DE60022751T2 - Mittel zur stabilisierung von hämoglobinen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung von Hämoglobin und eine Zusammensetzung, welche dasselbe enthält.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Hämoglobin ist ein Häm-Protein, das in einer roten Blutzelle existiert, welches aus einem Tetramer aufgebaut ist, das aus 2 Paaren von Polypeptidketten besteht (jede Kette ist an ein Mol Häm gebunden), die als α- und β-Ketten bezeichnet werden und ein Molekulargewicht von 65.000 Dalton besitzen. Das Hämoglobin ist im Blut in einer Menge von 16 bis 18 g/dl bei Männern, sowie in einer Menge von 14 bis 16 g/dl bei Frauen enthalten, und spielt eine Rolle beim Transport von Sauerstoff, indem Sauerstoff an das Eisenmolekül reversibel gebunden und losgelöst wird.
  • Wegen der Aufrechterhaltung eines solchen Normalfalls ist die Messung des Hämoglobins eine der grundlegenden Messgrößen in einem klinischen Labortest, und er wird verwendet zur Diagnose von Anämie, das heißt, Eisenmangel-Anämie, hypoplastische Anämie, hämolytische Anämie und dergleichen, in Verbindung mit der Anzahl der roten Blutkörperchen und dem Hämatokrit-Wert. Die Messung besitzt aufgrund des kürzlich erfolgten Nachweises einer äußerst geringen Menge von Hämoglobin im Stuhl einen Vorsprung bei der Bestimmung für die Diagnose von Darmkrebs.
  • Andererseits wird ein glycosyliertes Hämoglobin durch eine nicht-enzymatische Reaktion zwischen Hämoglobin und Glucose hergestellt. Eine Messung des glycosylierten Hämoglobins im Blut findet ihren Niederschlag in einer Kontrolle der Blutzuckerkonzentration in den letzten drei oder vier Wochen, und sie ist wirksam verfügbar als ein Hinweis auf die Konzentration des Blutzuckers über einen langen Zeitraum, der nicht von den täglichen Mahlzeiten beeinflusst wird. In der vorliegenden Beschreibung wird nachfolgend der Ausdruck "Hämoglobin" so verwendet, dass er insgesamt Hämoglobin und glycosyliertes Hämoglobin umfasst.
  • Derzeit erfolgt die Messung des Hämoglobins im klinischen Labor mittels eines HPLC-Verfahrens, eines immunologischen Verfahrens, eines Affinitäts-Verfahrens, eines Elektrophorese-Verfahrens, eines Verfahrens zur isoelektrischen Fraktionierung, eines Verfahrens unter Verwendung von TBA (2-Thiobarbitursäure), eines RIA-Verfahrens (Radio Immuno Assay), eines Photsäureverfahrens (photic acid method), eines Verfahrens unter Bestimmung von Furosin, und dergleichen statt.
  • Bei der Messung des vorstehenden Hämoglobins ist eine Substanz erforderlich, welche ein Standard- und Kontroll-Material sein kann. Jedoch sind die Hämoglobine instabil und verlieren ihre Funktion, Sauerstoff zu binden, und das Häm-Eisen verändert sich von Fe2+ zu Fe3+ durch Oxidation, und es verändert sich in der Farbe von einem hellen Rot zu dunklem Braun. Darüber hinaus ist Hämoglobin dafür bekannt, dass es zu Methämoglobin oxidiert wird, auch durch dessen Exposition gegenüber Luft sowie durch Lyophilisation.
