JP7434870B2 - バッファの設定流量値を補正する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、バッファの設定流量値を補正する方法に関するものである。
糖尿病の判断基準の指標として、血液中の糖化ヘモグロビン（ＳＡ１ｃ）の割合を基に診断することが多い。ＳＡ１ｃ％の測定法として、測定原理の異なる複数の測定法が用いられる。その代表的な手法は、液体クロマトグラフィによるものである。液体クロマトグラフィ法でも、分離モードの違いによりイオン交換法クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法がある。いずれの方法でも、塩濃度、組成の異なる複数のバッファを切り替えて（ステップグラジエント）、目的である糖化ヘモグロビンを分離し、全体の占める割合からＳＡ１ｃ％を算出するものである。ステップグラジエントは、事前に設定された各バッファの溶出容量に関するタイムテーブルに従い、バッファの切り替えが実施される。
近年の技術の進歩に伴い、精度よく送液できるポンプが容易に入手できるようになったことから、「溶出容量」を「溶出時間」に置き換えて定性定量を行うことが主流となっている。従って、ポンプの送液量が何らかの要因によって変動した場合、分析精度を落とすこととなる。
例えば、成分Ａと成分Ｂの２成分から成る試料を、成分Ｂをカラムに吸着、成分Ａはカラムを素通りして溶出させるバッファ１、カラムに吸着された成分Ｂを脱着させて溶出させるバッファ２を用いたと仮定する。流量１．０ｍＬ／ｍｉｎを基準とし、０．５分でバッファを切り替えるステップグラジエントを行い、成分Ａが０．３分、成分Ｂが０．７分に溶出したとする。何らかの要因により実際の流量が０．８ｍＬ／ｍｉｎに低下した場合、図１のように溶出時間が変化する。
すなわち、ステップグラジエントでの実流量の変化は、測定結果に影響を与える。
すなわち、ステップグラジエントでの実流量の変化は、測定結果に影響を与える。
本発明の目的は、送液ポンプの実流量を簡便な方法で算出し、安定的なステップグラジエントを行えるよう、バッファの設定流量値を補正する方法を提供するものである。
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
ステップグラジエントによる糖化ヘモグロビンの液体クロマトグラフィ分析において、
最も溶出力の高いバッファを通液した状態で血液検体をカラムに注入し、
ボイド位置に溶出したピークの溶出時間と、事前に定めた基準溶出時間との比率から、バッファの設定流量値を補正する方法に関する。
ステップグラジエントによる糖化ヘモグロビンの液体クロマトグラフィ分析において、
最も溶出力の高いバッファを通液した状態で血液検体をカラムに注入し、
ボイド位置に溶出したピークの溶出時間と、事前に定めた基準溶出時間との比率から、バッファの設定流量値を補正する方法に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
液体クロマトグラフィの場合、試料注入部～分析カラム～検出部までの間でのボイド容量（空孔容量）が一定量存在する。一般的に液体クロマトグラフィでは、注入された試料が、分析カラム内のゲルと何らかの物理的／科学的な相互作用を起こし、通過する速度に差を生じさせ分離を行うものである。しかし、試料とゲルの間で物理的／科学的な相互作用を起こさない場合、試料は素通りし、前記ボイド容量分のバッファが送液された位置で溶出する。
つまり、このような条件では、ボイド容量＝溶出時間×実流量という関係が成立する。
つまり、このような条件では、ボイド容量＝溶出時間×実流量という関係が成立する。
まず、本発明の一態様である「アフィニティクロマトグラフィを用いた糖化ヘモグロビン測定」へ適用した場合を説明する。本発明は、液体クロマトグラフィであれば適用可能であり、３種類のバッファを切り替えて使用するようなイオン交換クロマトグラフィであっても当然、適用できる。
実際の検体測定では、バッファ１で糖化ヘモグロビンをカラムに吸着させ、それ以外の成分を溶出させる。次にバッファ２により、吸着された糖化ヘモグロビンをカラムから脱着させる（図２ａ、図３ａ参照）。
