JP7243315B2 - アフィニティ法による糖化ヘモグロビンの測定方法および装置 - Google Patents

Description

本発明は、アフィニティ法による糖化ヘモグロビンの測定方法および装置に関するものである。

糖尿病の判断基準の指標として、血液中の糖化ヘモグロビン（ＳＡ１ｃ）の割合を基に診断することが多い。ＳＡ１ｃ％の測定法として、アフィニティクロマトグラフィの原理に基づく測定方法が広く用いられている。具体的には、血液を溶血、希釈後、アミノフェニルボロン酸基を配したゲルを充填したカラムに導入し、第一の溶離液で糖化ヘモグロビンをゲルに吸着させ非糖化ヘモグロビンを溶出させ、一定時間後、糖化ヘモグロビンを脱着させる第二の溶離液に切り替え、糖化ヘモグロビンを溶出させる。

前記２種類の溶離液は、種々の緩衝液、濃度が提案されているが、一般的には、両者の組成は大きく異なり、検出器のバックグラウンドの差異もあり、ベースラインが階段状に変動するため、各ピーク面積を正確に算出することについて難しい面があった。

本発明の目的は、ベースラインの変動がなく、計算処理が簡便である、アフィニティ法による糖化ヘモグロビンの測定可能な装置を提供するものである。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明の一態様は、
溶離液を送液するための送液ポンプと、
前記送液ポンプよりも下流に接続された試料注入機構と、
糖化ヘモグロビンを特異的に吸着できるアフィニティゲルを充填した分析カラムと、
可視光検出器と、
切り替えバルブと、
を備えた液体クロマトグラフ装置であって、
前記切り替えバルブは、前記試料注入機構、前記可視光検出器、前記分析カラムの順で流体接続された第一の状態と、
前記試料注入機構、前記分析カラム、前記可視光検出器の順で流体接続された第二の状態に切り替え可能であることを特徴とする。

以下、本発明を詳細に説明する。

図１は本発明の一態様である装置の構成を示したものであり、流路切り替えバルブの状態を示した図である。なお、図中の太実線は繋がっている流路を示している。

測定開始時に、切り替えバルブを第一の状態とし、糖化ヘモグロビン吸着用の溶離液を送液する。この状態で検体を試料注入機構より注入する。これにより、検体は、可視光検出器、分析カラムの順で流れて、排出される。検体は直接可視光検出器に導入されることから、検出器では検体の全量に比例した信号が得られる。検出器を出た試料はカラムに導入されるが、糖化ヘモグロビン成分はゲルに吸着され、それ以外の成分はカラム内を移動していく（図１ａ参照）。

次に、切り替えバルブを第二の状態に切り替える。これにより、溶離液は分析カラム、可視光検出器の順で流れて、排出される。分析カラム内を移動していた、糖化ヘモグロビン以外の成分は検出器へと導かれる。つまり、検出器では糖化ヘモグロビン以外の成分量に比例した信号が得られる（図１ｂ参照）。

バルブ切り替えのタイミングは早すぎると、検出器で検体の全量について正確な信号が得られず、タイミングが遅すぎると分析カラム内を移動していた、糖化ヘモグロビン以外の成分が排出されてしまうため、第一の状態で検出器の出力信号が適切な閾値以下となったら自動的に切り替わるような態様としておくことが好ましい。適切な閾値については、サンプルによるテスト運転等によって適宜決定すればよい。

切り替えバルブが第一の状態で得られた検出器信号（Ａ）と第二の状態で得られた検出器信号（Ｂ）から、全体量に対する糖化ヘモグロビン割合（ＳＡ１ｃ％）を算出できる。すなわち、糖化ヘモグロビンの量は、全体の量（Ａ）と非糖化ヘモグロビンの量（Ｂ）との差に相当する。全体の量（Ａ）に対する差分（Ａ）－（Ｂ）の割合が、糖化ヘモグロビン割合（ＳＡ１ｃ％）となる。（Ａ）、（Ｂ）の量は各工程で得られるピークの積分値またはピーク面積に相当する。

従来のアフィニティ法では１回の分析において、２つの溶離液（糖化ヘモグロビン吸着用、糖化ヘモグロビン脱着用）を順次切り替えを行う必要があるのに対して、本発明の装置は、上述した通り、バルブの切り替えにより、検体の全量及び糖化ヘモグロビン以外の成分を検出器で検出可能なため、糖化ヘモグロビン吸着用の溶離液のみの使用で糖化ヘモグロビン割合を測定可能である。このため、本発明は溶離液に組成変化がなく、バックグラウンドの変動がない状態での測定が可能となる（図２参照）。

