的缺陷，从而提供一种枳实配方颗粒基原鉴定的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种酸橙枳实配方颗粒的检测方法，包括如下步骤：

(1)参照物溶液的制备：

对照药材参照物溶液的制备：取对照药材加水煎煮，过滤后得到滤液，回收溶剂后得到残渣，然后加入甲醇，经超声，过滤后得到所述对照药材参照物溶液；

对照品参照物溶液：取橙皮苷对照品、川陈皮素对照品加入甲醇制成对照品参照物溶液；

(2)供试品溶液的制备：取酸橙枳实配方颗粒，研磨后取样，精密称定，加入甲醇，经超声，过滤后得到所述对供试品溶液；

(3)模拟颗配方粒溶液的制备：取酸橙枳实药材加水煎煮，过滤后得到滤液，回收溶剂后得到残渣，然后加入甲醇，经超声，过滤后得到所述模拟颗配方粒溶液；

(4)色谱条件为：照超高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为283nm、325nm；柱温为30℃；流速为0.25ml/min。

(5)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液1μL，注入超高效液相色谱仪，测定。

(6)特征图谱的建立：按照步骤(4)色谱条件进样，对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和自制模拟配方颗粒溶液进行分析，获得对应色谱图，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成拟合图，从而确定标准特征图谱；

(7)依次采用第一检测方法和第二检测方法对供试品进行检测；

所述第一检测方法为，所述供试品的超高效液相色谱图与所述对照药材溶液的色谱图进行检测比较，使用相对保留时间和扫描紫外吸收的方法进行特征峰确认；

所述第二检测方法为，以供试品溶液的超高效液相色谱色谱中芸香柚皮苷与柚皮苷的峰面积的比值α₁、新橙皮苷与橙皮苷峰面积的比值α₂进行检测。

进一步的，供试品色谱中应呈现11个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的11个特征峰保留时间相对应，其中2个峰应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应。与橙皮苷参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7与S1峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围内，规定值为：0.77(峰1)、0.89(峰2)、0.95(峰3)、1.07(峰5)、峰6(1.47)、峰7(1.57)；以川陈皮素参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰8、峰9、峰11与S2峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围内，规定值为：0.89(峰8)、0.93(峰9)、1.08(峰11)；扫描各特征峰在240～340nm范围内的吸收光谱，峰1～峰6应在283±2nm处有峰值吸收，峰7应在289±2nm处有峰值吸收，峰8应在324±2nm处有峰值吸收，峰9应在322±2nm处有峰值吸收，峰10应在334±2nm处有峰值吸收，峰11应在325±2nm处有峰值吸收。

进一步的，所述梯度洗脱的程序为0～20min，12→28％流动相A，88→72％流动相B；20～28min，28→47％流动相A，72→53％流动相B；28～37min，47％流动相A，53％流动相B。

进一步的，采用转换波长法，所述检测波长为：0～26min为283nm；26～37min为325nm。

进一步的，对照品溶液具体为：每1ml各含橙皮苷200μg、川陈皮素20μg的混合溶液。

进一步的，所述第二检测方法包括，采用公式Ⅰ进行检测，当α₁大于5.0，且α₂大于3.0时，所述供试品配方颗粒为酸橙配方颗粒；

其中，A₂为供试品配方颗粒中芸香柚皮苷峰面积，A₃为供试品配方颗粒中柚皮苷的峰面积，A₄为供试品配方颗粒中橙皮苷的峰面积，A₅为供试品配方颗粒中新橙皮苷的峰面积。

本发明的有益效果：

1.本发明采用超高效液相色谱法(UPLC)技术，建立枳实(酸橙)配方颗粒的UPLC对照特征图谱，确定了11个共有峰，并指认了其中7个，色谱图基线平稳，各特征峰分离度良好，易于检视，能够充分反映枳实(酸橙)配方颗粒的特征峰信息，方法稳定，精密度高，重现性及耐用性良好。