カラムに吸着された糖化ヘモグロビンを溶出させるために使用される「バッファ２」を送液した状態で、試料を注入すると、糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンは分離されず、システムのボイド容量の位置に１本のピーク（以下、「ボイドピーク」ということがある）として溶出することとなる（図２ｂ、図３ｂ参照）。
そこで、基準流量（ｆ０）となる状態で得られたボイドピークの溶出時間（Ｅ０）と、補正を実施したいタイミングで得られたボイドピークの溶出時間（Ｒ０）から、基準流量と補正前の流量設定値は同じであることを前提として、下式（１）にて補正流量ｆを算出し、実流量に即した設定流量に補正することができる。
基準流量（ｆ０）は、事前に計測し求めておく必要がある。特に、装置間差、施設間差を無くすために補正を実施する場合は、より正確に測定することが望ましい。流量の測定方法は、電子天秤を使用した重量法や、メスシリンダ等の計量容器を使用した容量法等で、正確に求めることが望ましい。また。基準流量の算出は一度だけでなく、装置のコンディションが大きく変化するタイミング、例えばカラム交換後、装置のメンテナンス後などで、再測定すると更に良い。
バッファ２では検体種別に関係なく、全ての成分がボイド位置に溶出するため、ここで使用する試料は血液由来の試料であればよく、特に限定されるものではない。好ましくは、検量線を作製する為に用いられるキャリブレータ（Ｌｏｗ Ｌｅｖｅｌ、Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ）や、日常の管理に使用されるコントロール試料（Ｌｏｗ Ｌｅｖｅｌ、Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ）を使用することが望ましい。また、実際の測定に準備された患者検体の１つを使用しても良い。
また、本発明のボイドピークの溶出時間を基にした流量補正を行うタイミングは、実試料の測定前であれば特に限定されるものではなく、検量線を作成するタイミングで標準試料の１つを使用して行う、コントロールを測定するタイミングで標準試料の１つを使用して行う、操作者が任意のタイミングで何らかの試料を使用して行うことも有効である。
糖化ヘモグロビンの液体クロマトグラフィ分析において、安定的なステップグラジエントを行うことが可能になる。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
まず、本発明の第一様態であるアフィニティクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビン測定の系で検証した。
図４に本検証で使用したシステム構成を示す。
送液ポンプ（８）、試料注入機構（９）および、分析カラム（１２）、可視光検出器（１３）を接続した。また、送液ポンプ（８）の吸引側に切り替え弁（５）（６）を配し、ＳＡ１ｃ吸着用溶離液（１）とＳＡ１ｃ脱着用溶離液（２）の選択ができるようにした。
いずれの構成機器も、全て東ソー（株）製の８０２０シリーズのＨＰＬＣを用い、分析カラムは、ｍ－アミノフェニルボロン酸をリガンドとしたＴＳＫｇｅｌ Ｂｏｒｏｎａｔｅ－５ＰＷ（東ソー（株）製、粒径１０μｍ）を内径２．５ｍｍ長さ１０ｍｍのカラム管に充填したものを使用した。
なお、送液ポンプ（８）には監視／制御を目的として圧力計が内蔵されているが、今回の検証では前記圧力計は使用せず（通過させず）、独立した圧力計（２１）をポンプの出口側に接続して、圧力の監視に使用した。
図４に本検証で使用したシステム構成を示す。
送液ポンプ（８）、試料注入機構（９）および、分析カラム（１２）、可視光検出器（１３）を接続した。また、送液ポンプ（８）の吸引側に切り替え弁（５）（６）を配し、ＳＡ１ｃ吸着用溶離液（１）とＳＡ１ｃ脱着用溶離液（２）の選択ができるようにした。
いずれの構成機器も、全て東ソー（株）製の８０２０シリーズのＨＰＬＣを用い、分析カラムは、ｍ－アミノフェニルボロン酸をリガンドとしたＴＳＫｇｅｌ Ｂｏｒｏｎａｔｅ－５ＰＷ（東ソー（株）製、粒径１０μｍ）を内径２．５ｍｍ長さ１０ｍｍのカラム管に充填したものを使用した。