また、本発明の一態様である装置で検体を連続して分析を行う場合、分析カラムに吸着された糖化ヘモグロビンは累積されていくが、使用するゲルの吸着の限界を超えるまでは問題なく、連続分析が可能である。図３に切り替えバルブの状態と、得られる検出器信号の変化を模式的に示す。

ゲルの吸着の限界を超えた場合や、事前に設定した測定回数を超えた場合は、分析カラムは交換してもよいが、例えば、送液ポンプの上流側に切り替え弁（図４ａ参照）又は開閉弁（図４ｂ参照）を設けたり、送液ポンプを２つ備えることで（図４ｃ参照）、糖化ヘモグロビン吸着用溶離液と糖化ヘモグロビン脱着用溶離液を配することが可能になり、一定回数連続して測定を行った後、糖化ヘモグロビン脱着用溶離液を流し、蓄積された糖化ヘモグロビン成分を洗い流し、再生操作を行ってもよい。

本発明の一態様である装置を使用することで、試料注入機構より血液試料を糖化ヘモグロビン吸着用溶離液で押し流し、可視光検出器にて血液の濃度変化を計測し、計測後の前記血液試料を、糖化ヘモグロビンを特異的に吸着できるアフィニティゲルを充填した分析カラムに導いた後、糖化ヘモグロビン以外の成分の濃度変化を可視光検出器で計測し、血液の濃度変化の量と、糖化ヘモグロビン以外の成分の濃度変化の量との差から糖化ヘモグロビンの量を算出することが簡便に行えるが、可視光検出器、分析カラム、可視光検出器の順に血液試料を糖化ヘモグロビン吸着用溶離液で押し流せれば、使用する装置は前述の装置には限られない。

ベースラインの変動がなく、計算処理が簡便である、アフィニティ法による糖化ヘモグロビンの測定が可能となった。

本発明の一態様である装置の構成を示した図である。図１ａは、切り替えバルブを第一の状態としたとき、図１ｂは切り替えバルブを第二の状態としたときを示している。 従来のアフィニティクロマトグラフィと本発明の方法によるベースラインの変動の違いを模式的に示した図である。 本発明の方法による糖化ヘモグロビンの分離のパターンと流路切り替えバルブの様態を模式的に示した図である。 本発明の他の態様を示した図である。図４ａは送液ポンプを１台のみ使用し、１つの切り替え弁により２液を切り替える態様、図４ｂは送液ポンプを１台のみ使用し、１つの開閉弁により２液を切り替える態様、図４ｃは送液ポンプを２台使用し、２液を切り替える態様である。 実施例１で、キャリブレータを連続で３回測定した結果および溶血洗浄液を測定した結果を重ね描いた図である。図５ａがＬｅｖｅｌ＿１（Ｌｏｗ）、図５ｂがＬｅｖｅｌ＿２（Ｈｉｇｈ）の検体である。 実施例１で、コントロールを連続で３回測定した結果および溶血洗浄液を測定した結果を重ね描いた図である。図６ａがＬｅｖｅｌ＿１（Ｌｏｗ）、図６ｂがＬｅｖｅｌ＿２（Ｈｉｇｈ）の検体である。 検体濃度変化によるＳＡ１ｃの面積％への影響を示した図である。横軸は希釈率の対数、縦軸は算出されたＳＡ１ｃ面積％である。 実施例３の測定結果を示した図である。図中、実線は検体測定の結果、破線は複数回連続で検体を測定した後、糖化ヘモグロビン脱着用溶離液をカラムに通液して得られた結果を重ね描いた図である。図８ａは検体測定１回、図８ｂは検体測定２回、図８ｃは検体測定５回の結果を示している。 図８と同様。図９ａは検体測定１０回、図９ｂは検体測定２０回、図９ｃは検体測定５０回の結果を示している。 実施例３の測定結果を示した図である。横軸が連続して測定した回数の対数、縦軸が脱着時の糖化ヘモグロビンのピーク面積の対数である。

本発明の効果を明らかにするため、図４ａのシステムを構築し、検証を行った。

送液ポンプ（３）、試料注入機構（８）および６ポート２位置切り替えバルブ（９）を介して、分析カラム（１０）／可視光検出器（１１）を接続した。また、送液ポンプ（３）の上流側に切り替え弁（７）を配し、ＳＡ１ｃ吸着用溶離液（１）とＳＡ１ｃ脱着用溶離液（２）の選択ができるようにした。
６ポート２位置切り替えバルブ（９）は、２つの状態（流路）をとることが可能であり、第一の状態では、送液される溶離液が、可視光検出器、分析カラム、ドレインの順で流れ、第二の状態では、送液される溶離液が、分析カラム、可視光検出器、ドレインの順で流れる構成をとることができる。
いずれの構成機器も、全て東ソー（株）製の８０２０シリーズのＨＰＬＣを用い、分析カラムは、ｍ－アミノフェニルボロン酸をリガンドとしたＴＳＫｇｅｌ Ｂｏｒｏｎａｔｅ－５ＰＷ（東ソー（株）製、粒径１０μｍ）を内径４．６ｍｍ長さ１０ｍｍのカラム管に充填したものを使用した。