2.本发明提供的枳实(酸橙)配方颗粒的检测方法，包括先比较供试品溶液和对照药材溶液的色谱，使用相对保留时间和扫描紫外吸收的方法进行特征峰确认；再进一步根据柚皮苷与芸香柚皮苷的峰面积比值α₁、新橙皮苷与橙皮苷的峰面积比值α₂进行分析，在基于符合国家《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》相关批次数要求的基础上，通过性状对研究原料进行控制，保证了研究用原料的基原判断准确，相应研究数据及结论可以有效对枳实(酸橙)与枳实(甜橙)配方颗粒进行区分。本发明以对照药材溶液作为评价基准，研究用样品的处理方式与临床应用中的汤剂及配方颗粒工业提取方式均基本一致，通过多个限定参数，可以精准检测枳实配方颗粒是否为枳实(酸橙)配方颗粒，具有较高的实际应用价值。

3.本发明所使用到的11个特征峰检出情况及2个相对峰面积比的限定数值，在所有已判定基原无误的枳实(酸橙)药材煎液与配方颗粒成品中均可适用；在研究的部分明确基原的枳实(甜橙)药材煎液及其他基原枳实(甜橙)配方颗粒中，部分特征峰不及检测限要求(未检出)，所有批次样品均无法满足2个相对峰面积比的限定条件，依本发明所述方法均判为非枳实(酸橙)样品或配方颗粒，判断准确程度高。

4.本发明建立的特征图谱检测方法中的转换波长较单波长能够更全面的体现物质基础信息，较枳实(酸橙)配方颗粒法定标准中可更为全面反应其整体质量。通过波长的切换，增强了特征峰的可视化比较；通过相对保留时间结合最大紫外吸收共同对特征峰进行指认，可有效避免部分特征峰在规定时间窗内出现多个峰无法有效指认的情况；对11个特征峰中的7个进行了成分指认，更有效地表征了枳实(酸橙)配方颗粒的物质基础和质量信息，弥补了枳实(酸橙)在制成为配方颗粒后，性状与显微鉴别特征缺失后的基原判定缺陷。

5.本发明提供的枳实(酸橙)配方颗粒检测方法，以乙腈-0.1％甲酸溶液为流动相，采用梯度并结合紫外检测器检测的液相色谱分析得到枳实(酸橙)配方颗粒的特征图谱，根据峰面积比值即可判定所述枳实配方颗粒的基原，操作简便、高效，弥补了枳实(酸橙)配方颗粒基原鉴定技术领域的空缺，该方法可作为枳实(酸橙)配方颗粒的专属基原判断方法。

6.本发明提供的枳实(酸橙)配方颗粒检测方法，所选择样品前处理及仪器检测均经方法学考察及验证，包括取样量、溶剂考察、过滤温度等，是在实验室条件下对汤剂和成品制备的模拟，尽可能的对配方颗粒的制备过程予以还原，与配方颗粒成品比较还原程度较高。对照药材参照物溶液采用水回流提取，水提液蒸干后选用甲醇超声提取的方法制备，供试品溶液采用甲醇超声的方法制备，由此得到的对照药材参照物色谱与供试品色谱对比分析时更加准确，更具专属性。

附图说明

图1为本发明实施例1中枳实(酸橙)对照药材参照物溶液的液相色谱图；

图2为本发明实施例1中枳实(酸橙)模拟配方颗粒的叠加液相色谱图；

图3为本发明实施例1中枳实(酸橙)模拟配方颗粒的拟合液相色谱图；

图4为本发明实施例1中枳实(酸橙)配方颗粒的典型特征图谱；

图5～6为本发明实施例1中非枳实(酸橙)配方颗粒样品图谱。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清晰，以下将结合附图对实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。显而易见，以下实施例是本申请实施例的一部分，而不是全部，因此，以下对实施例的详细描述并非限定本申请要求保护的范围，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下做出的等同替换或修改，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

枳实(酸橙)配方颗粒标准特征图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

仪器：Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，Agilent 1290超高效液相色谱仪，均配备二极管阵列检测器；赛多利斯CP225D电子分析天平；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；调温电热套(上海树立仪器仪表有限公司)。

色谱柱：Thermo Acclaim RSLC C₁₈，2.1mm×100mm，2.2μm；Waters BEH C₁₈，2.1mm×100mm，1.8μm；Waters HSS C₁₈，2.1mm×100mm，1.8μm。

