CN110221011A - 系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，样品预处理后，采用超高效液相色谱UHPLC进行分离，色谱条件为：柱温25℃；流速0.3mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱。采用随机顺序进行样本的连续分析，样本队列中插入质控QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性；样品经超高效液相色谱UHPLC分离后用质谱仪Q‑TOF进行质谱分析。实验证明，本发明分析速度快、灵敏度高、分辨率高，适用于系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物检测分析。

Description

系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法

技术领域

本发明涉及代谢组学领域，具体涉及一种系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法。

背景技术

系统性硬化症(Systemic sclerosis,SSc)，也被称为硬皮病(scleroderma)，是一种以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为主要特征，可引起多系统损害的结缔组织病。在亚洲，SSc的发病率为7.2/1000000-10.9/1000000人，患病率为38/1000000-56.3/1000000人，女性发病明显多于男性。根据皮肤受累程度，临床上常将SSc分为局限型SSc(lcSSc)，皮肤增厚局限于手肘或膝盖的远端，内脏器官受累较少；弥散型SSc(dcSSc)，皮肤受累范围广泛，在早期即可有严重的内脏受累等并发症。

纤维化作为系统性硬化症患者主要的死亡原因，每年可造成巨大的社会经济影响。根据相关文献报道，SSc患者的死亡率明显高于一般人群，其五年生存率为74.9％，10年生存率为62.5％。该病发生后，既会对患者的皮肤、关节肌肉造成侵犯，包括皮肤硬化、指端溃疡、甲褶微循环异常、食管功能障碍等，更为重要的是，还会对患者的内脏器官造成损伤，如侵犯患者的肺、肾、心脏等，造成肺动脉高压、肺纤维化、肾危象、心功能不全等，严重影响患者生存质量和威胁患者生命。

SSc的主要特点为固有免疫和适应性免疫功能异常以及微血管损伤，最后导致细胞外基质和胶原的过度产生和堆积。肌成纤维细胞作为纤维化形成的主要参与细胞，也是胶原的主要生产者，其在机体创伤修复过程中起着连接受损组织的作用。随着修复的进行，肌成纤维细胞和胶原含量也逐步下降，但在纤维化疾病，如SSc中，肌成纤维细胞可持续分泌胶原，导致皮肤、肺脏等组织纤维化的形成。间质固有成纤维细胞、间充质细胞、内皮细胞、上皮细胞、周细胞等均可转为肌成纤维细胞，此过程主要依赖转化生长因子β(TGFβ)参与。

SSc的发病机制尚不清楚，目前认为在遗传和环境的作用下，自身免疫和炎症反应、血管病变、纤维化三者相互影响而形成恶性循环，最终导致各器官进行性纤维化。全基因组关联研究已筛选出大量SSc易感基因，如人类白细胞抗原(HLA)-DPB1、HLA-DPB2、HLA-DQB1、干扰素调节因子5、信号转导与转录激活因子4等。血管内皮细胞、CD4+T淋巴细胞和成纤维细胞的功能异常均参与了SSc的发生发展，但这些指标因受到临床检测技术或费用的局限，仍很难作为常规诊断SSc的生物学标记物。

作为一种典型的自身免疫病，自身抗体在SSc的诊断和预后评价中发挥重要作用。2013年美国风湿病学会/欧洲风湿病联盟(ACR/EULAR)发布了最新的SSc分类诊断标准，强调了自身抗体在SSc诊断过程中的重要性。约95％的SSc患者存在抗核抗体，其中，抗拓扑异构酶I抗体(Scl-70)和抗着丝点抗体(ACA)是SSc中发现的经典的抗核抗体，广泛应用于疾病诊断。尽管如此，目前使用的SSc血清自身抗体标志物并不十分理想，抗Scl-70抗体临床检测阳性率仅为30-40％，鉴于疾病本身的异质性及多变性，目前学者们仍在致力于寻找SSc早期诊断的血清学标记物。

随着“后基因组学”时代的开启，基因组学功能的研究成为关注的焦点，这也衍生出了一门新的科学—系统生物学。系统生物学有别于既往的发现生物反应中单个基因或蛋白的分子生物学研究，他集合了基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，全面地研究生物系统在生理与病理状态下的变化。其中，代谢组学是一种通过高通量检测技术、定性或定量的分析组织或生物体液中全部代谢产物的方法。目前已广泛应用于生物标志物的发现、疾病早期诊断和预后判断、药物或营养干预的作用机制探讨等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，对代谢产物进行检测和原始数据分析。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，样品预处理后，采用超高效液相色谱UHPLC进行分离，色谱条件为：柱温25℃；流速0.3mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-1min，95％B；1-14min，B从95％线性变化至65％；14-16min，B从65％线性变化至40％；16-18min，B维持在40％；18-18.1min，B从40％线性变化至95％；18.1-23min，B维持在95％；自动进样器4℃；为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析，样本队列中插入质控QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性；样品经超高效液相色谱UHPLC分离后用质谱仪Q-TOF进行质谱分析，Q-TOF质谱条件为：分别采用电喷雾电离ESI正离子和负离子模式进行检测。

