CN115078610A - 一种检测体液中疏水性药物含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测体液中疏水性药物含量的方法，该方法涉及一种注射器内疏水亲油纤维支撑液相萃取装置，结合流动注射质谱法(FIA‑MS)用于体液中药物的快速检测。将附着有油性溶剂如正辛醇的疏水亲油纤维置入注射器针头和针管之间，以构建一种简单易用的萃取体液样品中疏水性药物的装置。通过注射器柱塞杆抽吸样品溶液进入注射器，疏水性药物可被快速萃取至疏水亲油纤维上，再抽吸解吸溶剂进行解吸，并采用FIA‑MS对解吸液进行分析检测。该方法可对复杂体液样品中疏水性药物进行快速分析，增强抗基质干扰能力，提高检测灵敏度。此外，本发明拓展了注射器内萃取技术，有望发展为自动化前处理装置，实现全自动化分析。
Description
技术领域
本发明属于药物检测领域，涉及一种检测体液中疏水性药物含量的方法。
背景技术
药物治疗是当前多种疾病的主要治疗手段，体液中药物浓度的检测对于确定安全有效的药物剂量具有重要意义。因此，建立一种疏水性药物的快速检测方法尤为重要。
复杂的生物基质对于抗抑郁药的检测是一个巨大的挑战，需要通过样品前处理以尽可能减少由内源性化合物(蛋白质、脂质等)引起的基质干扰。目前，现有的疏水性药物检测方法的样品前处理方法主要包括固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)与液液萃取法(Liquid liquid extraction,LLE)。固相萃取法重现性好且可自动化，一般较受青睐。但是在上样之前，萃取柱要经过活化、平衡及清洗等步骤，使得样品前处理变得复杂，费时耗力。液液萃取法利用目标物在两相溶液中溶解度不同以达到有效分离的目的，但是液液萃取所需的溶剂较多，且萃取过程中需要不断振荡及离心，操作复杂。此外，用于含有蛋白质的体液样品时，液液萃取容易发生乳化现象，导致重现性差。因此，开发一种简单易行的前处理方法用于体液中疏水性药物的检测具有重要意义。
支撑液相萃取法(Supported liquid extraction,SLE)通过采用特殊工艺处理过的硅藻土为吸附剂，快速吸附样品基质中的水分，在吸附剂表面形成液膜，从而使目标物与水相分离，实现对目标物的富集与净化。该方法使用相应的萃取装置，仅需上样和洗脱两步，即可从水相中萃取目标化合物。相较于LLE、SPE等样品前处理方法，SLE具有较高的样品萃取能力和效率，并具备基质干扰小和所需样品量少等优点，被广泛应用于人体生物样品的前处理。其缺点是需要吹干、复溶等步骤，严重影响前处理的速度和通量，不利于实现快速、高通量分析。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测体液中疏水性药物含量的方法，该方法具有快速准确、特异性好、灵敏度高的特点。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种检测体液中药物含量的方法，包括以下步骤：
(1)将内部疏水亲油纤维填料装入萃取装置内，将萃取剂添加至内部疏水亲油纤维填料上；
(2)将待检测体液加入至所述内部疏水亲油纤维填料上，使所述萃取剂与所述待检测体液混合；然后将解吸溶剂添加至所述萃取装置内，得到包含待分析药物的解吸液；
(3)将所述包含待分析疏水性药物的解吸液进行检测。
进一步地，所述内部疏水亲油纤维填料为天然纤维(木棉纤维、羽毛等)或合成纤维(聚丙烯纤维、聚氨酯纤维或烷基乙烯聚合物纤维等)等任意一种具有疏水亲油特性的纤维。
进一步地，所述萃取剂为任意一种与水不互溶的有机溶剂(正辛醇、正己烷等)、深共熔溶剂、离子液体等。
进一步地，所述解吸溶剂为乙腈、甲醇、无水乙醇、80％乙腈、80％甲醇或80％乙醇。
进一步地，所述解吸溶剂中还包括甲酸，所述甲酸的体积含量为0-1.0％。
进一步地，所述步骤(2)中萃取次数、所述解吸次数为一次或多次。
进一步地，所述药物选自抗抑郁药(丙咪嗪、舍曲林、氟西汀、阿米替林中的一种或多种)、糖皮质激素药物(波尼松，地塞米松，氢化可的松等一种或多种)，沙坦类药物(坎地沙坦、缬沙坦等一种或多种)。
进一步地，所述步骤(3)检测方法为流动注射-质谱。
