JP7517124B2 - アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 - Google Patents
アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7517124B2 JP7517124B2 JP2020203208A JP2020203208A JP7517124B2 JP 7517124 B2 JP7517124 B2 JP 7517124B2 JP 2020203208 A JP2020203208 A JP 2020203208A JP 2020203208 A JP2020203208 A JP 2020203208A JP 7517124 B2 JP7517124 B2 JP 7517124B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycated hemoglobin
- calibration curve
- coefficient
- sample
- calculating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 title claims description 86
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 title claims description 83
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 title claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 title claims description 15
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 65
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 18
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108010044267 Abnormal Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101100382321 Caenorhabditis elegans cal-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
Description
本発明は、アフィニティを基にしたクロマトグラフィで糖化ヘモグロビンを測定する方法において、1種類の標準品により既知の検量線を補正し、糖化ヘモグロビン含有量を計算する方法及び分析装置に関するものである。
糖尿病の判断基準の指標として、血液中の糖化ヘモグロビン(以降、簡易的にA1cと記することがある)の割合を基に診断することが多い。A1c%の測定法として、測定原理の異なる複数の測定法が用いられる。その代表的な手法は、液体クロマトグラフィによるものである。液体クロマトグラフィ法でも、分離モードの違いによりイオン交換法クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法がある。いずれの方法でも、塩濃度や組成の異なる複数のバッファを切替えて(ステップグラジエント)、目的である糖化ヘモグロビンを分離し、A1cの全体の占める割合からA1c%を算出するものである。ステップグラジエントは、事前に設定された各バッファの溶出容量に関するタイムテーブルに従い、バッファの切替えが実施される。
一般的に、イオン交換法クロマトグラフィ法では電荷の違いにより糖化ヘモグロビンA1cを他の複数成分と分離し、A1cの面積比率算出するものである。一方、アフィニティクロマトグラフィ法では糖化されたヘモグロビンと非糖化のヘモグロビン(以降、簡易的にA0と記することがある)を分離し、糖化ヘモグロビンの面積比率から算出するものである。
そのため、イオン交換法クロマトグラフィ法では異常ヘモグロビン種の検体では、電荷の値が異なるため、正確に糖化されたヘモグロビンの量を算出できないことがあるとされる。また、検体中に含まれる共存物質影響も受けやすいとされている。
一方、アフィニティクロマトグラフィ法では、糖化/非糖化で分離するため、前記のような影響を受けにくいとされている。何れの分離法においても、全ピーク面積に対してのA1cピーク面積の比率から、実際のA1c%を算出する。その際には、A1c%の異なる最低2種類(高値、低値)の標準試料(キャリブレータ)を用いてたてられた検量線から、検体のA1c%を算出することになる。検量線は必要に応じて更新する必要があり、より、頻繁に更新した方が正確なA1c%の算出が可能となる。しかしながら、この作業は凍結乾燥状態の標準試料の調製等、手間のかかる作業であり、また、最低2濃度以上の標準試料を用いることからランニングコストの上昇にもつながる。