  • Als ein Verfahren zur Verhinderung einer solchen Oxidation existiert ein Verfahren, bei dem an einer Stelle, an welcher der Sauerstoff gebunden werden soll, zwei Mol Atome, wie zum Beispiel CO, NO, CN etc., welche nahezu denselben Durchmesser wie Sauerstoff haben, vorher gebunden werden, oder ein Verfah ren zur Zugabe von Natriumazid während des Lyophilisationsschrittes. Diese Verfahren besitzen jedoch den Nachteil, dass die Verfahrensschritte mühsam sind; eines der Verfahren liefert in bezeichnender Weise eine unzulängliche, niedrige Menge, oder ein anderes ist von unmöglicher Durchführbarkeit. Abgesehen davon tritt ein Entsorgungsproblem bei Natriumazid aufgrund der Giftigkeit auf. Obwohl darüber hinaus auch ein Verfahren zur Zugabe einer stickstoffhaltigen Verbindung in der Veröffentlichung (offengelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. Sho 60-35270) offenbart wurde, ist lediglich eine Wirkung zur Verhinderung der Abtrennung der freien Eisen-Form aus Hämoglobin offenbart. Ein Verfahren zur Zugabe von Glucose und Aminosäuren (offengelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. Sho 61-1620) offenbart ein Schutzmittel für die Oxidation von Hämoglobin zu Methämoglobin, eine Aufgabe des Verfahrens ist es jedoch, das Hämoglobin als Hämoglobin zu stabilisieren, welches als ein Blutersatzstoff mit einer Konzentration im Bereich von mg/ml verwendet wird. Somit sind diese Verfahren zur Stabilisierung von Hämoglobin mit einer Konzentration im Bereich von ng bis μg/ml nicht akzeptabel, welche im klinischen Labortest als ein Standard- oder Kontroll-Material erforderlich ist. Ein anderes Verfahren zur Stabilisierung von Hämoglobin durch Zugabe von Aminosäuren und Albumin wurde veröffentlicht (offengelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 8-245421), jedoch ist dieses Verfahren in einer Zusammensetzung des Mittels beschränkt, da dieses Verfahren die Verwendung von Albumin anstelle einer Aminosäure erfordert.
  • Wie vorstehend diskutiert, ist das herkömmliche Verfahren zur Stabilisierung von Hämoglobin nicht als ein Verfahren zur Stabilisierung von Kontroll-Material und Standard-Material geeignet, welche für die genaue Messung von Hämoglobin in einem klinischen Labortest erforderlich sind. Dementsprechend wird das Verfahren zur Stabilisierung von Kontroll-Material und Standard-Material, welches Hämoglobin enthält, sehnlichst auf dem Gebiet des pharmazeutischen und des klinischen Labortests gewünscht.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Als das Ergebnis einer Studie zur Stabilisierung des Kontroll-Materials und des Standard-Materials haben die vorliegenden Erfinder gefunden, dass die Stabilität des Hämoglobins durch Zugabe von Schwefel enthaltendem Material verbessert werden kann, insbesondere durch eine Verbindung mit SH-Gruppen, wobei die Schwefel enthaltende Verbindung in einer Menge von 0,01 bis 0,000.01 Gewichtsteilen auf 1 Gewichtsteil des Hämoglobins zugegeben wird, und bewerkstelligten damit die vorliegende Erfindung.
  • Das heißt, einer der wesentlichen Punkte der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein stabilisierendes Mittel für Hämoglobin bereitzustellen, welches durch die Stabilisierung des Hämoglobins in einem gelösten Zustand gekennzeichnet ist.
  • Das Schwefel enthaltende Mittel der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung mit einer SH-Gruppe.
  • Abgesehen davon kann diese Verbindung mit einer SH-Gruppe entsprechend der vorliegenden Erfindung eine der Verbindungen sein, die aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus einer Schwefel enthaltenden Aminosäure, wie zum Beispiel Cystein, Methionin, Cystin und dergleichen, und deren Familie; und aus einer Schwefel enthaltenden Verbindung, wie zum Beispiel Thioglycolsäure, 1-Thioglycelin, Thiodiglycol, Mercaptoethanol, Glutathion, Dithiothreitol und dergleichen, sowie deren Familie.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Verbindung mit einer SH-Gruppe Cystein sein und dessen Familie.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann dieses Hämoglobin Hämoglobin sein.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann dieses Hämoglobin glycosyliertes Hämoglobin sein.
  • Ein anderer wesentlicher Punkt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Stabilisierung der vorliegenden Erfindung.
  • Ein weiterer wesentlicher Punkt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die durch die Zugabe eines stabilisierenden Mittels für Hämoglobin im Sinne der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet ist.
  • Ein weiterer wesentlicher Punkt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass mindestens das stabilisierende Mittel für Hämoglobin und Hämoglobin im Sinne der vorliegenden Erfindung zugegeben wird.
  • Ein weiterer anderer wesentlicher Punkt der Erfindung ist die Verwendung der Schwefel enthaltenden Verbindung im stabilisierenden Mittel der vorliegenden Erfindung.