なお、送液ポンプ（８）には監視／制御を目的として圧力計が内蔵されているが、今回の検証では前記圧力計は使用せず（通過させず）、独立した圧力計（２１）をポンプの出口側に接続して、圧力の監視に使用した。
ＳＡ１ｃ吸着用溶離液（ｐＨ８．８）は、以下の組成で調整したものを使用した。
グリシン５０ｍＭ
塩化マグネシウム・６水和物５ｍＭ
塩化ナトリウム５０ｍＭ
ＳＡ１ｃ脱着用溶離液（ｐＨ８．８）は、以下の組成で調整したものを使用した。
グリシン５０ｍＭ
塩化ナトリウム５０ｍＭ
Ｄ－ソルビトール１００ｍＭ
その他の測定条件は以下の通りである。
カラム温度 ：４５℃
検出波長 ：４１５ｎｍ（単波長）
検出器レスポンス ：０．１５ｓ
データ収集サンプリングピッチ：１００ｍｓ
グリシン５０ｍＭ
塩化マグネシウム・６水和物５ｍＭ
塩化ナトリウム５０ｍＭ
ＳＡ１ｃ脱着用溶離液（ｐＨ８．８）は、以下の組成で調整したものを使用した。
グリシン５０ｍＭ
塩化ナトリウム５０ｍＭ
Ｄ－ソルビトール１００ｍＭ
その他の測定条件は以下の通りである。
カラム温度 ：４５℃
検出波長 ：４１５ｎｍ（単波長）
検出器レスポンス ：０．１５ｓ
データ収集サンプリングピッチ：１００ｍｓ
検体として、東ソー（株）製のキャリブレータ（Ｃａｌ＿１：ＨｂＡ１ｃ ５．９％［ＮＧＳＰ］、Ｃａｌ＿２：ＨｂＡ１ｃ １０．９％［ＮＧＳＰ］）、コントロール（Ｃｔｌ＿１：ＨｂＡ１ｃ ５．０±０．３％［ＮＧＳＰ］、Ｃｔｌ＿２：ＨｂＡ１ｃ １０．１±０．５％［ＮＧＳＰ］）を使用した。使用する際は、同取扱説明書の手順で溶解・希釈して用いた。併せて、実際の血液検体も使用した。使用する際は、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計（ＨＬＣ－７２３シリーズ）専用の溶血／洗浄液にて溶解・希釈して用いた。
（実施例１）
まず、設定流量によるボイドピークの時間変化を確認した。
流路切り替え弁（５）を閉、流路切り替え弁（６）を開とし、糖化ヘモグロビンを脱着させるバッファ２が分析カラムに通液される状態とし、試料注入を行い、全成分がボイド位置に溶出させ、その時間変化を確認した（試料：Ｃｔｌ＿２）。
表１は設定流量に対するボイドピークの溶出時間（５回の平均値を表す。）を示した表である。また、図５は設定流量の逆数とボイドピークの溶出時間を示した図である。
まず、設定流量によるボイドピークの時間変化を確認した。
流路切り替え弁（５）を閉、流路切り替え弁（６）を開とし、糖化ヘモグロビンを脱着させるバッファ２が分析カラムに通液される状態とし、試料注入を行い、全成分がボイド位置に溶出させ、その時間変化を確認した（試料：Ｃｔｌ＿２）。
表１は設定流量に対するボイドピークの溶出時間（５回の平均値を表す。）を示した表である。また、図５は設定流量の逆数とボイドピークの溶出時間を示した図である。
これらから分かるように、ボイドピークの溶出時間と設定流量の逆数は良好な直線関係が見られる。切片の無い一次式（ｙ＝ａｘ）で近似した結果を示している。
回帰式、Ｒ２係数は以下の通りである。
ｙ＝０．２０５３ｘ Ｒ２＝０．９８９７
Ｒ２係数が０．９９と非常に良好であり、両者の間に良好な相関があることが分かる。すなわち、バッファ２により送液した際は、試料はゲルと相互作用がほとんどなく、ボイド容量位置に溶出していることを示している。
つまり、バッファ２を送液した状態では、分離ゲルとの相互作用はほぼ無く、測定システムのボイド位置に溶出しており、ボイドピークの溶出時間から流量が算出できることを意味している。
回帰式、Ｒ２係数は以下の通りである。
ｙ＝０．２０５３ｘ Ｒ２＝０．９８９７
Ｒ２係数が０．９９と非常に良好であり、両者の間に良好な相関があることが分かる。すなわち、バッファ２により送液した際は、試料はゲルと相互作用がほとんどなく、ボイド容量位置に溶出していることを示している。
つまり、バッファ２を送液した状態では、分離ゲルとの相互作用はほぼ無く、測定システムのボイド位置に溶出しており、ボイドピークの溶出時間から流量が算出できることを意味している。
（実施例２）
次に、本発明の方法の有効性を検証するため、装置間差を縮小する手法に適用した。