本発明の目的は、前述課題を解決するためになされたものであり、日常的な検量線作成時には、1種類の標準試料の測定のみで行うことができ、検体のA1c%を算出できる方法を提供するものである。
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
第一の溶離液により糖化ヘモグロビンを特異的に吸着させ、非糖化ヘモグロビンを溶出させ、一定時間経過後、第二の溶離液により前記吸着された糖化ヘモグロビンを溶出させるアフィニティクロマトグラフィにおいて、
糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要なマスターカーブを作成する第一の工程と、日常的に、糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要な検量線を作成する第二の工程と、実際の検体を測定し、糖化ヘモグロビン含有割合を算出する第三の工程からなり、
前記第一の工程では、
糖化ヘモグロビン含有割合が既知の2種類以上の1次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、前記糖化ヘモグロビン含有割合との、1次式の検量線を作成し、前記検量線の係数a(傾き)および係数b(切片)算出および記憶し、前記1次標準試料とは異なる1種類の2次標準試料を測定し、全面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を、前記検量線を用いて糖化ヘモグロビン含有割合を算出および記憶し、
前記第二の工程では、
第一の工程で用いた1種類の2次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、第一の工程で得られた前記係数bと、第一の工程で得られた前記2次標準試料糖化ヘモグロビン含有割合から、現時点での係数aを算出し、前記係数aと第一の工程で得られた前記係数bとからなる、新たな検量線(y=ax+b)を作成し、
第三の工程では、
実際の検体を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を第二の工程で作成された検量線を用いて、糖化ヘモグロビン含有割合を算出、
することからなる、糖化ヘモグロビン分析方法である。
第一の溶離液により糖化ヘモグロビンを特異的に吸着させ、非糖化ヘモグロビンを溶出させ、一定時間経過後、第二の溶離液により前記吸着された糖化ヘモグロビンを溶出させるアフィニティクロマトグラフィにおいて、
糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要なマスターカーブを作成する第一の工程と、日常的に、糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要な検量線を作成する第二の工程と、実際の検体を測定し、糖化ヘモグロビン含有割合を算出する第三の工程からなり、
前記第一の工程では、
糖化ヘモグロビン含有割合が既知の2種類以上の1次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、前記糖化ヘモグロビン含有割合との、1次式の検量線を作成し、前記検量線の係数a(傾き)および係数b(切片)算出および記憶し、前記1次標準試料とは異なる1種類の2次標準試料を測定し、全面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を、前記検量線を用いて糖化ヘモグロビン含有割合を算出および記憶し、
前記第二の工程では、
第一の工程で用いた1種類の2次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、第一の工程で得られた前記係数bと、第一の工程で得られた前記2次標準試料糖化ヘモグロビン含有割合から、現時点での係数aを算出し、前記係数aと第一の工程で得られた前記係数bとからなる、新たな検量線(y=ax+b)を作成し、
第三の工程では、
実際の検体を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を第二の工程で作成された検量線を用いて、糖化ヘモグロビン含有割合を算出、
することからなる、糖化ヘモグロビン分析方法である。
アフィニティクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビン分析においては、糖化ヘモグロビンを吸着させる第一のバッファと、前記吸着された糖化ヘモグロビンを脱着させる第二のバッファにより、非糖化ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを分離する方法である。
非糖化ヘモグロビンは、第一のバッファではカラムにほとんど保持されないため、ほぼボイドの位置に溶出する。一方、糖化ヘモグロビンは第二のバッファにて即座に脱着するため、第二のバッファに切り替えた直後に溶出する。
