CN110082443A - 基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法 - Google Patents

基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其包括如下步骤：S1、对受试小鼠进行PM2.5颗粒的气管滴注，实验周期结束后，收集受试小鼠的肺组织；S2、提取所述对肺组织的代谢物，并利用所述代谢物获得LC‑MS的数据；S3、运用Commonpound Discover软件对所述LC‑MS数据进行离子提取鉴定，再用统计学的方法，对提取结果进行数据处理与模式识别，寻找出PM2.5样品暴露小鼠肺组织代谢组学的生物标志物；S4、运用代谢组学相关数据库和分析软件，构建生物标志物的代谢通路并进行分析。本发明为PM2.5暴露所产生的效应标志物的筛选、评价和应用提供代谢组学方法思路。

Description

基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠 模型构建方法
技术领域
本发明涉及一种基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，属于代谢组学分析技术领域。
背景技术
大气污染所引发的健康风险越来越受人们关注，不同粒径的颗粒物会引发不同的健康风险。空气动力学直径≤2.5μm的细颗粒物被称为PM2.5，近年来备受人们关注。由于PM2.5粒径小，比表面积大，更容易进入肺泡并停留在肺部深处不易被排除，因此对人们健康影响更大。肺是PM2.5暴露的主要靶器官之一，会造成严重的肺损伤，增加哮喘和呼吸道炎症的发病率，流行病学资料表明PM2.5暴露与肺癌的发生有较强的相关性。如加拿大和美国科学家经过长期的研究发现，长期的PM2.5暴露会增加肺癌的发病率，浓度每增10μg/m3，肺癌死亡率增加8％。因此，肺疾病的早期筛查显得尤为重要，探索和建立一种快速、敏感性高的诊断技术迫切需要。
代谢组学是继基因组学、蛋白组学之后发展起来的一种全新组学技术，是系统生物学的重要组成部分，利用高分离率、高灵敏度、低检测限的LC-MS等先进仪器，通过比较不同生理状态下生物体内内源性小分子的代谢图谱信息变化，通过信息提取，数学降维(PCA、OPLS-DA等)等方法，识别颗粒物暴露后引发肺部代谢紊乱的关键生物标志物，为肺疾病的早期诊断提供帮助。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供了基于网络分析的血清代谢组学分析方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其包括如下步骤：
S1、对受试小鼠进行PM2.5颗粒的气管滴注，实验周期结束后，收集受试小鼠的肺组织；
S2、提取所述对肺组织的代谢物，并利用所述代谢物获得LC-MS的数据；
S3、运用Commonpound Discover软件对所述LC-MS数据进行离子提取鉴定，再用统计学的方法，对提取结果进行数据处理与模式识别，寻找出PM2.5样品暴露小鼠肺组织代谢组学的生物标志物；
S4、运用代谢组学相关数据库和分析软件，构建生物标志物的代谢通路并进行分析。
作为优选方案，步骤S1中，受试小鼠的暴露剂量为：小鼠气管滴注体积均为60μL，空白组为滴注等体积的生理盐水，低剂量暴露组PM2.5浓度为25μg/只/次，高剂量暴露组PM2.5浓度为150μg/只/次。
作为优选方案，步骤S1中，PM2.5配制均按照每只小鼠PM2.5暴露量混合在60μL的生理盐水中，每次滴注之前均震荡混匀。
作为优选方案，步骤S1中，小鼠气管滴注采用医用Y型留置针，型号：26G。
作为优选方案，步骤S2中，质量控制样本平行地穿插在整个分析过程中，用于评价整个分析过程的重复性。
作为优选方案，步骤S3中，确定的PM2.5颗粒物样品暴露的小鼠肺样品代谢组其中11个生物标志物用于评价环境参比PM2.5样品暴露的肺代谢异常，所述的11个生物标志物为白三烯A4、白三烯B4、脱氢皮质酮、前列腺素B2、前列腺素E1、孕甾三醇、脱氢异雄酮、：氧化谷胱甘肽，11β-羟孕酮、9-顺式-视黄醛、肾上腺酮。
前述方法中，将实验动物分成空白组(C,生理盐水)、低剂量组(L,25μg/只/次)、高剂量组(H,150μg/只/次)，进行PM2.5颗粒物的气管滴注暴露实验，最后采用断头法处死小鼠进行肺组织收集；
对肺组织进行代谢物提取并获得LC-MS的数据；