进一步地，所述体液为血浆、尿液或脑脊液。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种检测体液中疏水性药物含量的方法，该方法涉及一种注射器内疏水亲油纤维支撑液相萃取装置，结合FIA-MS用于体液中疏水性药物的快速检测。将附着有油性溶剂如正辛醇的疏水亲油纤维置入注射器针头和针管之间，以构建一种简单易用的萃取疏水性物质的装置。通过注射器柱塞杆抽吸样品溶液进入注射器，疏水性药物可被快速萃取至疏水亲油纤维上，再添加解吸溶剂进行解吸，并采用FIA-MS对解吸液进行分析检测。该方法可对复杂体液样品中疏水性药物进行快速分析，增强抗基质干扰能力，提高检测灵敏度。此外，本发明拓展了注射器内萃取技术，有望发展为自动化前处理装置，实现全自动化分析。
附图说明
图1为本发明实施例的检测过程示意图；
图2为本发明实施例2-6的检测结果图；
图3为本发明实施例7的检测结果图；
图4为本发明实施例8血浆中采用注射液内纤维支撑液相萃取-流动注射-质谱对检测结果的影响对比图；
图5为本发明实施例8尿液中采用注射液内支撑液相萃取法-流动注射-质谱对检测结果的影响对比图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种检测体液中疏水性抗抑郁药物含量的方法，包括以下步骤：检测过程如图1所示。
(1)萃取、解吸：
(1.1)标准溶液的制备：配制丙咪嗪(Imipramine,IMP)、舍曲林(Sertraline,SER)、氟西汀(Fluoxetine,FLX)、阿米替林(Amitriptyline,AMT)、d3-舍曲林(d3-SER)及d6-氟西汀(d6-FLX)储备液：分别准确称取10.0mg标准品粉末于10mL烧杯中，使用乙腈-水溶液(1:1,v/v)溶解后，将其转移至10.0mL容量瓶中，并使用乙腈-水溶液(1:1,v/v)洗涤烧杯三次，将洗涤液同样转移至容量瓶中，向容量瓶中加入乙腈-水溶液(1:1,v/v)至刻度线，摇匀即得标准品储备液(1.0mg/mL)。将配制好的储备液转移到棕色螺口瓶中，储存于-20℃冰箱备用。
(1.2)健康志愿者的血浆和尿液样品采集自本校医院，所有的提供者均未服用过本研究所选用的四种抗抑郁药，且在采集之前已签署知情同意书。样品收集之后立即在4℃下以3000rpm的转速离心15min，收集上清液，储存于-20℃冰箱中备用。使用时，样品在室温下解冻后，加入一定量的抗抑郁药标准品，涡旋1min，再用磷酸氢二钾缓冲液(25mM,pH10.0)稀释至所需倍数。血浆稀释5倍，尿液稀释2倍。
(1.3)称取10.0mg的内部疏水亲油纤维填料--天然木棉纤维装入一次性塑料注射器针头和注射器之间(5.0mL)中，吸取10.0μL正辛醇至木棉纤维上。萃取：吸取1.0mL的预处理过的体液样品于上述装置中，推拉3次，以使正辛醇充分吸附抗抑郁药。解吸：吸取100μL的乙腈溶液(含0.1％甲酸)于注射器中，推拉3次，从而使抗抑郁药充分从木棉纤维上被解吸，收集解吸液于2.0mL离心管中，待后续FIA-MS检测。
(2)检测：MS系统采用Waters三重四级杆串联质谱仪(TQD)，并配备在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、自动进样器、电喷雾电离源等。本实验中在正离子扫描(ESI+)下的多反应监测模式进行样本信息的采集。锥孔电压为3.0kV，离子源温度均设置为150℃，脱溶剂温度为500℃，脱溶剂气体流速为1000L/h，锥孔气体流速为45L/h。每一个分析物均经过MassLynx 3.1软件手动及自动(IntelliStart)调谐锥孔电压、碰撞能量(表2.1)和自动优化滞留时间(Dwell time)。
表1抗抑郁药物质谱采集参数
注：*为定量离子。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：调整实施例1步骤(1.3)木棉纤维的用量分别为1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg，其余与实施例1相同。
检测结果如图2A所示，使用1.0到2.0mg的木棉纤维作为支撑材料进行液相微萃取时，四种抗抑郁药的回收率逐步上升，木棉纤维的用量从2.5到5.0mg时，回收率逐步下降至稳定。这可能由于木棉纤维较少时，所附着的正辛醇较少，因此随着木棉纤维的用量增多，回收率逐渐上升；而当木棉纤维用量较多时，注射器的阻力可能过大，从而使正辛醇损失过多，回收率反而会降低。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：调整实施例1步骤(1.3)中正辛醇的用量由0增大到10μL。其余与实施例1相同。