一般的なクロマトグラフィでは、僅かなバッファの組成が変動したり、カラムの劣化等が生じた場合、溶出時間の変動につながる。しかしながら、2種のバッファを切り替えるステップグラジエントによる、アフィニティクロマトグラフィ/糖化ヘモグロビン分析においては、非糖化ヘモグロビン、糖化ヘモグロビンのピークの溶出時間への影響は少なく、ほぼ同じ時間に溶出する。症状としては、非糖化ヘモグロビンピークのテーリング状態が変動することが多い(図1参照)。
そのため、初期の状態では、非糖化ヘモグロビンピークと糖化ヘモグロビンピークは完全に分離できていても、次第に、非糖化ヘモグロビンピークのテーリングの度合いが大きくなり、両ピークの分離が不十分となり、その結果、各ピークの面積値に変動が生じることとなる(図2参照)。これらのことから、一定期間ごとに検量線を再取得しないと、正確な測定結果を得ることができなくなる。検量線作成には、A1c%が既知である2種以上の標準試料(キャリブレータ)を用いて検量線を取得する。通常、A1c%が5%程度の標準試料(低値)、A1c%が10%程度の標準試料(高値)の2種を使用することが一般的である。これらの標準試料をそれぞれ測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビン(A1c)ピークの面積比率を算出する。前記で得られたA1c面積%を横軸(x)、値付けされた標準試料のA1c%を縦軸(y)にとり、一次式(y=ax+b)を作成し検量線とする。
実際の検体を測定し、A1c面積%をxとして、糖化ヘモグロビン比率(A1c%)yを算出する(図3参照)。また、定期的に2次標準試料(コントロール)を同様に測定し、測定結果の精度管理に用いることもされている。これらの検量線作成の操作は、時間と手間を要する作業であり、また、使用するキャリブレータも高価であることから、できるだけ、同じ検量線を長期間、使用できることが望まれる。
本願発明者は、鋭意検討を重ねた結果、アフィニティクロマトグラフィにより糖化ヘモグロビンの測定系においては、極端に条件が変化しない限り、検量線(y=ax+b)の係数a、bの内、係数aの変動が大きく、係数bはほぼ一定であることを見出した。従って、カラム等が初期状態(分離が良好な状態)で従来の手法により少なくとの2種類以上のA1c%が既知である標準試料により検量線(y=ax+b)を作成すれば、以降、日常的には、1種類のA1c%が既知である2次標準の測定のみで、検量線係数aを算出でき、係数bは前記の初期の値を用いることで、補正検量線を取得できることを見出した。日常的には高価であるキャリブレータを使用しないことから、ランニングコストの大幅な削減に寄与し、また、作業の効率化に寄与する手法を提供するものである。
詳細な手順を以下に示す。大まかな流れを図4に示す。本発明は、マスターカーブを取得する第一の工程、A1c%が既知である1種類の2次標準試料を測定し、検量線を補正する第二の工程、実検体を測定し、クロマトグラムの面積%からA1c%を算出するする第三の工程からなる。
まず、マスターカーブを取得する第一の工程について説明する。図5は第一の工程を更に詳細に示したフロー図である。A1c%が既知であり値の異なる2つのキャリブレータ(一般的にはA1c%が5%程度の低値検体と10%程度の高値検体)を測定し、得られたクロマトグラムのA1c面積%を計算する。前記A1c面積%をx、値付けされたA1c%をyとし、検量線(1次式 y=ax+b)の係数a、bを取得する。また、前記キャリブレータとは異なるA1c%が既知の1種類の2次標準試料を測定し、前記検量線によりA1c%を算出する。前記2次標準試料はA1c%が既知の試料であればよく、特に限定されるものではない。しかしながら、健常人検体でのA1c%に近い標準試料または、検量線作成に使用する2種のキャリブレータの中間的なA1c%の標準試料を用いることが好適である。ここで得られた、検量線の係数a、bおよび2次標準試料のA1c%がマスターカーブを構成する。この工程はカラムの劣化が極端に進行しないかぎり再取得を行う必要はない。
工程2以降は、日常的に操作する工程となる。第二の工程では、マスターカーブを作成した際に用いたA1c%が既知である1種類の2次標準試料のみを測定し、その時点での検量線を作成する工程である。得られたクロマトグラムから、A1cピークの面積%を算出し、第一の工程で得られたマスターカーブを用いて検量線を補正する。
第三の工程では、実際の検体を測定する。得られた検体のクロマトグラムからA1cピークの面積%を算出し、前記工程で得られた検量線からA1c%を導き出す。
第二の工程の補正方法を分かりやすくするために、三角波の組み合わせによる疑似クロマトグラムを用いて説明する。
非糖化ヘモグロビンを模した0.2分に頂点がある大きな三角波と、糖化ヘモグロビンを模した0.45分に頂点がある小さな三角波を合成し、糖化ヘモグロビン分離パターンとする。2種のキャリブレータを表現するために、糖化ヘモグロビン面積%が5.62%、11.59%となるように、強度を合わせている。