ＳＡ１ｃ吸着用溶離液（ｐＨ８．８）は、以下の組成で調整したものを使用した。
グリシン５０ｍＭ
塩化マグネシウム・６水和物５ｍＭ
塩化ナトリウム５０ｍＭ
ＳＡ１ｃ脱着用溶離液（ｐＨ８．８）は、以下の組成で調整したものを使用した。
グリシン５０ｍＭ
塩化ナトリウム５０ｍＭ
Ｄ－ソルビトール１００ｍＭ
その他の測定条件は以下の通りである。
カラム温度 ：４５℃
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：４１５ｎｍ（単波長）
検出器レスポンス ：０．１５ｓ
データ収集サンプリングピッチ：５０ｍｓ
試料注入機構（８）の洗浄液として、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計（ＨＬＣ－７２３シリーズ）専用の溶血／洗浄液を使用した。また、血液を検体として使用する場合は、前記の溶血／洗浄液にて溶血／希釈を行った。

（実施例１）
ＳＡ１ｃ吸着用溶離液のみで、連続した測定が可能か検証を行った。
検体として、以下の通り調製したキャリブレータ試料、コントロール試料を用いた。
凍結乾燥品のＡ１ｃキャリブレータ（東ソー（株）製）のＬｅｖｅｌ＿１（ＨｂＡ１ｃ ５．８７％［ＮＧＳＰ］）およびＬｅｖｅｌ＿２（ＨｂＡ１ｃ １０．８７％［ＮＧＳＰ］）を精製水１．３ｍＬに溶解して、室温下で３０分放置したもの
凍結乾燥品のＡ１ｃコントロール（東ソー（株）製）のＬｅｖｅｌ＿１（ＨｂＡ１ｃ ４．９±０．３％［ＮＧＳＰ］）およびＬｅｖｅｌ＿２（ＨｂＡ１ｃ ９．９±０．５％［ＮＧＳＰ］）を精製水０．５ｍＬ溶解で１次溶解した後、室温下で３０分放置し、さらに１次溶解したもの３０μＬに対して精製水０．５ｍＬを添加したもの
キャリブレータＬｅｖｅｌ＿１を連続で３回、キャリブレータＬｅｖｅｌ＿２を連続で３回測定した。また、同様にコントロールＬｅｖｅｌ＿１を連続で３回、続いてコントロールＬｅｖｅｌ＿２を連続で３回測定した。通液はＳＡ１ｃ吸着用溶離液のみを連続して送液を行った。
測定のシーケンスは、試料注入時から０．２５分まではバルブを第一の状態、０．２５分から２．８０分まではバルブを第二の状態とした。

図５はキャリブレータＬｅｖｅｌ＿１および２の３回の結果を重ね描いた図、同様に、図６はコントロールＬｅｖｅｌ＿１および２の３回の結果を重ね描いた図である。なお、図中の破線は溶血洗浄液を試料として注入した際のクロマトグラム、つまりベースラインの変動を示すバックグラウンドである。
図５、６のいずれも、０．１分付近に現れるシャープなピークは注入した試料全体の吸光度変化、０．４５分付近にブロードなピークとしてアフィニティカラム内を移動していた糖化ヘモグロビン以外の成分の吸光度変化が確認できる。

キャリブレータ試料の定量結果を表１に示す。

糖化ヘモグロビン（ＳＡ１ｃ）の面積は、ピーク１の面積とピーク２の面積の差分に相当するので、ＳＡ１ｃの面積％は、
｛（ピーク１ 面積）－（ピーク２ 面積）｝＊１００／（ピーク１ 面積）
で計算される。
ＳＡ１ｃ面積％（４）をＸ、基準値（５）をＹとして検量線を作成すると、その回帰式は
ｙ ＝ ０．７８７３ｘ － ４．６７１２
となった。

次に、コントロール試料の定量結果を表２に示す。なお、表中（６）列は、上記検量線によりＳＡ１ｃ％を算出した値である。

コントロールＬｅｖｅｌ＿１のＳＡ１ｃ％の平均は５．３％、コントロールＬｅｖｅｌ＿２は１０．４％となる結果が得られた。

（実施例２）
次に、従来のアフィニティ法と本発明の方法について、検体の濃度による影響について比較を行った。
送液ポンプ（３）の上流に配した切り替え弁（７）により、ＳＡ１ｃ吸着用溶離液（１）とＳＡ１ｃ脱着用溶離液（２）を切り替えるステップグラジエントを実施した。バルブは第二の状態に固定したため、分析カラム、可視光検出器、ドレインの順で流れるので、一般的なクロマトグラフィの流路をとることができる。
なお、測定のシーケンスは試料注入時から０．１５分まではＳＡ１ｃ吸着用溶離液を、０．１５分から０．６５分まではＳＡ１ｃ脱着用溶離液を流した。また、測定で得られたクロマトグラムから、溶血洗浄液を注入して得られたクロマトグラム（バックグラウンド）を差し引き、その差分クロマトグラムでピーク検出を行った。