実施例１で使用したシステムの送液ポンプＡを他のポンプＢ～Ｆに差し替えて、本発明を用いることで測定結果がより近い値になるか検証した。なお、送液ポンプ以外は全て同じ機器構成、測定条件とした。以下、ポンプＡを用いたシステムを「システムＡ」、ポンプＢ～Ｆを用いたシステムをそれぞれシステムＢ～Ｆと呼ぶ。
まず、設定流量を同じ０．７５０ｍＬ／ｍｉｎとし、ステップグラジエントによる分離、バッファ２によるボイドの確認を行った（試料：Ｃｔｌ＿２）。ステップグラジエントは測定開始から０．５８３分まではバッファ１、０．５８３分から２．５００分まではバッファ２、２．５００分以降はバッファ１とした。結果を表２に示す。なお、各測定は５回ずつ行い、表中のボイドピークの値はその平均値を表す。
次に、本発明の方法の有効性を検証するため、装置間差を縮小する手法に適用した。
実施例１で使用したシステムの送液ポンプＡを他のポンプＢ～Ｆに差し替えて、本発明を用いることで測定結果がより近い値になるか検証した。なお、送液ポンプ以外は全て同じ機器構成、測定条件とした。以下、ポンプＡを用いたシステムを「システムＡ」、ポンプＢ～Ｆを用いたシステムをそれぞれシステムＢ～Ｆと呼ぶ。
まず、設定流量を同じ０．７５０ｍＬ／ｍｉｎとし、ステップグラジエントによる分離、バッファ２によるボイドの確認を行った（試料：Ｃｔｌ＿２）。ステップグラジエントは測定開始から０．５８３分まではバッファ１、０．５８３分から２．５００分まではバッファ２、２．５００分以降はバッファ１とした。結果を表２に示す。なお、各測定は５回ずつ行い、表中のボイドピークの値はその平均値を表す。
表２から、システム間において、各ピークの溶出時間に差異が生じていることが分かる。
次に、ボイドピークの溶出時間を基に、設定流量の補正を試みた。ここではシステムＡを標準機として、他のシステムＢ～Ｆの流量補正を実施した。
流量補正値は以下のように算出される。
システムＢの流量補正値：
（システムＡの設定流量）×（システムＢの溶出時間）／（システムＡの溶出時間）
０．７５０ × ０．２７７８ ／ ０．２８４８ ＝０．７３２
システムＣの流量補正値：
（システムＡの設定流量）×（システムＣの溶出時間）／（システムＡの溶出時間）
０．７５０ × ０．２７８４ ／ ０．２８４８ ＝０．７３３
同様に、システムＤの流量補正値は０．７３１、システムＥの流量補正値は０．７４６、システムＦの流量補正値は０．７３５と算出される。
次に、ボイドピークの溶出時間を基に、設定流量の補正を試みた。ここではシステムＡを標準機として、他のシステムＢ～Ｆの流量補正を実施した。
流量補正値は以下のように算出される。
システムＢの流量補正値：
（システムＡの設定流量）×（システムＢの溶出時間）／（システムＡの溶出時間）
０．７５０ × ０．２７７８ ／ ０．２８４８ ＝０．７３２
システムＣの流量補正値：
（システムＡの設定流量）×（システムＣの溶出時間）／（システムＡの溶出時間）
０．７５０ × ０．２７８４ ／ ０．２８４８ ＝０．７３３
同様に、システムＤの流量補正値は０．７３１、システムＥの流量補正値は０．７４６、システムＦの流量補正値は０．７３５と算出される。
図６は、設定流量を０．７５０ｍＬ／ｍｉｎで測定した結果と、設定流量を流量補正値に設定しなおして測定した結果を比較した図である。補正を実施することで、クロマトグラムの同一性が高まっていることが分かる。
表３は、実際のステップグラジエントを行って、補正を実施しない場合と、補正を実施した場合での、Ａ０ピーク、Ａ１ｃピークのシステム間における溶出時間の再現性を示した表である。いずれのピークもＣｖ％が低下し、ばらつきが少なくなっていることがわかる。
ここまで、凍結乾燥品のコントロール検体を使用して検証を実施してきた。次に、本発明において、用いる試料による差異が生じるかの検証を行った。
検証に使用した試料は、検量線作成に使用する凍結乾燥品であるキャリブレータ（Ｃａｌ＿１、Ｃａｌ＿２）、精度管理に使用する凍結乾燥品であるコントロール（Ｃｔｌ＿１、Ｃｔｌ＿２）、全血患者検体（＃１～＃１０）の計１４種である。ｓＡ１ｃ％の値を表４に示す。なお、本値は、東ソー（株） グリコヘモグロビン分析計 ＧＨｂ１１での測定値である。