アフィニティクロマトグラフィによるヘモグロビン分離では、第一の溶離液にて非糖化ヘモグロビンの分画はほとんど保持されず、ボイドの位置に溶出する。糖化ヘモグロビンの分画は第二の溶離液にて溶出する。そのため、アフィニティクロマトグラフィによるヘモグロビン分離では、カラムの劣化等が進んでも、各分画の溶出時間はほとんど変わらず、非糖化ヘモグロビンピークの形状が変化する傾向がある。つまり、非糖化ヘモグロビンピークが徐々にテーリングがひどくなり、非糖化ヘモグロビンピークと糖化ヘモグロビンピークの分離が変化していく。この状態を表現するため、両者の三角波のピーク面積を一定にして、非糖化ヘモグロビンピークのテーリング度合いを変化させた8パターンの三角波合成波形を作成した。図6は8パターンの三角波合成波形を個別に表示した図である。図8の左図は低値、右図は高値の標準試料を模した波形である。ここから分かるように、非糖化ヘモグロビンのピークのテーリングがひどくなると、糖化ヘモグロビンのピークとの分離が悪くなり、正確に各ピークの面積が算出できなくなることが分かる。表1は低値、表2は高値検体を模した波形の各ピークの面積、面積の増減(#1を基準)、およびピーク2(A1cを模した)の面積%を計算した表である。このように、ピーク1(A0を模した)のテーリングが少なく、完全に分離されている状態では、前記面積に関する値に変化はないが、テーリングの進行とともに差が出てくる。低値検体を模した波形では#6以降で、高値検体を模した波形では#5以降で真の面積との差が出てくる。ピーク1(A0を模した)は真の面積より小さくなり、ピーク2(A1cを模した)は大きくなる傾向にあり、その結果、ピーク2の面積%(A1c面積%)は真の値より大きくなっていく。
次に、低値を模した波形のA1c%(ピーク2%)を6.0%、高値を模した波形のA1c%(ピーク2%)を12.0%と仮定し、各状態での検量線を作成した(図9参照)。横軸(x)はA1cピーク(ピーク2)面積%、縦軸(y)は前記で仮定したA1c%を示している。表3は、各セットで計算された検量線(y=ax+b)の係数を示した表である。
図9から分かるように、非糖化ヘモグロビンピークのテーリング状態により検量線が変化していくことがわかる。ただし、極端にテーリングしない限り、検量線の係数b、つまり切片はほとんど変化せず、検量線の係数a、つまり傾きのみの差が大きいことが分かる。この場合、#1~7の範囲では、係数aの寄与が大きいと判断できる。
このことから、工程1で得られた検量線の係数a、bのうち、日常的には係数aのみを決定すれば、その時点での検量線を取得できることとなる。係数aを算出するには、下記式で求めることができる。
このことから、工程1で得られた検量線の係数a、bのうち、日常的には係数aのみを決定すれば、その時点での検量線を取得できることとなる。係数aを算出するには、下記式で求めることができる。
yは工程1で得られた2次標準試料のA1c%、xはその時点(工程2)で得られた2次標準試料のA1c面積%ととなる。係数bは工程1で得られた係数bをそのまま用いれば良い。ここでは、工程1で算出された2次標準試料のA1c%が「10.0」と仮定した場合の計算結果を示す。図10は本発明の補正の流れを模式的に示した図である。また、図11は検量線補正の効果を示した図である。図中、凡例●は初回の検量線でA1c%を算出した結果、凡例〇は各セット毎に得られた検量線にて2次標準試料のA1c%を算出した結果、凡例△は本発明の補正方法で取得した検量線にてA1c%を算出した結果を示している。ここから分かるように、初回の検量線でA1c%を算出した場合、非糖化ヘモグロビンのテーリングがひどくなるにつれて、A1c%が上昇していく。一方本発明の補正方法で取得した検量線にてA1c%を算出した場合は、#1~7では、ほぼ一定の値を得ることができている。
本発明により、日常的な検量線作成時には、1種類の標準試料の測定のみで行うことができ、検体のA1c%を算出できることが可能となる。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。図12に本検証で使用したシステム構成を示す。
(実施例1)
検証には、東ソー(株)製グリコヘモグロビン分析計HLC-723GXを使用した。本装置はイオン交換クロマトグラフィを用いた測定装置であるが、設定、バッファ種等を変更し、アフィニティクロマトグラフィで使用できるように改造して使用した。その他の測定条件は下表(右欄)の通りである。
検証には、東ソー(株)製グリコヘモグロビン分析計HLC-723GXを使用した。本装置はイオン交換クロマトグラフィを用いた測定装置であるが、設定、バッファ種等を変更し、アフィニティクロマトグラフィで使用できるように改造して使用した。その他の測定条件は下表(右欄)の通りである。