全血を１／２５～１／１５０まで５種類の濃度に調整した試料を、本発明の方法と従来のアフィニティ法に供して、ＳＡ１ｃ面積％への影響を確認した。表３に本発明の方法による定量結果、表４に従来のアフィニティ法による定量結果を示す。なお、濃度範囲が広いため、濃度は対数とした。

従来のアフィニティ法では濃度が低くなるにつれて、ＳＡ１ｃ面積％が大きくなる傾向があるが、本発明の連続アフィニティ法では、濃度の影響が小さいことが分かる（図７参照）。
従来のアフィニティ法では２種の溶離液の切り替えによるバックグラウンドの変動があり、その変動分がＳＡ１ｃ面積に含まれることとなるが、本発明の方法では１種類の溶離液しか使用しないことから、バックグラウンドの変動はなく、検体濃度による影響を受けにくいからである。

（実施例３）
本発明の方法を連続で行っても、糖化ヘモグロビン成分が吸着されているか検証を行った。基本的な測定条件は実施例１と同様であり、糖化ヘモグロビン吸着用溶離液（１）を送液し、検体を複数回測定後、糖化ヘモグロビン脱着用溶離液（２）を送液し、吸着された成分の検出を行った。
測定は、検体をそれぞれ１回、２回、５回、１０回、２０回、５０回注入後、溶離液を切り替えた。なお、検体としては、コントロール試料（Ｌｅｖｅｌ＿１）を使用した。図８、９にその結果を示す。図中、実線は検体測定の結果（ｎ回測定結果の重ね描き）、破線は脱着時に得られた結果を示している。

検体測定時は、約０．１分付近にトータル量を示すシャープなピーク、約０．３分付近に糖化ヘモグロビン以外の成分量を示すブロードなピークが現れ、脱着時には、約１．６分付近に糖化ヘモグロビンの量を示すブロードなピークが現れ、当該ピークは測定回数が増えるごとに、ピーク強度が高くなっていることが分かる。
横軸に連続して測定した回数の対数、縦軸に脱着時の糖化ヘモグロビンのピーク面積の対数をプロットしたものを図１０に示す。注入回数と脱着時の糖化ヘモグロビンのピーク面積には直線関係が成り立っていることが見て取れ、定量的に糖化ヘモグロビン成分のみがアフィニティゲルに吸着されていることが分かる。

１ ＳＡ１ｃ吸着用溶離液
２ ＳＡ１ｃ脱着用溶離液
３、４ 送液ポンプ
５、６ 開閉弁
７ 切り替え弁
８ 試料注入機構
９ ６ポート２位置切り替えバルブ
１０ 分析カラム
１１ 可視光検出器
１２ カラムオーブン

Claims (3)

1. 溶離液を送液するための送液ポンプと、
   前記送液ポンプよりも下流に接続された試料注入機構と、
   糖化ヘモグロビンを特異的に吸着できるアフィニティゲルを充填した分析カラムと、
   可視光検出器と、
   切り替えバルブと、
   を備えた液体クロマトグラフ装置であって、
   前記切り替えバルブは、前記試料注入機構、前記可視光検出器、前記分析カラムの順で流体接続された第一の状態と、
   前記試料注入機構、前記分析カラム、前記可視光検出器の順で流体接続された第二の状態に切り替え可能であることを特徴とする前記装置。
2. 送液ポンプの上流に開閉弁又は切換え弁を備える、若しくは送液ポンプを２以上備えることにより２種以上の溶離液を送液可能とした請求項１に記載の装置。
3. 液体クロマトグラフ装置を用いた血液試料中の糖化ヘモグロビンの量を算出する方法であって、
   試料注入機構より前記血液試料を糖化ヘモグロビン吸着用溶離液で押し流し、可視光検出器にて血液の濃度変化を計測し、
   計測後の前記血液試料を、糖化ヘモグロビンを特異的に吸着できるアフィニティゲルを充填した分析カラムに導いた後、糖化ヘモグロビン以外の成分の濃度変化を前記可視光検出器で計測し、
   血液の濃度変化の量と、糖化ヘモグロビン以外の成分の濃度変化の量との差から糖化ヘモグロビンの量を算出する方法。

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