また、図７は検体とボイドピークの溶出時間の関係を示した図である。なお、測定は、Ｃａｌ＿１、２、Ｃｔｌ＿１、２、＃１～＃１０の順で行った。つまり図７の横軸は経過時間の意味ももつ。ここから分かるように、検体の種別、検体の形態（全血、凍結乾燥品）によらず、バッファ２を送液状態でのボイドピークの溶出時間（ピークトップ時間）は、ほぼ同じとなる。つまり、本発明は、糖化ヘモグロビン測定に用いる血液試料であれば良く、特に限定する必要がないことが分かる。
（実施例３）
イオン交換クロマトグラフィによる糖化ヘモグロビン測定系で検証した。
図８に使用したシステム構成を示す。
送液ポンプ（８）、試料注入機構（９）および、分析カラム（１２）、可視光検出器（１３）を接続した。また、送液ポンプ（８）の吸引側に切り替え弁（５）（６）（７）を配し、塩濃度等が異なる３種の溶離液（１）（２）（３）が選択できるようにした。
いずれの構成機器も、全て東ソー（株）製の８０２０シリーズのＨＰＬＣを用い、分析カラムおよび溶離液は、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計ＧＨｂＶＩＩＩ用のものを使用した。
なお、送液ポンプ（８）には監視／制御を目的として圧力計が内蔵されているが、今回の検証では前記圧力計は使用せず（通過させず）、独立した圧力計（２１）をポンプの出口側に接続して、圧力の監視に使用した。
その他の測定条件は以下の通りである。
カラム温度 ：２５℃
検出波長 ：４１５ｎｍ（単波長）
検出器レスポンス ：０．１５ｓ
データ収集サンプリングピッチ：１００ｍｓ
イオン交換クロマトグラフィによる糖化ヘモグロビン測定系で検証した。
図８に使用したシステム構成を示す。
送液ポンプ（８）、試料注入機構（９）および、分析カラム（１２）、可視光検出器（１３）を接続した。また、送液ポンプ（８）の吸引側に切り替え弁（５）（６）（７）を配し、塩濃度等が異なる３種の溶離液（１）（２）（３）が選択できるようにした。
いずれの構成機器も、全て東ソー（株）製の８０２０シリーズのＨＰＬＣを用い、分析カラムおよび溶離液は、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計ＧＨｂＶＩＩＩ用のものを使用した。
なお、送液ポンプ（８）には監視／制御を目的として圧力計が内蔵されているが、今回の検証では前記圧力計は使用せず（通過させず）、独立した圧力計（２１）をポンプの出口側に接続して、圧力の監視に使用した。
その他の測定条件は以下の通りである。
カラム温度 ：２５℃
検出波長 ：４１５ｎｍ（単波長）
検出器レスポンス ：０．１５ｓ
データ収集サンプリングピッチ：１００ｍｓ
まず、設定流量によるボイドピークの時間変化を確認した。
流路切り替え弁（５）（６）を閉、流路切り替え弁（７）を開とし、最も溶出力の高いバッファ３が分析カラムに通液されるとし、試料注入を行い、全成分がボイド位置に溶出させ、その時間変化を確認した（試料：Ｃｔｌ＿２）。
表５は設定流量に対するボイドピークの溶出時間（５回の平均値を表す）を示した表である。また、図９は設定流量の逆数とボイドピークの溶出時間を示した図である。
流路切り替え弁（５）（６）を閉、流路切り替え弁（７）を開とし、最も溶出力の高いバッファ３が分析カラムに通液されるとし、試料注入を行い、全成分がボイド位置に溶出させ、その時間変化を確認した（試料：Ｃｔｌ＿２）。
表５は設定流量に対するボイドピークの溶出時間（５回の平均値を表す）を示した表である。また、図９は設定流量の逆数とボイドピークの溶出時間を示した図である。
これらから分かるように、ボイドピークの溶出時間と設定流量の逆数は良好な直線関係が見られる。つまり、イオン交換クロマトグラフィによる糖化ヘモグロビン測定系であっても、ボイドピークの溶出時間から実際に送液されている流量が算出できることを意味している。
次に、システムの送液ポンプＡを他のポンプＢ～Ｅに差し替えて、本発明を用いることで測定結果がより近い値になるか検証した。なお、送液ポンプ以外は全て同じ機器構成、測定条件とした。以下、ポンプＡを用いたシステムを「システムＡ」、ポンプＢ～Ｅを用いたシステムＢ～Ｅと呼ぶ。