検体として、東ソー(株)製のキャリブレータ(Cal_1:HbA1c 5.85%[NGSP]、Cal_2:HbA1c 11.02%[NGSP]))を使用した。使用する際は、同取扱説明書の手順で溶解・希釈して用いた。併せて、実際の血液検体も使用した。使用する際は、東ソー(株)製グリコヘモグロビン分析計(HLC-723GX)専用の溶血/洗浄液にて溶解・希釈して用いた。分離は、検体注入から0.55分までバッファ1、0.55分~1.25分までバッファ2が流れるステップグラジエントを実施し、アフィニティでの分離を行った(2.2分サイクル)。図13はアフィニティクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビンの分離を模式的に示し、図14に典型的なクロマトグラムを示す。図から分かるように、非糖化ヘモグロビンは試料注入後、カラムに保持されず、ほぼボイドの時間に溶出する。一方、糖化ヘモグロビンはバッファ2により即座に溶出する。図15は、1日に100~150件程度、連続8日間、連続して実検体(全血を希釈)を測定した場合のクロマトグラムの変化を示した図である(一部抜粋)。ここから分かるように、糖化ヘモグロビンピークは、経時変化の影響を受けにくく、非糖化ヘモグロビンピークは、徐々にピーク形状が変化していく。
本発明の効果を検証するために、A1c%が既知のキャリブレータ低値/高値標準試料を測定しその測定結果から、検量線を作成する。次に2次標準試料であるコントロールを3回測定、更に実検体を100~150回程度測定することを1セットとし、8セット測定を行った。
表8~10に各セットで得られた結果を示す。なお、キャリブレータおよびコントロールはその平均値、実検体は、最初の10測定の平均値を記載してある。
表8は、各測定で得られたA1cピークの面積%、表9は、各セットのキャリブレータによる検量線(y=ax+b)の各係数を示している。また、図16、表10は、各セットで算出した検量線からA1c%を計算した結果を示している。なお、表1はキャリブレータ及びコントロールの基準値(取扱説明書記載の値)、実検体はラテックス凝集免疫比濁法であるA1cGear((株)三和化学研究所製)で得られたA1c%を記載してある(各基準値は表7参照)。
まず、ここから、100~150検体測定ごとに、検量線を更新することで、正確にA1c%を算出できることがわかる。低値コントロールは4.82~5.09%の範囲、高値コントロールは9.29~9.80%の範囲、実検体は5.51~5.82%の範囲で一定の値を得ることができる。
しかしながら、初回の検量線、
y=0.98490×x+1.88148(y:A1c%、x:A1c面積%)
を、#1~#8の測定結果に適用した場合は、低値コントロールは4.91~6.54%、高値コントロールは9.29~13.10%、実検体は5.64~7.45%と大きく変動し、実際の検査に用いることは不可能な状態となる。100~150検体測定ごとに検量線を更新する必要があることが分かる(表11参照)。
y=0.98490×x+1.88148(y:A1c%、x:A1c面積%)
を、#1~#8の測定結果に適用した場合は、低値コントロールは4.91~6.54%、高値コントロールは9.29~13.10%、実検体は5.64~7.45%と大きく変動し、実際の検査に用いることは不可能な状態となる。100~150検体測定ごとに検量線を更新する必要があることが分かる(表11参照)。
さらに、検量線を立てるのに用いるキャリブレータ(低値/高値)は高価であり、検査コストの上昇にもつながる。また、この操作も煩雑であり、作業性を悪くすることにつながる。
本発明の手法は、前記課題を解決するためになされたものである。分析カラムを交換したり、測定システムをメンテナンスした時など、変動要素が大きい時にのみキャリブレータ(低値/高値)により検量線を立て、日常的には1種類の2次標準試料のみを測定し、検量線を補正するものである。表9、図16から分かるように、測定状態が大きく変わらない範囲では、各セットでの検量線(y=ax+b)の係数の変動は、係数aの寄与が大きく、係数bの寄与は少ない。つまり、各測定セットで、検量線係数bは固定値とし、検量線計数aのみを算出すれば、検量線を策定できることを意味している。検量線の算出過程を以下に説明する。
第一の工程として、分析カラム等の初期状態で、通常の手順で少なくとも2種以上のA1c%が既知のキャリブレータ試料を測定し、得られたクロマトグラムからA1cピークの面積%を算出し、各キャリブレータA1c%との検量線(y=ax+b)を作成する。次に、1種類の2次標準試料を測定し、得られたクロマトグラムからA1cピークの面積%を算出し、前記検量線(y=ax+b)からA1c%を算出する。
以降は、通常の検体の測定を順次行い、前記検量線からA1c%を算出する。一定期間経過、検量線の更新時期になった場合、以下のようにして検量線を更新する。前記で使用した2次標準試料(1種類)を測定し、得られたクロマトグラムからA1cピーク面積%を算出する。下式は初期状態での検量線(y=ax+b)である。
本式において、係数bは固定値であるため、係数aの部分を算出すれば良いこととなる。
2次標準試料のA1c%は同じであることから、yの値は初期状態で得られた2次標準試料のA1c%となる。また、xはこの時点で得られたA1c面積%に当たる。つまり、以下の関係となり、この時点での係数aの値が算出できる。