1.2试药

甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

对照品、对照药材、药材来源如下：

橙皮苷(批号：110721-202019，纯度：95.3％，中国食品药品检定研究院)；川陈皮素(批号：112055-202001，纯度：99.6％，中国食品药品检定研究院)；新橙皮苷(批号：111857-201804，纯度：99.4％，中国食品药品检定研究院)；橘皮素(批号：112054-202001，纯度：99.8％，中国食品药品检定研究院)；枸橘苷(批号：U0530010，纯度：98.4％，上海安谱实验科技股份有限公司)；柚皮苷(批号：110722-2017114，纯度：93.4％，中国食品药品检定研究院)；甜橙黄酮(批号：MUST-22011211，纯度：99.64％，成都曼思特生物科技有限公司)；芸香柚皮苷(批号：MUST-22040211，纯度：98.76％，成都曼思特生物科技有限公司)；枳实(酸橙)对照药材(批号：120936-201606，中国食品药品检定研究院)；

来自不同产区的枳实药材(酸橙)16批次，产地包括湖南沅江、江西新干、四川遂宁等。见表1。

表1枳实(酸橙)样品信息

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验：超高效液相色谱测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，(Thermo Acclaim RSLC C₁₈，2.1mm×100mm，2.2μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按表2所示梯度洗脱程序进行测定；检测波长为0～26min为283nm，26～37min为325nm；柱温为30℃；流速为0.25ml/min；理论板数均按橙皮苷峰计算应不低于5000。

表2洗脱梯度

2.2参照物溶液、模拟配方颗粒溶液和供试品溶液的制备

对照药材参照物溶液的制备：取酸橙对照药材0.2g，加水25ml，加热回流30min，趁热滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至25ml量瓶中，超声处理30分钟，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；

取橙皮苷对照品、川陈皮素对照品，加甲醇制成每1ml含橙皮苷200μg、川陈皮素20μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备：取枳实配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

模拟颗配方粒溶液的制备：取枳实(酸橙)药材取0.2g，加水25ml，加热回流30min，趁热滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至25ml量瓶中，超声处理30分钟，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为模拟颗配方粒溶液；

2.3测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，测定。

2.4确定检测波长

吸取上述酸橙对照药材参照物溶液，按照步骤(1)的检测条件，使用二极管阵列检测器在240～340nm波段下进行监测，记录色谱图，提取各目标峰检视紫外吸收情况。分析发现芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷等二氢黄酮类成分均在283nm附近有峰值吸收，川陈皮素、橘皮素等多甲基黄酮类成分多在325nm附近有峰值吸收。为更全面反映枳实配方颗粒中特征成分，同时满足特征峰的检视可辨识程度，避免末端吸收带来的杂峰干扰，故选用转换波长法进行测定，0～26min为283nm；26～37min为325nm。

2.5确定特征峰

酸橙药材对照特征图谱的建立：按照步骤(1)参照物溶液的制备方法，制备16批酸橙标准药材参照物溶液，按照步骤(2)的检测条件进行检测，记录色谱图；对16批酸橙药材共有峰信息进行分析，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批标准枳实(酸橙)药材提取样品的液相图谱进行合成，建立枳实(酸橙)药材的对照特征图谱，建立的特征图谱检测方法可以作枳实(酸橙)配方颗粒的基原判定方法。

通过软件匹配，酸橙药材确定了11个共有峰，确定枳实(酸橙)特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现11个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的11个特征峰保留时间相对应，其中2个峰分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应。与橙皮苷参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7与S1的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.77(峰1)、0.89(峰2)、0.95(峰3)、1.07(峰5)、1.47(峰6)、1.57(峰7)；与川陈皮素参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰8、峰9、峰11与S2的相对保留时间，在规定值的±10％范围内，规定值为：0.89(峰8)、0.93(峰9)、1.08(峰11)；扫描各特征峰在240～340nm范围内的吸收光谱，峰1～峰6应在283±2nm处有峰值吸收，峰7应在289±2nm处有峰值吸收，峰8应在324±2nm处有峰值吸收，峰9应在322±2nm处有峰值吸收，峰10应在334±2nm处有峰值吸收，峰11应在325±2nm处有峰值吸收。