检测结果如图2B所示，正辛醇的用量由0增大到10μL时，各抗抑郁药的信号强度不断增强；而当进一步增加用量时(10-20μL)，回收率保持不变。这可能是由于正辛醇用量较少时，萃取的抗抑郁药的量相应较少；正辛醇用量过大时，木棉纤维已经被完全浸润达到饱和。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：调整实施例1步骤(1.3)中样品的pH分别为4、6、7、8、9、10、12。其余与实施例1相同。
由于碱性抗抑郁药在水溶液中易离解，本实验通过加入pH控制缓冲液抑制其离解，从而增强提取效率。本研究采用25mM的磷酸盐缓冲盐体系作为pH控制缓冲液，在pH4.0-12.0范围内考察上样液的pH对萃取效率的影响。结果如图2C所示，在pH 4.0-10.0时，回收率逐渐上升并达到平台期，在pH 10.0-12.0时逐渐下降。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：分别调整实施例1步骤(1.3)中解吸溶剂为乙腈、甲醇、无水乙醇、80％乙腈、80％甲醇、80％乙醇，其余与实施例1相同。
结果如图2D所示，解吸溶剂为乙腈、甲醇、无水乙醇、80％乙腈、80％甲醇、80％乙醇，四种抗抑郁药均具有较高的回收率。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于：分别调整实施例1步骤(1.3)中解吸溶剂中甲酸的含量分别为0％、0.1％、0.2％、0.5％、1.0％，其余与实施例1相同。
结果如图2E所示，甲酸含量在0％-1.0％时，四种抗抑郁药的回收率均处于较高水平，均在40％以上。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于：分别调整实施例1步骤(1.3)中萃取次数和解吸次数为1次、2次、3次、4次、5次、6次、8次、10次、15次。其余与实施例1相同。
结果如图3所示，萃取次数在2-15次时四种抗抑郁药的回收率为40％以上，解吸次数为1-10次时，四种抗抑郁药的回收率大于45％。
实施例8
一种检测体液中疏水性沙坦类药物含量的方法，本实施例与实施例1的区别在于：调整实施例1步骤(1.1)丙咪嗪(Imipramine,IMP)、舍曲林(Sertraline,SER)、氟西汀(Fluoxetine,FLX)、阿米替林(Amitriptyline,AMT)、d3-舍曲林(d3-SER)及d6-氟西汀(d6-FLX)储备液为坎地沙坦(candesartan)、缬沙坦储备液(valsartan)，调整步骤(1.3)木棉纤维为聚丙烯纤维，调整步骤(1.3)中的正辛醇为疏水深共溶剂(癸酸和溴化甲基三辛基铵以2:1比例混合制备)，调整步骤(2)中质谱检测参数为下表2，其余与实施例1相同。
表2沙坦类药物药物质谱采集参数
注：*为定量离子。
检测结果显示，空白血浆加标(100ng/mL)后检测，坎地沙坦(candesartan)、缬沙坦储备液(valsartan)的回收率分别为78％和82％；空白尿液加标(100ng/mL)后检测，坎地沙坦(candesartan)、缬沙坦储备液(valsartan)的回收率分别为85％和88％，均较为良好。
实施例9
注射液内支撑液相萃取-流动注射-质谱对检测结果的影响
为进一步探究注射液内支撑液相萃取-流动注射-质谱(In syringe-SLE-FIA-MS)对检测灵敏度的影响，在正离子MRM模式下，本研究对抗抑郁药进行FIA-MS分析与Insyringe-SLE-FIA-MS分析所得到的质谱信号强度进行比较。
如图4和图5所示，当对加标的血浆和尿液直接进行FIA-MS(黑色线)分析时，信号较弱；而采用木棉纤维进行SLE-FIA-MS(灰色线)分析时，信号强度大幅度提高。Insyringe-SLE-FIA-MS分析之后得到较高的信号强度可能存在以下两个原因：(1)生物样品中共存的大部分杂质在SLE步骤中被除去，有利于提高ESI源对分析物的离子化效率；(2)分析物可被有效地富集在木棉纤维上，使得分析物浓度增大。以上结果表明，在FIA-MS分析之前采用SLE进行快速预处理可以显著提高检测灵敏度。
实施例10
方法学验证
10.1基质效应
为研究血浆和尿液样品中共存的基质对分析物检测的影响，考察了抗抑郁药分别在血浆、尿液和标准溶液中的信号。在实际血浆样品中，质谱信号相比于标准溶液中有明显的降低，说明血浆和尿液中的共存干扰物可能会影响到电喷雾离子化效率。通过分别对比相同加标量(1μg/mL)的空白血浆和空白尿液样品与标准样品的质谱信号计算基质效应。
表3