(初期状態のA1c%)=a×(この時点のA1c面積%)+1.88148
a=〔(初期状態のA1c%)-1.88148〕/(この時点のA1c面積%)
ここでは、2次標準試料として低値コントロールまたは、高値コントロールを用いて検証を行った。まず、2次標準試料として低値コントロールを使用した結果を示す。
セット#2を例に計算過程を示す。
初期状態での低値コントロールのA1c%は4.91%(表10参照)
セット#2で得られた低値コントロールのA1c面積%は3.36%(表8参照)
a=(4.9125-1.88148)/3.36380
となる。つまり、この時点での検量線(y=ax+b)は以下となる。
y=0.90108×x+1.88148
同様にセット3では、
a=(4.9125-1.88148)/3.38181=0.89628
セット4では、
a=(4.9125-1.88148)/3.98724=0.76019
セット5では、
a=(4.9125-1.88148)/3.91800=0.77327
セット6では、
a=(4.9125-1.88148)/4.22723=0.71703
セット7では、
a=(4.9125-1.88148)/4.66595=0.64961
セット8では、
a=(4.9125-1.88148)/4.73190=0.64056
このようにして得られた各セットでの検量線(y=ax+b)を用いて、各セットでの低値コントロール、高値コントロールおよび実検体のA1c%を算出すると表13にようになる。
2次標準試料のA1c%は同じであることから、yの値は初期状態で得られた2次標準試料のA1c%となる。また、xはこの時点で得られたA1c面積%に当たる。つまり、以下の関係となり、この時点での係数aの値が算出できる。
(初期状態のA1c%)=a×(この時点のA1c面積%)+1.88148
a=〔(初期状態のA1c%)-1.88148〕/(この時点のA1c面積%)
ここでは、2次標準試料として低値コントロールまたは、高値コントロールを用いて検証を行った。まず、2次標準試料として低値コントロールを使用した結果を示す。
セット#2を例に計算過程を示す。
初期状態での低値コントロールのA1c%は4.91%(表10参照)
セット#2で得られた低値コントロールのA1c面積%は3.36%(表8参照)
a=(4.9125-1.88148)/3.36380
となる。つまり、この時点での検量線(y=ax+b)は以下となる。
y=0.90108×x+1.88148
同様にセット3では、
a=(4.9125-1.88148)/3.38181=0.89628
セット4では、
a=(4.9125-1.88148)/3.98724=0.76019
セット5では、
a=(4.9125-1.88148)/3.91800=0.77327
セット6では、
a=(4.9125-1.88148)/4.22723=0.71703
セット7では、
a=(4.9125-1.88148)/4.66595=0.64961
セット8では、
a=(4.9125-1.88148)/4.73190=0.64056
このようにして得られた各セットでの検量線(y=ax+b)を用いて、各セットでの低値コントロール、高値コントロールおよび実検体のA1c%を算出すると表13にようになる。
同様に、2次標準試料として高値コントロールを使用した検証も実施した。計算過程は省略するが、各セットでの検量線係数は表14のように算出され、それを基にしたA1c%は表15のように算出された。
このように、低値のコントロールを基準試料として採用した場合、8日間(100~150検体測定/1日)と言う長期間の測定においても、実検体のA1c%は5.50~5.65%の範囲に収めることが可能となった。高値のコントロールを基準試料として採用した場合でも、5.51~5.72%の範囲に収めることが可能となった。
以上説明したように、本発明の方法により、日常の測定操作においては、1種類の2次標準試料を測定するのみで、検量性を取得することが可能となった。前記2次標準試料は公的機関等によりA1c%が値付けされているものを使用することが好適であるが、A1c%の値が一定である試料であれば良く、同じ効果が得られ、試料が限定されるものではない。
1.バッファ1
2.バッファ2
3.脱気装置
4.バッファ1 開閉機構
5.バッファ2 開閉機構
6.送液ポンプ
7.試料注入機構
8.ラインフィルタ
9.プレヒートコイル
10.分析カラム
11.恒温槽
12.可視光検出器
2.バッファ2
3.脱気装置
4.バッファ1 開閉機構
5.バッファ2 開閉機構
6.送液ポンプ
7.試料注入機構
8.ラインフィルタ
9.プレヒートコイル
10.分析カラム
11.恒温槽
12.可視光検出器
Claims (2)
- 第一の溶離液により糖化ヘモグロビンを特異的に吸着させ、非糖化ヘモグロビンを溶出させ、一定時間経過後、第二の溶離液により前記吸着された糖化ヘモグロビンを溶出させるアフィニティクロマトグラフィにおいて、
糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要なマスターカーブを作成する第一の工程と、日常的に、糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要な検量線を作成する第二の工程と、実際の検体を測定し、糖化ヘモグロビン含有割合を算出する第三の工程からなり、
前記第一の工程では、
糖化ヘモグロビン含有割合が既知の2種類以上の1次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、前記糖化ヘモグロビン含有割合との、1次式の検量線を作成し、前記検量線の係数a(傾き)および係数b(切片)を算出および記憶し、前記1次標準試料とは異なる1種類の2次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を、前記検量線を用いて糖化ヘモグロビン含有割合を算出および記憶し、
前記第二の工程では、
第一の工程で用いた1種類の2次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、第一の工程で得られた前記係数bと、第一の工程で得られた前記2次標準試料糖化ヘモグロビン含有割合から、現時点での係数aを算出し、前記係数aと第一の工程で得られた前記係数bとからなる、新たな検量線(y=ax+b)を作成し、
第三の工程では、
実際の検体を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を第二の工程で作成された検量線を用いて、糖化ヘモグロビン含有割合を算出することからなる、糖化ヘモグロビン分析方法。 - 請求項1に記載の方法により糖化ヘモグロビン含有割合を算出する、糖化ヘモグロビン分析装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2020203208A JP7517124B2 (ja) | 2020-12-08 | アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2020203208A JP7517124B2 (ja) | 2020-12-08 | アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022090732A JP2022090732A (ja) | 2022-06-20 |
JP7517124B2 true JP7517124B2 (ja) | 2024-07-17 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012108118A (ja) | 2010-10-28 | 2012-06-07 | Arkray Inc | ヘモグロビンA1c測定における校正方法 |
JP2013195139A (ja) | 2012-03-16 | 2013-09-30 | Arkray Inc | 分析装置、分析プログラム及び分析方法 |
JP2015021931A (ja) | 2013-07-23 | 2015-02-02 | 東ソー株式会社 | 検体の注入状態を判定する方法 |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012108118A (ja) | 2010-10-28 | 2012-06-07 | Arkray Inc | ヘモグロビンA1c測定における校正方法 |
JP2013195139A (ja) | 2012-03-16 | 2013-09-30 | Arkray Inc | 分析装置、分析プログラム及び分析方法 |
JP2015021931A (ja) | 2013-07-23 | 2015-02-02 | 東ソー株式会社 | 検体の注入状態を判定する方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yuan et al. | Proteomics analysis of human cerebrospinal fluid | |
Puchades et al. | Proteomic studies of potential cerebrospinal fluid protein markers for Alzheimer's disease | |
DE4139683C2 (de) | Flüssig-Chromatographiesystem und entsprechendes Betriebsverfahren | |
US7432108B2 (en) | Computerized method and apparatus for analyzing amino acids | |
Fierabracci et al. | Application of amino acid analysis by high-performance liquid chromatography with phenyl isothiocyanate derivatization to the rapid determination of free amino acids in biological samples | |