运用Commonpound Discover(CD)软件对LC-MS数据进行离子提取鉴定，再用统计学的方法，对提取结果进行数据处理与模式识别，寻找出PM2.5样品暴露小鼠肺组织代谢组学的生物标志物；
运用代谢组学相关数据库和分析软件，构建生物标志物的代谢通路并进行分析。
动物处理及样品收集的具体方法为：将75只C57BL/6小鼠适应性饲养一周后，随机分为3组，即空白对照组、低剂量暴露组、高剂量暴露组，每组25只小鼠；其中空白组为滴注等体积的生理盐水，低剂量暴露组为25μg/只/次，高剂量暴露组为150μg/只/次，用三氯甲醛对C57BL/6小鼠进行麻醉、气管滴注；各组小鼠在整个暴露期只进行一次气管滴注，暴露48h后处死小鼠，进行样品收集。
小鼠肺样品的制备，小鼠肺代谢物提取和LC-MS数据获取的具体方法为：在急性暴露实验结束后，采用三氯甲醛麻醉后，断头法处死小鼠，收集小鼠肺组织，于-80℃低温保存。进行肺代谢物提取时，采用程序解冻法，先将组织放置在-20℃，4～6h，再转移到4℃解冻，待肺组织完全解冻后置于室温下平衡一段时间后，利用精密天平称取50mg左右于遂真破碎管中，加入1mL Merck级别的甲醇，采用高通量组织研磨机(FastPrep-24，USA)，5.5MHz，30s对组织进行破碎，离心15分钟(15800g，15min，4℃)，取上清液置于真空离心浓缩仪中旋蒸至干燥。将干燥后的提取物复溶于200μL甲醇/水(1:1，v：v)，于装有内衬管中的玻璃瓶中用于代谢物检测分析进样。质量控制样本(QC)平行地穿插在整个分析过程中，用于评价整个分析过程的重复性。QC样本来自复溶后全部样品的混合。按照上述方法制备好的样本进行LC-MS分析。LC-MS条件：使用HSS T3色谱柱(1.8μm，2.1mm i.d.×100mm)进行色谱分离，进样体积为10μL；柱温50℃。流动相流速为0.4mL/min。流动相为(A)0.1％甲酸的超纯水和(B)含0.1％甲酸的甲醇。流动相洗脱梯度为：初始流动相为100％(A)，保持1分钟，21分钟时降至5％A，迅速降至0％A，并保持2分钟，25分钟升至100％A。Q-Exactive质谱仪使用电喷雾离子源(ESI)，质谱扫描范围为100-1000m/z，分别在正、负离子模式下采集数据，Full MS分辨率17500，数据采集模式为centroid mode。使用氮气作为载气，正离子和负离子模式下喷针电压分为3500V和3500V。鞘气流量45L/min，辅气体积流量15L/min；辅气温度350℃。
色谱梯度条件
LC-MS数据处理和生物标志物筛选的具体方法为：采用Commonpound Discover(CD)软件对LC-MS获得的原始质谱数据信息进行代谢物提取和鉴定，将上述得到的数据导入SIMCAP-14.0软件进行主成分分析。采用无监督模式识别的主成分分析(PCA)、有监督模式识别的正交偏最小二乘法(OPLS-DA)判别分析，通过得分图(Scores Plot)比较低剂量暴露组与空白组、高剂量暴露组与空白组，低剂量暴露与高剂量暴露组组间的差异，以R2X、R2Y、Q2等参数值来评估模型质量，其中R2X、R2Y越接近于1表示模型越稳定，Q2>0.5表示预测率高；根据OPLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)，将满足P-FDR<0.05、VIP(VIP>1.0)、Fold-change(FC>2或<0.5)作为候选生物标志物，用HMDB(The Human MetabolomeDatabase)数据库对代谢产物进行鉴定，剔除外源性代谢物，保留内源性代谢物。
代谢通路的可视化具体方法：将前面已经确定的肺组织生物标志物代谢谱输入MetaboAnalyst 4.0在线网站(https://www.metaboanalyst.ca/)进行处理，点击PathwayAnalysis标签，在Input(输入标签)中输入代谢物的HMDB号，选择Input Type为HMDB ID，点击Submit，选择Mus musculus(mouse)，再点击Submit即可。再通过STITCH软件(http://stitch.embl.de/cgi/input.pl)对差异代谢物进行生物相关性分析。
因此，本发明具有如下有益效果：