结果如表3显示，丙咪嗪、氟西汀、舍曲林和阿米替林在血浆和尿液中的基质效应分别在15.6-27.2％，50.1-80.5％范围内，结果表明不同样品基质均干扰抗抑郁药的检测。采用内标归一化的方法计算基质效应，得出舍曲林在血浆和尿液中的基质效应为82.9-89.5％，95.7-100.9％，氟西汀在血浆和尿液中的基质效应为85.6-90.8％，101.0-103.4％，符合检测的要求。因此，需要同位素标记的内标校正基质效应产生的信号波动。
10.2标准曲线和定量限
在优化后的SLE条件下，将各分析物的浓度设为自变量，AMT和IMP以d6-FLX为内标，以分析物的峰面积与内标的峰面积比值设为因变量，建立标准曲线。
表4
结果如表4所示，各目标分析物在1.0-1000ng/mL的线性范围内，线性关系良好。
表5
| Detection | AMT | IMP | SER | FLX |
| Antidepressant detection in plasma | 8 | 4 | 25 | 80 |
| Antidepressant detection in plasma with SLE | 0.1 | 0.05 | 1 | 2 |
| Antidepressant detection in urine | 0.2 | 0.4 | 5 | 8 |
| Antidepressant detection in urine with SLE | 0.04 | 0.02 | 0.2 | 0.4 |
以信噪比的方法在血浆和尿液中测定抗抑郁药自身的定量限和经过SLE方法处理后的定量限，结果如表5所示，经过SLE方法处理后，抗抑郁药在血浆中的定量限提高25-80倍，在尿液中的定量限提升5-25倍，显著提高检测灵敏度。
10.3精密度和准确度
采用相对回收率评估该检测分析方法的准确度，并采用RSD进行评估该检测分析方法的日内精密度和日间精密度。
表6
结果如表6所示，低(2.0ng/mL)、中(20.0ng/mL)、高(500.0ng/mL)三个不同浓度抗抑郁药的相对回收率在84.7-103.5％、87.6-112.3％之间，日内精密度以及日间精密度的RSD分别在5.6-12.4％、1.0-12.0％之间，表明所建立的方法符合分析要求。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将内部疏水亲油纤维填料装入萃取装置内，将萃取剂添加至内部疏水亲油纤维填料上；
(2)将待检测体液通过抽吸加入至所述内部疏水亲油纤维填料上，使所述萃取剂与所述待检测体液混合；然后将解吸溶剂添加至所述萃取装置内，得到包含待分析药物的解吸液；
(3)将所述包含待分析药物的解吸液进行检测。
2.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述内部疏水亲油纤维填料为天然纤维或合成纤维；
所述天然纤维为木棉纤维或羽毛；
所述合成纤维为聚丙烯纤维、聚氨酯纤维或烷基乙烯聚合物纤维。
3.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述萃取剂为与水不互溶的有机溶剂、深共熔溶剂或离子液体。
4.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述有机溶剂为正辛醇或正己烷。
5.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述解吸溶剂为乙腈、甲醇、无水乙醇、丙酮、80％乙腈、80％甲醇、80％乙醇、80％丙酮。
6.如权利要求5所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述解吸溶剂中还包括甲酸，所述甲酸的体积含量为0-1.0％。
7.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中萃取次数、所述解吸次数为一次或多次。
8.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述疏水性药物抗抑郁药、糖皮质激素药物或沙坦类药物。
9.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)检测方法为流动注射-质谱法。
10.如权利要求1所述的检测体液中疏水性药物含量的方法，其特征在于，所述体液为血浆、尿液或脑脊液。
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