US8789405B2 (en) | Calibration method in measurement of hemoglobin A1c | |
EP2057472B1 (en) | Method of detecting and/ or measuring hepcidin in a sample | |
McLemore et al. | Rapid automated determination of lipid hydroperoxide concentrations and total antioxidant status of serum samples from patients infected with HIV: elevated lipid hydroperoxide concentrations and depleted total antioxidant capacity of serum samples | |
López‐Villar et al. | A proteomic approach to obesity and type 2 diabetes | |
März et al. | Fast lipoprotein chromatography: new method of analysis for plasma lipoproteins | |
Zhang | Proteomics of human cerebrospinal fluid–the good, the bad, and the ugly | |
Biroccio et al. | A quantitative method for the analysis of glycated and glutathionylated hemoglobin by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry | |
del Castillo et al. | Quantitative targeted biomarker assay for glycated haemoglobin by multidimensional LC using mass spectrometric detection | |
JP7517124B2 (ja) | アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 | |
Ziegler et al. | Increased erythrocyte aggregation in insulin-dependent diabetes mellitus and its relationship to plasma factors: a multivariate analysis | |
del Castillo Busto et al. | Stable isotope labelling and FPLC–ICP-SFMS for the accurate determination of clinical iron status parameters in human serum | |
JP2022090732A (ja) | アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 | |
JP7517123B2 (ja) | アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 | |
JP2022090731A (ja) | アフィニティクロマトグラフィにおける1点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置 | |
Hammes et al. | Impaired agglutination of IgM resulting from non-enzymatic glycation in diabetes mellitus | |
JPS5872055A (ja) | 血中ヘモグロビンa↓1の簡易測定法 | |
CN115372486A (zh) | 糖化血红蛋白检测试剂盒及其应用 | |
JP7081385B2 (ja) | クロマトグラムの類似度の計算方法 | |
Higuchi et al. | Accumulation of pro-apolipoprotein A-II in mouse senile amyloid fibrils | |
Pawlowski et al. | Assessing the iron delivery efficacy of transferrin in clinical samples by native electrospray ionization mass spectrometry |