色谱峰确认情况：根据对照品进行特征峰指认，峰2为芸香柚皮苷，峰3为柚皮苷，峰4为橙皮苷，峰5为新橙皮苷，峰6为枸橘苷，峰10为川陈皮素，峰11为橘皮素。

表3 16批枳实(酸橙)模拟配方颗粒相对保留时间汇总

表4 16批次枳实(酸橙)模拟配方颗粒相对峰面积情况

2.6检测方法：依次采用第一检测方法和第二检测方法对供试品溶液进行检测；

第一检测方法为，供试品色谱中的特征峰与所述对照药材色谱的特征峰进行比较，得判定结果1，若满足判定原则1相关要求，则继续按第二方法检测；

供试品的图谱结果分析，图中，供试品色谱中呈现与对照药材相应的11个特征峰，其中2个峰分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与橙皮苷参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰3，峰5、峰6、峰7与S1的相对保留时间，在规定值的±10％范围内，规定值为：0.77(峰1)、0.89(峰2)、0.95(峰3)、1.07(峰5)、1.47(峰6)、1.57(峰7)；以川陈皮素参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰8、峰9、峰11与S2的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.89(峰8)、0.93(峰9)、1.08(峰11)；扫描各特征峰在240～340nm范围内的吸收光谱，峰1～峰6应在283±2nm处有峰值吸收，峰7应在289±2nm处有峰值吸收，峰8应在324±2nm处有峰值吸收，峰9应在322±2nm处有峰值吸收，峰10应在334±2nm处有峰值吸收，峰11应在325±2nm处有峰值吸收。满足以上条件认为供试品(配方颗粒)为枳实(酸橙)配方颗粒。

第二检测方法为：采用公式Ⅰ进行检测，

其中，A₂为供试品配方颗粒中芸香柚皮苷峰面积，A₃为供试品配方颗粒中柚皮苷的峰面积，A₄为供试品配方颗粒中橙皮苷的峰面积，A₅为供试品配方颗粒中新橙皮苷的峰面积。当α₁大于5.0，且α₂大于3.0时，所述供试品配方颗粒为枳实(酸橙)配方颗粒；

标准药材及检测样品的色谱中峰2、峰3、峰4和峰5的峰面积和α₁、α₂的数值见表。

表5 6批确定为枳实(酸橙)基原的配方颗粒峰面积测定数据

编号/峰面积	<![CDATA[A<sub>2</sub>]]>	<![CDATA[A<sub>3</sub>]]>	<![CDATA[A<sub>4</sub>]]>	<![CDATA[A<sub>5</sub>]]>	<![CDATA[α<sub>1</sub>(A<sub>3</sub>/A<sub>2</sub>)]]>	<![CDATA[α<sub>2</sub>(A<sub>5</sub>/A<sub>4</sub>)]]>
							供试品1	1070388	11032306	700624	8237972	10.307	11.758
供试品2	1064794	10981908	699326	8192980	10.314	11.716
							供试品3	498141	9682861	1009751	12415046	19.438	12.295
供试品4	616520	11883925	1271317	15249836	19.276	11.995
							供试品5	490007	9505204	1009811	12193989	19.398	12.076
供试品6	583019	8635076	617174	10797743	14.811	17.495

上表中所列数据，供试样品α₁大于5.0且α₂大于3.0，供试品测定情况依拟定判断条件与实际投料相同，基原为枳实(酸橙)。

通过第一检测方法和第二检测方法结合，确认供试品配方颗粒为枳实(酸橙)配方颗粒。

2.4方法学考察

2.4.1精密度考察试验

取酸橙配方颗粒，按照实施例1步骤(2)的方法制成供试品溶液，连续进样6次，每次1μL，按照实施例1步骤(1)的色谱条件进行检测，记录色谱峰，找出共有特征峰，得到特征图谱。分别以4号峰为参照峰S1峰、以10号峰为参照峰S2峰，计算其余特征峰的相对峰面积和相对保留时间，其RSD值均小于1.0％，表明该仪器精密度良好。

2.4.2重复性考察试验

取酸橙配方颗粒(样)6份，按照实施例1步骤(2)的方法制成供试品溶液，按照实施例1步骤(1)的色谱条件进行检测，记录色谱峰，分别以4号峰为参照峰S1峰、以10号峰为参照峰S2峰，计算其余特征峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于1.0％，表明该方法重复性良好。