  • Beste Art zur Ausführung der vorliegenden Erfindung
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung bedeutet "Hämoglobin" Hämoglobin und glycosyliertes Hämoglobin. Ein Beispiel des glycosylierten Hämoglobins umfasst HbA1c. Ein weiteres Beispiel eines Hämoglobins umfasst HbA1a, HbA1b, HbF, HbA0, HbA2, Oxyhämoglobin, Carbonylhämoglobin, Alkali-modifiziertes Hämoglobin und dergleichen, sowie ein anderes Heterohämoglobine. Abgesehen davon werden modifizierte Hämoglobine, wie zum Beispiel Phosphatester-Derivate des Hämoglobins, Hämoglobin-Polyalkylen-Konjugate, Hämoglobin-Inuren-Konjugate und Hämoglobin-Haptglobin-Komplexe ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Darüber hinaus kann das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung nicht nur von menschlichem Ursprung verfügbar sein, sondern auch von tierischem Ursprung, beispielsweise vom Rind, Schwein, Schaf, Pferd, Hund, Affe, Kaninchen, Huhn und dergleichen. Diese werden als ein Standard- oder Kontroll-Material für verschiedene klinische Labortests verwendet. Ein für diese Zwecke angebotenes Produkt wird vorzugsweise als eine getrocknete Substanz geliefert, als ein lyophilisiertes Mittel, und es kann sich in Form eines getrockneten Mittels, eines flüssigen Mittels etc. befinden, falls gewünscht.
  • Der erste und wichtige wesentliche Punkt eines Stabilisierungsverfahrens und eines stabilisierenden Mittels für Hämoglobin entsprechend der vorliegenden Erfindung verbleibt in der Sicherstellung einer Stabilität des Hämoglobins in einem flüssigen Zustand. Damit wird die Sicherung der Stabilität des Hämoglobins in einem getrockneten Arzneimittel und in einem gelösten Zustand gemeint.
  • Ein Stabilisierungsverfahren für Hämoglobin entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die Zugabe einer Schwefel enthaltenden Verbindung, um diese zu stabilisieren. Die Zugabe der Schwefel enthaltenden Verbindung ist bequemer in einem Verfahren zur Herstellung des Mittels zuzugeben, d.h. auszuführen, sie kann jedoch durch herkömmliche Zugabe nach Auflösen des Mittels, je nach Bedarf, erreicht werden. Das Hämoglobin Standard-Material und Kontroll-Material, in welchem das Hämoglobin der Hauptbestandteil ist, und die Schwefel enthaltende Verbindung ist als ein stabilisierendes Mittel enthalten, und sie werden bei der Zugabe des Schwefel enthaltenden Mittels in einem Schritt bei der Bereitung des Mittels bereitgestellt. Falls das Mittel von der Art ist, deren Verbindung nach Bedarf zugegeben wird, werden der Hauptbestandteil und das stabilisierende Mittel, welches das Schwefel enthaltende Mittel enthält, gesondert hergestellt.
  • Als das Schwefel enthaltende Mittel entsprechend der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung mit einer SH-Gruppe wohlbekannt und reichlich verfügbar. Verbindungen mit einer SH-Gruppe umfassen eine Schwefel enthaltende Aminosäure, wie zum Beispiel Cystein, Methionin, etc.; eine Schwefel enthaltende Verbindung, wie zum Beispiel Thiobenzoesäure, Thioglycolsäure, 1-Thioglycerin, Thiodiglycol, Mercaptoethanol, Glutathion, Dithiothreitol, etc., und deren Familie. Sie können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Das am meisten bevorzugte ist die Schwefel enthaltende Aminosäure, wie zum Beispiel Cystein, Methionin, Cystin und dergleichen, und deren Familie. Das besonders bevorzugte ist Cystein und deren Familie.
  • Die Menge des Schwefel enthaltenden Mittels, welche eingesetzt werden soll, beträgt 0,01 bis 0,000.01 Gewichtsteile auf 1 Gewichtsteil des Hämoglobins, vorzugsweise 0,001 bis 0,000.1 Gewichtsteile. Eine Konzentration einer Lösung, wenn das Mittel in Form einer Lösung zubereitet wird, beträgt 0,01 bis 100 mM, vorzugsweise 0,1 bis 10 mM, pro Hämoglobin in einer 2 bis 10 Gew.-%igen Konzentration.