试验采用LC-MS谱对采集的小鼠肺组织样品检测分析，利用PCA、OPLS-DA诊断模型的方法，通过对不同浓度PM2.5暴露产生的生物效应标志物在不同浓度下的变化来模拟试验小鼠置于环境暴露中的生物应答反应。为PM2.5暴露所产生的效应标志物的筛选、评价和应用提供代谢组学方法思路。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的技术流程图。
图2为肺组织所有样品(QC)的LC-MS代谢指纹图谱示意图。
图3为低剂量组、高剂量组及对照组小鼠的主成分分析(PCA)得分图，其中A：所有样本(包括质控QC)；B：所有样本(不含QC)；C：对照组-低剂量暴露组(C VS.L)；D：对照组-高剂量暴露组(C VS.H)；E：对低剂量-高剂量暴露组(L VS.H)。
图4为低剂量组、高剂量组及对照组小鼠的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)得分图，其中A：对照组-低剂量暴露组(C VS.L)；B：对照组-高剂量暴露组(C VS.H)；C：对低剂量-高剂量暴露组(L VS.H)。
图5为低剂量组、高剂量组及对照组小鼠OPLS-DA模型置换检验结果，其中A：对照组-低剂量暴露组(C VS.L)；B：对照组-高剂量暴露组(C VS.H)；C：对低剂量-高剂量暴露组(L VS.H)。
图6为肺对照组和低剂量暴露组的通路分析图。
图7为肺对照组和高剂量暴露组的通路分析图。
图8为肺低剂量和高剂量暴露组的通路分析图。
图9为肺差异代谢物之间的生物相关性图。
图10为肺对照组、低剂量暴露组、高剂量暴露组差异代谢物多指标联合的ROC曲线图，其中A：对照组-低剂量暴露组(C VS.L)；B：对照组-高剂量暴露组(C VS.H)；C：对低剂量-高剂量暴露组(L VS.H)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
图1示出了本发明提供的关于一种基于代谢组分析的用于筛选PM2.5暴露早期效应标志物的小鼠模型的构建方法的实验方法流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关部分。
实施例1
将实验动物分成空白对照组、低剂量暴露组、高剂量暴露组，进行气管滴注，断头处死后收集肺组织样本。
动物处理及样品收集的具体方法为：将75只C57BL/6小鼠适应性饲养一周。随机分为3组，即空白对照组、低剂量暴露组、高剂量暴露组，每组25只。空白对照组滴注生理盐水60μL/只/次，低剂量暴露组为25μg/只/次，高剂量暴露组为150μg/只/次。PM2.5混合液均按照每只老鼠的暴露量和生理盐水剂量进行配置，配制完成后紫外灭菌2h，每次进行气管滴注之前均需要振荡混合均匀。不同处理方式均只对小鼠进行一次气管滴注，在暴露完成48h后，采用断头法处死小鼠，并收集相关样品。
实施例2
制备小鼠肺组织样本，肺组织提取并获得LC-MS谱数据
小鼠肺样品的制备，小鼠肺代谢物提取和LC-MS数据获取的具体方法为：在急性暴露实验结束后，采用三氯甲醛麻醉后，断头法处死小鼠，收集小鼠肺组织，于-80℃低温保存。进行肺代谢物提取时，采用程序解冻法，先将组织放置在-20℃，4～6h，再转移到4℃解冻，待肺组织完全解冻后置于室温下平衡一段时间后，利用精密天平称取50mg左右于遂真破碎管中，加入1mL Merck级别的甲醇，采用高通量组织研磨机(FastPrep-24，USA)，5.5MHz，30s对组织进行破碎，离心15分钟(15800g，15min，4℃)，取上清液置于真空离心浓缩仪中旋蒸至干燥。将干燥后的提取物复溶于200μL甲醇/水(1:1，v：v)，于装有内衬管中的玻璃瓶中用于代谢物检测分析进样。质量控制样本(QC)平行地穿插在整个分析过程中，用于评价整个分析过程的重复性。QC样本来自复溶后全部样品的混合。按照上述方法制备好的样本进行LC-MS分析。LC-MS条件：使用HSS T3色谱柱(1.8μm，2.1mm i.d.×100mm)进行色谱分离，进样体积为10μL；柱温50℃。流动相流速为0.4mL/min。流动相为(A)0.1％甲酸的超纯水和(B)含0.1％甲酸的甲醇。流动相洗脱梯度为：初始流动相为100％(A)，保持1分钟，21分钟时降至5％A，迅速降至0％A，并保持2分钟，25分钟升至100％A。Q-Exactive质谱仪使用电喷雾离子源(ESI)，质谱扫描范围为100-1000m/z，分别在正、负离子模式下采集数据，Full MS分辨率17500，数据采集模式为centroid mode。使用氮气作为载气，正离子和负离子模式下喷针电压分为3500V和3500V。鞘气流量45L/min，辅气体积流量15L/min；辅气温度350℃。