样品预处理步骤为：-80℃取样本，在4℃环境下缓慢解冻后，分别取各组样本100ul后加入400ul预冷甲醇/乙腈溶液涡旋混合，其中甲醇：乙腈＝1:1(v/v)，-20℃静置60min，14000g4℃离心20min，取上清真空干燥。

所述的色谱柱为Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统HILIC色谱柱；质谱仪为Triple TOF 5600质谱仪。

质谱分析时，样品加入100μL乙腈水溶液复溶，其中乙腈：水＝1:1(v/v)，涡旋，14000g 4℃离心15min，取上清液进样分析。

每个待测样本等量混合用于制备质控QC样本，用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性，剩余待测样进行色谱-质谱检测。

原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库，对XCMS提取得到的数据，删除组别总和>2/3的离子峰。

应用软件SIMCA-P 14.1，Umetrics，Umea，Sweden，进行模式识别，数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析。

所述多维统计分析包括无监督主成分分析PCA，有监督偏最小二乘法判别分析PLS-DA和正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA，单维统计分析包括Student’s t-test和变异倍数分析，R软件绘制火山图；以VIP>1为筛选标准，初步筛选出各组间的差异物。

采用单变量统计分析，验证差异代谢物是否具有显著性，选择同时具有多维统计分析VIP>1和单变量统计分析P value<0.05的代谢物，作为具有显著性差异的代谢物；而VIP>1且0.05<P value<0.1则作为差异代谢物。

实验证明，本发明分析速度快、灵敏度高、分辨率高，适用于系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物检测分析。

附图说明

图1：QC样品正离子模式TIC重叠图谱。

图2：负离子模式PCA得分图。

图3：负离子模式PLS-DA得分图。

图4：KEGG通路富集分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明共纳入30例确诊为系统性硬化症患者。所有患者均符合2013年ACR/EULAR标准；排除合并其他慢性自身免疫性疾病、心血管疾病患者。选取30例健康人作为对照组，其中女30例，年龄(31.23±4.51)岁；病例组选取30例系统性硬化症患者，其中男6例，女24例，年龄(46.38±11.62)岁。

临床资料收集：记录所有研究对象的性别、年龄、体重等人口学信息资料；记录患者临床表现、查体、生命体征、辅助检查及治疗方案。所有研究对象均签署知情同意书，于清晨空腹采集静脉血3ml，分离血清于-80℃保存。

样品预处理：-80℃取样本在4℃环境下缓慢解冻后，分别取各组样本100u l后加入400ul预冷甲醇/乙腈溶液(1:1，v/v)，涡旋混合，-20℃静置60min，14000g 4℃离心20min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，14000g4℃离心15min，取上清液进样分析。每个待测样本等量混合用于制备质控(quality control,QC)样本，用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。剩余待测样进行色谱-质谱检测。

色谱-质谱分析

色谱条件：样品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.3mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-1min，95％B；1-14min，B从95％线性变化至65％；14-16min，B从65％线性变化至40％；16-18min，B维持在40％；18-18.1min，B从40％线性变化至95％；18.1-23min，B维持在95％；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

Q-TOF质谱条件：分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后用Triple TOF 5600质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析。

HILIC色谱分离后的ESI源条件如下：Ion Source Gas1(Gas1)：60，Ion SourceGas2(Gas2)：60，Curtain gas(CUR)：30，source temperature：600℃，IonSapary VoltageFloating(ISVF)±5500V(正负两种模式)；TOF MS scan m/z range：60-1000Da，production scan m/z range：25-1000Da，TOF MS scan accumulation time 0.20s/spectra,product ion scan accumulation time 0.05s/spectra；二级质谱采用informationdependent acquisition(IDA)获得，并且采用high sensitivity模式，Declusteringpotential(DP)：±60V(正负两种模式)，Collision Energy：35±15eV，IDA设置如下Exclude isotopes within 4Da，Candidate ions to monitor per cycle：6。

原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(<25ppm)和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库。对XCMS提取得到的数据，删除组别总和>2/3的离子峰。应用软件SIMCA-P 14.1(Umetrics，Umea，Sweden)进行模式识别，数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析，包括无监督主成分分析(PCA)分析，有监督偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。单维统计分析包括Student’s t-test和变异倍数分析，R软件绘制火山图。