  • Das Hämoglobin enthaltende Standard-Material oder Kontroll-Material, welches geliefert wird und Stabilität entsprechend der vorliegenden Erfindung gewährleistet, kann als eine Hämoglobin enthaltende Zusammensetzung angesprochen werden. Diese Zusammensetzung kann unter Verwendung wohlbekannter Technologien, zusätzlich zum Hauptbestandteil und dem Stabilisator als den Grundbestandteilen, mit Füllmitteln, pH-Kontrollmitteln zum Schutz vor Trübung in Bezug auf deren Löslichkeit, Protein, Saccharose, Verbindungen mit hohem Molekulargewicht, anorganischen Salzen, Chelatisierungsmitteln und dergleichen vereinigt werden, oder sie können damit je nach Bedarf kombiniert werden.
  • Beispiele hierfür umfassen verschiedene Pufferlösungen oder pH-Kontrollmittel, welche zur Kontrolle des pH-Wertes von 5 bis 9 imstande sind, Proteine, wie zum Beispiel Albumin, Gelatine, etc., Saccharide, wie zum Beispiel Glycerin, Saccharose (vorzugsweise Disaccharide, wie zum Beispiel Saccharose), etc., Polysaccharide, wie zum Beispiel Dextransulfat-Natriumsalz, Heparin, Natriumsulfat, Chondroitin, Dextran, etc., und Verbindungen mit hohem Molekulargewicht, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polypropylenglycol, etc.. Diese Materialien können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Abgesehen davon können verwendet werden Saccharide, wie zum Beispiel Glucose, Maltose, Inositol, Fructose, Glucitol, Glucono-δ-lacton, Trehalose, Maltitol, Raffinose, Mannitol; anorganische Verbindungen, wie zum Beispiel Natriumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumchlorid, Calciumlactat, etc., Chelatisierungsmittel, wie zum Beispiel EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), NTA (Nitrilotriessigsäure), EDDA (Ethylendiamindiessigsäure), CyDTA (trans-1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Monohydrat), DPTA-OH (1,3-Diamino-2-hydroxypropan-N,N-N',N'-tetra essigsäure), DTPA (Diethylentriamin-N,N,N',N'',N''-pentaessigsäure), EDDP (Ethylendiamin-N,N'-dipropionsäure, Dihydrochlorid), EDDPO [Ethylendiamin-N,N'-bis-(methylenphosphonsäure), Hemihydrat], EGTA [Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-tetraessigsäure], HBED [N,N'-Bis(2-hydroxybenzyl)ethylendiamin-N,N-diessigsäure), HDTA (1,6-Hexamethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure), HIDA [N-(2-Hydroxyethyl)iminodiessigsäure], IDA (Iminodiessigsäure), NTP (Nitrilo-tripropionsäure), NTPO [Nitrilo-tris-(methylenphosphonsäure), Trinatriumsalz], TTHA (Triethylentetramin-N,N,M',N'',N''',N'''-hexaessigsäure), etc, α-, β-, γ-CD (Cyclodextrin) oder diese mit einem Polymer modifizierten Cyclodextrine, und dergleichen. Diese können einzeln oder in Kombination verwendet werden.
  • Beispiele
  • Die folgende Erfindung wird in näheren Einzelheiten unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, welche nicht so aufzufassen sind, als beschränkten sie die vorliegende Erfindung.
  • (Beispiel 1)
  • Die Mischung der nachfolgend aufgeführten Mittel wurde mit oder ohne Zugabe von 1 mM L-Cystein, zubereitet; 1 ml Mischung wurde in ein 5 ml Glasgefäß pipettiert und sie wurde lyophilisiert, um eine lyophilisierte Zubereitung zu bilden. Als Hämoglobin wurde Standard-Hämoglobin, das HbA1a, HbA1b, HbF und HbA0 enthält, verwendet, und in einer Konzentration von 7% (Gewicht/Volumen) zugegeben.