实施例3
采用统计学的方法，对LC-MS数据进行处理及模式识别，寻找PM2.5颗粒物暴露对C57BL/6小鼠暴露的效应标志物
本研究采用了数据依赖型的扫描模式，在全扫描获得一级谱图的同时获得二级谱图信息，因此可以快速获得更为详细的脂质结构信息。然后根据保留时间、精确质量数、二级断裂规律，以及采用Commonpound Discover(CD)软件对LC-MS获得的原始质谱数据信息进行代谢物提取和鉴定，将上述得到的数据导入SIMCAP-14.0软件进行主成分分析。采用无监督模式识别的主成分分析(PCA)、有监督模式识别的正交偏最小二乘法(OPLS-DA)判别分析，通过得分图(Scores Plot)比较低剂量暴露组与空白组、高剂量暴露组与空白组，低剂量暴露与高剂量暴露组组间的差异，以R2X、R2Y、Q2等参数值来评估模型质量，其中R2X、R2Y越接近于1表示模型越稳定，Q2>0.5表示预测率高；根据OPLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)，将满足P-FDR<0.05、VIP(VIP>1.0)、Fold-change(FC>2或<0.5)作为候选生物标志物，用HMDB(The Human Metabolome Database)数据库对代谢产物进行鉴定，剔除外源性代谢物，保留内源性代谢物。经过处理空白组和低剂量组(C VS.L)，空白组和高剂量组(CVS.H)，低剂量和高剂量暴露组(L VS.H)相应差异代谢物见下表(表1、2、3)：
表1 C VS.L差异代谢物
注：1.FC:Fold-change；
2.Pattern(+、-)：+表示正模式下被检出，-表示负模式下被检出。
表2 C VS.H差异代谢物
注：1.FC:Fold-change；
2.Pattern(+、-)：+表示正模式下被检出，-表示负模式下被检出
表3 L VS.H差异代谢物
注：1.FC:Fold-change；
2.Pattern(+、-)：+表示正模式下被检出，-表示负模式下被检出
空白组和低剂量暴露，空白组和高剂量暴露组，低剂量和高剂量暴露分别鉴定出13，19，25个差异代谢物。将上述三组57个差异代谢利用Stitch生物相关性网站进行代谢物之间的生物性关系分析(图9)，选择Mus musculus，最终共有11个代谢物之间具有较强的生物相关性，分别为：白三烯A4(Leukotriene A4)、Leukotriene B4(白三烯B4)、脱氢皮质酮(11-Dehydrocorticosterone)、前列腺素B2(Prostaglandin B2)、前列腺素E1(Prostaglandin E1)、孕甾三醇(Pregnanetriol)、脱氢异雄酮(Dehydroepiandrosterone)、：氧化谷胱甘肽(Oxidized glutathione)，11β-羟孕酮(11b-Hydroxyprogesterone)、9-顺式-视黄醛(9-cis-Retinal)、肾上腺酮(Corticosterone)。
利用Metaboanalyst在线网站对差异代谢物进行代谢通路富集分析(见图6、7、8)，空白组和低剂量暴露组差异代谢物主要涉及赖氨酸代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、牛磺酸与次牛磺酸代谢、亚麻酸代谢、视黄醇代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢代谢通路；空白组和高剂量暴露组差异代谢物主要涉及甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇生物合成、甾类激素生物合成、视黄醇代谢谷胱甘肽代谢等代谢通路；低剂量暴露和高剂量暴露组之间差异代谢物主要涉及花生四烯酸代谢、甾类激素生物合成、亚油酸代谢、牛磺酸与次牛磺酸代谢、糖基磷脂酰肌醇生物合成、视黄醇代谢、赖氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢代谢通路。我们发现PM2.5暴露均涉及到视黄醇代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和甘油磷脂代谢这4条代谢通路，具体情况见下表(表4、5、6)：
表4 C VS.L代谢通路
表5 C VS.H代谢通路
表6 L VS.H代谢通路