2.4.3稳定性考察试验

取酸橙配方颗粒(样)，按照实施例1步骤(2)的方法制成供试品溶液，按照实施例1步骤(1)的色谱条件在24小时内的规定时间点进行检测，记录色谱峰，分别以4号峰为参照峰S1峰、以10号峰为参照峰S2峰，计算其余特征峰的相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD值。各特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于1.0％，表明供试品溶液中的待测成分在本提取和测定条件下24小时内稳定性较好。

2.4.4耐用性考察

使用2台不同品牌超高效液相色谱仪3根C₁₈色谱柱进行考察。色谱仪：Waters UPLCH-Class、Agilent 1290；色谱柱：Thermo Acclaim RSLC，2.1mm×100mm，2.2μm、WatersBEH，2.1mm×100mm，1.8μm、Waters HSS T3，2.1mm×100mm，1.8μm。使用相对保留时间、紫外最大光谱吸收及相对峰面积的判定结果均一致，11个特征峰均可有效检出并满足相应要求，说明方法色谱柱耐用性良好。

表6耐用性试验相对保留时间汇总

表7耐用性试验最大吸收波长汇总(单位：nm)

表8耐用性试验相对峰面积汇总

枳实(酸橙)配方颗粒特征图谱的测定

1.1仪器

仪器：Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器，Empower 3色谱工作站；赛多利斯CP225D电子分析天平；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。色谱柱为Thermo Acclaim RSLC C₁₈，2.1mm×100mm，2.2μm。

1.2试药

甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

对照品、对照药材、药材来源如下：

橙皮苷(批号：110721-202019，纯度：95.3％，中国食品药品检定研究院)；川陈皮素(批号：112055-202001，纯度：99.6％，中国食品药品检定研究院)；

生产及流通环节随机收集枳实配方颗粒样品19批次，样品信息见附表。

按照本发明方法进行检测，检测结果见下表：

检测到8批与枳实(酸橙)对照特征图谱比对有明显的共有峰缺失(峰1、峰3、峰5、峰7、峰8、峰9)，其中4批与实际标识基原不符(标识为枳实(酸橙)配方颗粒)，另外4批未标识基原(标识为枳实配方颗粒)；检测到5批检出11个共有峰，但相对峰面积比α₁小于5.0，且α₂小于3.0，推测可能存在多基原混用的情况；6批符合本方法对枳实(酸橙)配方颗粒的判定依据。因此，通过构建UPLC特征图谱，可以有效对枳实配方颗粒是否为酸橙基原进行辨别，对评价枳实配方质量，辅助临床用药的有一定帮助。

甜橙冒充或混入时的判定

以甜橙冒充酸橙时，本方法中部分特征峰或无法有效检出；若因中药成分的复杂性导致相对保留时间范围内出现干扰峰无法判断，可辅以相对峰面积比做出判定。

若酸橙中掺入甜橙，因甜橙中芸香柚皮苷和橙皮苷含量高，且基本不含柚皮苷和新橙皮苷，故本方法应用时虽可有效检出规定特征峰，但相对峰面积比受影响较大，原料基原判断错误所致混用或掺杂将出现相对峰面积比超出规定范围情况，亦可作出相应判断。

表9市售样品测定结果

编号	生产厂家	批号	包装基原标识	基原检测结果
					1	A	2010001	酸橙	×(特征峰缺失)
2	A	2010002	酸橙	×(特征峰缺失)
					3	A	2010003	酸橙	×(特征峰缺失)
4	B	21041415	甜橙	×(酸橙)
					5	B	21070082	甜橙	×(酸橙)
6	B	2010041	酸橙	√(酸橙)
					7	B	2010042	酸橙	√(酸橙)
8	B	2010043	酸橙	√(酸橙)
					9	C	22003071	酸橙	√(酸橙)
10	D	1903001	未标识	非酸橙(特征峰缺失)
					11	D	1905001	未标识	非酸橙(相对峰面积比超规定值)
12	D	1908001	未标识	非酸橙(相对峰面积比超规定值)
					13	D	1910001	未标识	非酸橙(相对峰面积比超规定值)
14	D	1911001	未标识	非酸橙(特征峰缺失)
					15	D	2001001	未标识	非酸橙(特征峰缺失)
16	D	2102001	未标识	非酸橙(相对峰面积比超规定值)
					17	D	2108001	未标识	非酸橙(相对峰面积比超规定值)
18	D	2109001	未标识	非酸橙(特征峰缺失)
					19	D	2112001	酸橙	×(特征峰缺失)