まず、設定流量を同じ１．２５ｍＬ／ｍｉｎとし、最も溶出力の高いバッファ３によるボイドピークの溶出時間を測定した（試料：Ｃｔｌ＿２）。次に、ボイドピークの溶出時間を基に、設定流量の補正を試みた。ここではシステムＡを標準機として、他のシステムＢ～Ｅの流量補正を実施した。結果を表６に示す。なお、各測定は５回ずつ行い、表中のボイドピークの値はその平均値を表す。
まず、設定流量を同じ１．２５ｍＬ／ｍｉｎとし、最も溶出力の高いバッファ３によるボイドピークの溶出時間を測定した（試料：Ｃｔｌ＿２）。次に、ボイドピークの溶出時間を基に、設定流量の補正を試みた。ここではシステムＡを標準機として、他のシステムＢ～Ｅの流量補正を実施した。結果を表６に示す。なお、各測定は５回ずつ行い、表中のボイドピークの値はその平均値を表す。
図１０は、設定流量を１．２５ｍＬ／ｍｉｎで３液ステップグラジエントによる測定をした結果と、設定流量を流量補正値に設定しなおして３液ステップグラジエントによる測定をした結果とを比較した図である（試料：Ｃｔｌ＿２）。ステップグラジエントは測定開始から０．３３３分まではバッファ１、０．３３３分から０．７００分まではバッファ２、０．７００分から１．３３３分まではバッファ３、１．３３３分以降はバッファ１とした。補正を実施することで、クロマトグラムの同一性が高まっていることが分かる。
１ バッファ１
２ バッファ２
３ バッファ３
４ 脱気装置
５ バッファ１用切り替え弁
６ バッファ２用切り替え弁
７ バッファ３用切り替え弁
８ 送液ポンプＡ
９ 試料注入機構
１０ プレフィルタ
１１ プレヒートコイル
１２ 分析カラム
１３ 可視光検出器
１４ カラムオーブン
１６ 送液ポンプＢ
１７ 送液ポンプＣ
１８ 送液ポンプＤ
１９ 送液ポンプＥ
２０ 送液ポンプＦ
２１ 圧力計
２ バッファ２
３ バッファ３
４ 脱気装置
５ バッファ１用切り替え弁
６ バッファ２用切り替え弁
７ バッファ３用切り替え弁
８ 送液ポンプＡ
９ 試料注入機構
１０ プレフィルタ
１１ プレヒートコイル
１２ 分析カラム
１３ 可視光検出器
１４ カラムオーブン
１６ 送液ポンプＢ
１７ 送液ポンプＣ
１８ 送液ポンプＤ
１９ 送液ポンプＥ
２０ 送液ポンプＦ
２１ 圧力計
Claims (6)
- ステップグラジエントによる糖化ヘモグロビンの液体クロマトグラフィ分析において、
最も溶出力の高いバッファを通液した状態で血液検体をカラムに注入し、
ボイド位置に溶出したピークの溶出時間と、事前に定めた基準溶出時間との比率から、バッファの設定流量値を補正する方法。 - バッファの設定流量値に、ボイド位置に溶出したピークの溶出時間を事前に定めた基準溶出時間で除した値を、乗じることで、前記設定流量値を補正することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 血液検体が、検量線を作成する為に用いる標準試料、装置の運転状態を確認する為に用いるコントロール試料又は患者の血液のいずれかであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィ分析の分離原理がイオン交換に基づくことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の方法。
- 液体クロマトグラフィ分析の分離原理がアフィニティに基づくことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の方法。
- 請求項１～５のいずれかに記載の方法を行った後に、実試料の測定を行うことを特徴とする血液検体の糖化ヘモグロビンを分析する方法。
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-
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|---|---|---|---|---|
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| JP2014115118A (ja) | 2012-12-06 | 2014-06-26 | Hitachi High-Technologies Corp | 液体クロマトグラフ装置 |
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