JPH0464584B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体クロマトグラフイー分析方法に
係り、特に一連の試料を繰り返し液体クロマトグ
ラフイーで分析する方法に関する。

〔従来の技術〕

従来の液体クロマトグラフイーを利用したアミ
ノ酸分析法では、例えば、特公昭59−2861に示さ
れているように、アミノ酸混合物試料を分離カラ
ムに導入し、複数種の溶離液（緩衝液）を順次分
離カラムに供給して前アミノ酸成分を溶出し、次
いで強アルカリ性の再生液を供給して分離カラム
を再生している。そして、このような分析行程
は、一連の試料に対して繰り返し行われる。蛋白
加水分解物アミノ酸試料の測定から、生体液アミ
ノ酸試料の測定のために分析装置を用いるときの
ように、他の分析操作条件から特定の分析操作条
件に変更する場合には、分析行程の繰り返しの前
に予備行程が行われる。

一連の多数の試料の全分析時間を短縮するため
に、前の分析行程における再生液供給後から次の
試料の分析行程開始までの時間を短縮すると、分
析操作条件変更後の第１番目の試料の分離成分の
リテンシヨンタイムと、第２番目以降の試料の分
離成分のリテンシヨンタイムとが異なるという現
象が生じた。すなわち、第３図に示すように、ア
ミノ酸の各成分のリテンシヨンタイムは、第２回
目以降の分析行程では同じであるが、第１回目の
分析行程のときは遅いのである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

発明者らは、一連の試料の全分析時間を短縮す
るために障害となる上述の如き現象が生ずる原因
を究明した。これについて第２図を参照して説明
する。

第２図の例は、蛋白加水分解物アミノ酸試料に
ついて、４段溶離法で溶離液（緩衝液）を切換え
て液体クロマトグラフイー分析した例である。図
中、Ｂ１は第１段、Ｂ２は第２段、Ｂ３は第３
段、Ｂ４は第４段の各緩衝液を示し、Ｂ５はPH10
以上の強アルカリ性を示す再生液である。また、
図のａは各液のPHを示し、ｂは各液のカウンター
イオン濃度を示す。ＢからＣが第１番目の試料の
分析行程を示し、ＣからＤまでが第２番目の試料
の分析行程を示す。A′からＢまでが予備行程で
ある。

第２図のように、従来は、予備行程において、
再生液Ｂ５を供給したあと、分析行程で用いられ
る第１段緩衝液Ｂ１を供給することによつて分離
カラム内を平衡化し、その後第１番目の試料を分
析計内に導入して分析行程を開始する。

本発明者らは、Ｂ点、Ｃ点、Ｄ点の各点で、順
次各試料の分析行程をスタートし、以降の試料に
ついて分析行程を繰り返すことによつて、全分析
時間を短縮することを試みた。

ところが、第１番目の試料については、第３図
に示すような問題が生じた。この場合、第２図の
ａに示すPHの変化を見ると、カラム内の条件がど
のスタート点でも同じであるように見える。しか
しながら、カウンターイオン濃度の観点から見る
と、予備行程のスタート点であるA′におけるカ
ウンターイオン濃度は0.2Nである。ところが、
Ｃ点およびＤ点のカウンターイオン濃度を実測す
ると、第２図の破線のようになる。すなわち、第
１番目の試料スタート点Ｂにおけるカウンターイ
オン濃度と、第２番目以降の試料のスタート点Ｃ
点およびＤ点におけるカウンターイオン濃度と
は、実際には相違していることがわかつた。第２
回目以降の分析は、実は完全は平衡化が行われな
いままスタートされ、それなりのリテンシヨンタ
イムが安定しているため、再現性が得られるので
ある。しかし、第１回目のリテンシヨンタイムと
異なるため、成分ピークの正確な同定が困難とな
る。

本発明の目的は、一連の試料を繰り返し分析す
る場合に全分析時間を短縮できる液体クロマトグ
ラフイー分析方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、一連の試料を液体クロマトグラフイ
ー分析する方法であつて、４種以上の溶離液を用
いて試料を段階的に溶離する成分分離操作と、分
離カラムに強アルカリ性の再生液を供給し続いて
初段溶離液と同じ溶離液を供給して分離カラムを
平衡化する再生操作とを含む分析行程を、各試料
毎に繰り返すと共に、第１番目の試料の分析行程
の先立つて予備行程を行う分析方法に適用され
て、予備行程において、まず４種以上の溶離液の
内の最終段の溶離液と動じ溶離液を、次いで上記
再生液および上記初段溶離液と同じ溶離液だけを
上記分離カラムに順次供給することを特徴とす
る。