本实验以VIP>1为筛选标准，初步筛选出各组间的差异物。进一步采用单变量统计分析，验证差异代谢物是否具有显著性。选择同时具有多维统计分析VIP>1和单变量统计分析P value<0.05的代谢物，作为具有显著性差异的代谢物；而VIP>1且0.05<P value<0.1则作为差异代谢物。结果表明，SSc患者血清中有25种代谢物质有显著性差异(p<0.05，VIP>1)，其中包括14种代谢物质下调(fold change<1)，11种代谢物质上调(fold change>1)。差异代谢物聚类分析发现，与健康对照者相比，SSc患者血清显著上调的代谢物质有邻苯二甲酸二辛酯、左旋肉碱、棕榈酰乙醇酰胺、维生素E及烟酰胺，而显著下调的代谢产物有棕榈酰甘油、硬脂酰甘油、乙氧基乙醇、三乙醇胺和反式脱氢表雄酮。

通过Fisher精确检验方法对SSc组的差异表达代谢物进行KEGG通路富集分析，结果表明有以下几种重要通路：脂肪酸生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、亚油酸代谢、肿瘤胆碱代谢、蛋白质消化吸收和甘油磷脂代谢等。

将QC样本UHPLC-Q-TOF MS总离子流图，进行谱图重叠比较(图1)，结果表明各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小。

总体样本主成分分析(PCA)：

正离子模式下共有22个主成分，负离子模式有16个主成分，对X变量数据集模型的可解释度(R2X)值分别为0.376、0.521，负离子模式下＞0.5，提示模型具有很好的解释度；模型可预测度(Q2)值分别为0.0894、0.0257，均偏低，提示可预测度稍偏低。

以SSc组和对照组进行PCA分析，负离子模式下可以发现两组样本有很好的区分聚类趋势，获得了较好的分类模型(图2，横坐标为样本第一主成分得分，纵坐标为第二主成分得分)。

偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)：

建立PLS-DA模型，正、负离子模式下主成分数分别为3个和2个，R2Y值分别为0.941、0.921，Q2值分别为0.834、0.859，同样可以发现两组差异明显，有很好的区分聚类趋势，有较高的可预测性，获得了较好的分类模型(图3，横坐标为样本第一主成分得分，纵坐标为第二主成分得分)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：样品预处理后，采用超高效液相色谱UHPLC进行分离，色谱条件为：柱温25℃；流速0.3mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-1min，95％B；1-14min，B从95％线性变化至65％；14-16min，B从65％线性变化至40％；16-18min，B维持在40％；18-18.1min，B从40％线性变化至95％；18.1-23min，B维持在95％；自动进样器4℃；为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析，样本队列中插入质控QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性；样品经超高效液相色谱UHPLC分离后用质谱仪Q-TOF进行质谱分析，Q-TOF质谱条件为：分别采用电喷雾电离ESI正离子和负离子模式进行检测。

2.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：样品预处理步骤为：-80℃取样本，在4℃环境下缓慢解冻后，分别取各组样本100ul后加入400ul预冷甲醇/乙腈溶液涡旋混合，其中甲醇：乙腈＝1:1(v/v)，-20℃静置60min，14000g4℃离心20min，取上清真空干燥。

3.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：所述的色谱柱为Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统HILIC色谱柱；质谱仪为Triple TOF 5600质谱仪。

4.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：质谱分析时，样品加入100μL乙腈水溶液复溶，其中乙腈：水＝1:1(v/v)，涡旋，14000g4℃离心15min，取上清液进样分析。

5.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：每个待测样本等量混合用于制备质控QC样本，用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性，剩余待测样进行色谱-质谱检测。

6.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库，对XCMS提取得到的数据，删除组别总和>2/3的离子峰。

7.根据权利要求6所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：应用软件SIMCA-P14.1，Umetrics，Umea，Sweden，进行模式识别，数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析。

8.根据权利要求7所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：所述多维统计分析包括无监督主成分分析PCA，有监督偏最小二乘法判别分析PLS-DA和正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA，单维统计分析包括Student’s t-test和变异倍数分析，R软件绘制火山图；以VIP>1为筛选标准，初步筛选出各组间的差异物。

9.根据权利要求8所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：采用单变量统计分析，验证差异代谢物是否具有显著性，选择同时具有多维统计分析VIP>1和单变量统计分析P value<0.05的代谢物，作为具有显著性差异的代谢物；而VIP>1且0.05<P value<0.1则作为差异代谢物。