    10 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0)
    25 mM EDTA·2Na
    7% Standard-Hämoglobin (JML Company)
    25% Saccharose
  • (Experimentelles Beispiel 1)
  • Jedes der lyophilisierten Mittel, mit oder ohne Zugabe von L-Cystein, welche in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurde in 1 ml destilliertem Wasser gelöst, um die Stabilität des Hämoglobins im gelösten Zustand nach Ablauf eines Zeitraums von 25 Stunden bei 25°C zu vergleichen. Die Messung des Hämoglobins wurde durch den Nachweis der Absorbanz (Wert der optischen Dichte) bei 577 nm durchgeführt (Methods in Enzymology, 188, 266–272). Aus den in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen wurde durch die Zugabe von L-Cystein eine ausreichende stabilisierende Wirkung des Hämoglobins in einem gelösten Zustand bestätigt. Darüber hinaus wurde eine chemische Analyse eines jeden Abschnittes durchgeführt, unter Verwendung eines automatischen Analysators HLC-723GHbIII für glycosylierte Hämoglobine, hergestellt von Toso Company. Diese Ergebnisse zeigten, dass es in sämtlichen Arten von Hämoglobin-Fraktionen stabil war.
  • Tabelle 1
    Figure 00100001
  • (Beispiel 2)
  • Eine Probe wurde mit dem nachfolgend aufgeführten Mittel durch Zugabe oder ohne Zugabe von 1 mM L-Cystein zubereitet. In derselben Weise, wie in Beispiel 1 aufgeführt, wurde das Stan dard-Hämoglobin, welches HbA1c, HbA1a, HbF und HbA0 enthält, verwendet, um eine Konzentration des Hämoglobins von 7% (Gewicht/Volumen) herzustellen.
    10 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0)
    25 mM EDTA 2 Na
    7% Hämoglobin-Standard (JML Company)
  • (Experimentelles Beispiel 2)
  • Jedes der Mittel, mit oder ohne Zugabe von L-Cystein, welche in dem Beispiel 2 hergestellt wurden, wurde studiert beim Vergleich der Stabilität des Hämoglobins nach der Herstellung und bei 25°C nach Ablauf eines Zeitraums von 25 Stunden in derselben Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 2 gezeigt. Entsprechend der Zugabe von L-Cystein wurde eine ausreichende Stabilität des Hämoglobins erreicht, unabhängig von der Gegenwart von Saccharose. Darüber hinaus wurde eine chemische Analyse eines jeden Abschnittes unter Verwendung eines automatischen Analysators HLC-723GHbIII für Glycohämoglobin durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass es in allen Arten von Hämoglobin-Fraktionen stabil war.
  • Tabelle 2
    Figure 00110001
  • Möglichkeit einer gewerblichen Verwendung
  • Durch das Stabilisierungsverfahren für Hämoglobin und das Stabilisierungsmittel, gekennzeichnet durch die Zugabe einer Schwefel enthaltenden Verbindung entsprechend der vorliegenden Erfindung wird die Stabilität des Hämoglobins und des glycosylierten Hämoglobins im gelösten Zustand gewährleistet. Somit wurde durch Einführung stabilisierender Mittel für Hämoglobin, beispielsweise eine Stabilität eines Standard-Materials und eines Kontroll-Materials, welche Hämoglobin enthalten, für einen klinischen Labortest, verbessert und führte zur Erwartung von Labortests, deren Ergebnisse eine hohe Genauigkeit aufwiesen. Die vorliegende Erfindung ist nützlich, um zu einem klinischen Labortest und auf dem pharmazeutischen Gebiet beizutragen.

Claims (9)

  1. Mittel für einen klinischen Labortest, dadurch gekennzeichnet, dass es Hämoglobin, eine Schwefel enthaltende Verbindung und ein Chelatisierungsmittel umfasst, wobei die Schwefel enthaltende Verbindung in einer Menge von 0,01 bis 0,000.01 Gewichtsteilen pro 1 Gewichtsteil des Hämoglobins zugegeben wird.
  2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Hämoglobin im gelösten Zustand stabilisiert wird.
  3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schwefel enthaltende Verbindung eine Verbindung mit einer SH-Gruppe ist.
  4. Mittel nach Anspruch 3, wobei diese Verbindung mit einer SH-Gruppe mindestens eine ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Cystein, Methionin, Cystin, Thiobenzoesäure, Thioglycolsäure, 1-Thioglycerin, Thiodiglycol, Mercaptoethanol, Glutathion und Thioglycerin besteht.
  5. Mittel nach Anspruch 3, wobei die Verbindung mit einer SH-Gruppe eine Schwefel enthaltende Aminosäure ist.
  6. Mittel nach Anspruch 5, wobei die Schwefel enthaltende Aminosäure Cystein ist.
  7. Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Hämoglobin glycosyliertes Hämoglobin ist.
  8. Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ein lyophilisiertes Mittel ist.
  9. Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ein flüssiges Mittel ist.
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