利用Metaboanalyst在线分析网站中ROC分析功能，通过ROC分析来评估代谢标志物对PM2.5暴露后的判别能力。利用AUC值表示标志物的判别能力强弱，AUC值越接近1，表示判别能力越强。通过对空白组和低剂量组，空白组和高剂量组，低剂量和高剂量组这三组分别进行ROC分析，结果显示在空白组和低剂量组模型中，2种标志物的组合能够提供最好的判别能力，AUC达到了0.922(图10A)；在空白组和高剂量暴露模型中，2种标志物的组合能够提供最好的判别能力，AUC达到了0.99(图10B)；在低剂量和高剂量暴露模型中，2种标志物的组合能够提供最好的判别能力，AUC达到了0.972(图10C)
本发明采用以上技术方案，通过液质联用(LC-MS)技术对颗粒物暴露后小鼠肺组织代谢紊乱差异代谢物进行分析，通过PCA、OPLS-DA等数学模型共发现11个差异代谢物，分别为：白三烯A4(Leukotriene A4)、Leukotriene B4(白三烯B4)、脱氢皮质酮(11-Dehydrocorticosterone)、前列腺素B2(Prostaglandin B2)、前列腺素E1(ProstaglandinE1)、孕甾三醇(Pregnanetriol)、脱氢异雄酮(Dehydroepiandrosterone)、：氧化谷胱甘肽(Oxidized glutathione)，11β-羟孕酮(11b-Hydroxyprogesterone)、9-顺式-视黄醛(9-cis-Retinal)、肾上腺酮(Corticosterone)。通过差异代谢物通路富集分析以及Stitch生物相关性分析，PM2.5暴露会造成肺组织视黄醇代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和甘油磷脂代谢这4条代谢通路。与以往的效应标志物筛选相比，该方法更全面、更灵敏、能够系统综合的体现颗粒物暴露后相应代谢通路生物信息学之间的关联，可以为颗粒物暴露引发肺代谢紊乱效应标志物的筛选提供一种更可靠的试验方法，具有高效、快速等优点。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对受试小鼠进行PM2.5颗粒的气管滴注，实验周期结束后，收集受试小鼠的肺组织；
S2、提取所述对肺组织的代谢物，并利用所述代谢物获得LC-MS的数据；
S3、运用Commonpound Discover软件对所述LC-MS数据进行离子提取鉴定，再用统计学的方法，对提取结果进行数据处理与模式识别，寻找出PM2.5样品暴露小鼠肺组织代谢组学的生物标志物；
S4、运用代谢组学相关数据库和分析软件，构建生物标志物的代谢通路并进行分析。
2.如权利要求1所述的基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤S1中，受试小鼠的暴露剂量为：小鼠气管滴注体积均为60μL，空白组为滴注等体积的生理盐水，低剂量暴露组PM2.5浓度为25μg/只/次，高剂量暴露组PM2.5浓度为150μg/只/次。
3.如权利要求1所述的基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤S1中，PM2.5配制均按照每只小鼠PM2.5暴露量混合在60μL的生理盐水中，每次滴注之前均震荡混匀。
4.如权利要求1所述的基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤S1中，小鼠气管滴注采用医用Y型留置针，型号：26G。
5.如权利要求1所述的基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤S2中，质量控制样本平行地穿插在整个分析过程中，用于评价整个分析过程的重复性。
6.如权利要求1所述的基于代谢组学表征颗粒物暴露肺代谢异常标志物筛选的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤S3中，确定的PM2.5颗粒物样品暴露的小鼠肺样品代谢组其中11个生物标志物用于评价环境参比PM2.5样品暴露的肺代谢异常，所述的11个生物标志物为白三烯A4、白三烯B4、脱氢皮质酮、前列腺素B2、前列腺素E1、孕甾三醇、脱氢异雄酮、：氧化谷胱甘肽，11β-羟孕酮、9-顺式-视黄醛、肾上腺酮。
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