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来讲，在上述说明的基础上还可以做成其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种酸橙枳实配方颗粒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)参照物溶液的制备：

对照药材参照物溶液的制备：取对照药材加水煎煮，过滤后得到滤液，回收溶剂后得到残渣，然后加入甲醇，经超声，过滤后得到所述对照药材参照物溶液；

对照品参照物溶液的制备：取橙皮苷对照品、川陈皮素对照品，精密称定，加入甲醇制成对照品参照物溶液；

(2)供试品溶液的制备：取枳实配方颗粒，研磨后取样，精密称定，加入甲醇，经超声、过滤后得到所述对供试品溶液；

(3)模拟颗配方粒溶液的制备：取酸橙枳实药材加水煎煮，过滤后得到滤液，回收溶剂后得到残渣，然后加入甲醇，经超声，过滤后得到所述对照药材参照物溶液；

(4)色谱条件为：超高效液相色谱测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱；二极管阵列检测器，检测波长0～26min为283nm，26～37min为325nm，在240～340nm范围全波长扫描；柱温为30℃；流速为0.25ml/min；

(5)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液1μL，注入液相色谱仪，测定；

(6)特征图谱的建立：按照步骤(4)色谱条件进样，对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和自制模拟配方颗粒溶液进行分析，获得对应色谱图，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成拟合图，从而确定标准特征图谱；

(7)判定方法：依次采用第一检测方法和第二检测方法对供试品溶液进行检测；

所述第一检测方法为，所述供试品溶液的液相色谱与所述对照药材参照物溶液和对照品参照物溶液的液相色谱进行检测，其中9个峰使用相对保留时间结合特征峰最大吸收波长进行定位；

所述第二检测方法为，以供试品溶液色谱中芸香柚皮苷与柚皮苷的峰面积比值α₁、新橙皮苷与橙皮苷的峰面积比值α₂进行检测。

2.根据权利要求1所述的检测酸橙枳实配方配方颗粒的方法，其特征在于，所述酸橙枳实配方颗粒的色谱图呈现11个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的11个特征峰保留时间相对应，其中2个峰应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应；与橙皮苷参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7与S1峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内，规定值为：峰1：0.77、峰2：0.89、峰3：0.95、峰5：1.07、峰6：1.47、峰7：1.57；以川陈皮素参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰8、峰9、峰11与S2峰的相对保留时间，在规定值的±10％范围内，规定值为：峰8：0.89、峰9：0.93、峰11：1.08；扫描各特征峰在240～340nm范围内的吸收光谱，峰1～峰6在283±2nm处有峰值吸收，峰7在289±2nm处有峰值吸收，峰8在324±2nm处有峰值吸收，峰9在322±2nm处有峰值吸收，峰10在334±2nm处有峰值吸收，峰11在325±2nm处有峰值吸收。

3.根据权利要求1或2所述的检测酸橙枳实颗粒的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为0～20min，12→28％流动相A，88→72％流动相B；20～28min，28→47％流动相A，72→53％流动相B；28～37min，47％流动相A，53％流动相B。

4.根据权利要求1或2所述的检测酸橙枳实配方颗粒的方法，其特征在于，采用转换波长法，所述检测波长为：峰1～峰7检测波长为0～26min为283nm；峰8～峰11检测波长为26～37min为325nm。

5.根据权利要求1所述的检测酸橙枳实配方颗粒的方法，其特征在于，对照品溶液具体为：每1ml含橙皮苷200μg、川陈皮素20μg的混合溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二检测方法包括，采用公式Ⅰ进行检测，当α₁大于5.0、且α₂大于3.0时，所述供试品配方颗粒为酸橙枳实配方颗粒；

其中，A₂为配方颗粒供试品中芸香柚皮苷的峰面积，A₃为配方颗粒供试品中柚皮苷的峰面积，A₄为配方颗粒供试品中橙皮苷的峰面积，A₅为配方颗粒供试品中新橙皮苷的峰面积。

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