〔作用〕

本発明では、第１の試料の分析行程を行う前の
予備行程の間に、強アルカリ性の再生液および初
段溶離液と同じ溶離液を分離カラムに供給するこ
とに加えて、それらの供給の前に最高カウンター
イオン濃度を有する最終段階溶離液と同じ溶離液
を供給することによつて、第１資料の分析行程の
スタート時点でのカウンターイオン濃度を、第２
試料以降の分析行程のスタート時点のカウンター
イオン濃度と実質的に同じにし、すべての試料に
関する各分離成分のリテンシヨンタイムの再現性
を向上し、全体の分析時間を短縮する。

〔実施例〕

本発明の一実施例を第１図を参照して説明す
る。第１段溶離液Ｂ１のPHは3.3、カウンターイ
オン濃度は0.2Nである。ここで、試料がアミノ
酸混合物である場合は、カウンターイオンとして
ナトリウムイオン又はリチウムイオンが通常用い
られる。第２段溶離液Ｂ２はPHは3.2であり、カ
ウンターイオン濃度は、0.2Nである。第３段溶
離液B3のPHは4.3であり、カウンターイオン濃度
は0.2Nである。第４段溶離液B4のPHは4.9であ
り、カウンターイオン濃度は1.2Nである。再生
液のPHは12でありカウンターイオン濃度は0.2N
である。この例は、蛋白加水分解物アミノ酸試料
の分析方法である。

第１図において、Ａ点からＢ点の間の予備行程
のあと、第１試料の分析行程はＢ点から開始さ
れ、第２試料の分析行程はＣ点から開始され、第
３試料の分析行程はＤ点から開始され、以下同様
に一連の試料がくり返し分析される。

予備行程では、最初に第４段溶離液（緩衝液）
と同じものが供給され、次いで、再生液Ｂ５、第
１段溶離液Ｂ１が供給される。溶離液Ｂ４のカウ
ンターイオン濃度は1.2Nであるので、第１試料
の分析行程開始点であるＢ点におけるカウンター
イオン濃度の上昇程度は、第２試料、第３試料の
分析行程開始点Ｃ点、Ｄ点のそれと同じにでき
る。したがつて、各分析行程開始点を、従来のも
のより、早めることができ、一連の試料に対する
全分析時間は大幅に短縮できる。

上述の実施例では、蛋白加水分解物アミノ酸試
料を説明しているが、生体液アミノ酸試料でも同
様の予備行程が実施される。生体液アミノ酸試料
の分析の場合は、カウンターイオン濃度が、溶離
液（緩衝液）の段階が進むにつてれ１段ずつ高く
なるが、この場合、予備行程の最初に、分析行程
におけるカウンターイオン濃度の最も高い最終段
溶離液が分離カラムに供給される。

第１図の実施例をアミノ酸分析計で実行する場
合には、操作パネルにウオーミングアツプキーを
設け、このキーをオペレータが押すと、予備行程
が第１図の順序で行われるように制御系および流
路系を構成することは容易である。また、このウ
オーミングアツプキーを設ける代りに、時間を指
定して予備行程の開始点を選択するソフトウエア
機能を持たせるように構成することも容易であ
る。

予備行程は、分析操作条件が、例えば蛋白加水
分解物アミノ酸測定用から生体液アミノ酸測定用
に変わつたような場合、あるいは、分析装置の始
動時の場合に実行される。

〔発明の効果〕

本発明によれば、一連の試料についての各分析
行程の開始点を、充分な分離カラム条件に達する
前に設定できるので、全体の分析時間を短縮で
き、この場合、第１試料の各成分のリテンシヨン
タイムを第２試料以降のものと実質的に一致させ
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を説明するための
図、第２図は従来方法における問題点の原因を説
明するための図、第３図は従来方法によるリテン
シヨンタイムの変化例を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 一連の試料を液体クロマトグラフイー分析す
   る方法であつて、４種以上の溶離液を用いて試料
   を段階的に溶離する成分分離操作と、分離カラム
   に強アルカリ性の再生液を供給し続いて初段溶離
   液と同じ溶離液を供給して上記分離カラムを平衡
   化する再生操作とを含む分析行程を、各試料毎に
   繰り返すと共に、第１番目の試料の分析行程に先
   立つて予備行程を行う分析方法において、上記予
   備行程において、まず上記４種以上の溶離液の内
   の最終段の溶離液と同じ溶離液を、次いで上記再
   生液および上記初段溶離液と同じ溶離液だけを上
   記分離カラムに順次供給することを特徴とする液
   体クロマトグラフイー分析方法。