WO2001002438A1

WO2001002438A1 - Moyens pour stabiliser les hemoglobines

Info

Publication number: WO2001002438A1
Application number: PCT/JP2000/004440
Authority: WO
Inventors: Tsutomu Kakuyama
Original assignee: International Reagents Corporation
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2001-01-11
Also published as: CA2377822A1; JP5410647B2; EP1191037B1; DE60022751T2; ATE305013T1; EP1191037A1; EP1191037A4; KR100674690B1; DE60022751D1; KR20020026463A

Description

明細書ヘモグロビン安定化手段技術分野

本発明は、ヘモグロビン類の安定化方法、安定化剤、および安定化されたへモグロビン類を含む組成物に関するものである。背景技術

ヘモグロビンは、赤血球に存在するヘムタンパク質であり、ひ鎖および鎖と命名されるポリペプチド鎖（各鎖はヘム 1分子と結合している） 2対からなる四量体で構成されており、分子量 6 5、 0 0 0である。ヘモグロビンは、血液中に成人男性で 1 6〜： L 8 g / ά L、女性で 1 4〜 1 6 g / d L含まれており、可逆的に酸素を鉄分子に脱着することにより、生体中において酸素運搬機能を果たしている。

このような役割を有することから、臨床検査において、ヘモグロビンの測定は基本的な測定項目の一つとなっており、赤血球数やへマトクリット値などと組み合わせて貧血（例えば、鉄欠乏性貧血、再生不良性貧血、溶血性貧血など）の診断に利用されている。また、最近では、便に含まれている微量のヘモグロビンを測定することにより、大腸ガンなどの診断にも利用されている。

一方、グリコヘモグロビンは、ヘモグロビンとグルコースとの非酵素的反応より生じる。血中でのグリコへモグロビンの測定は過去 3〜4週間の血糖コント口ールを反映し、食事に影響されない長期の血糖コントロールの指標として極めて有用である。以後このへモグロビンとグリコへモグ口ビンを合わせてへモグ口ビン類と称する。

現在、臨床検査の現場では上記ヘモグロビン類の測定は、 H P L C法、免疫学的方法、ァフィ二ティ法、電気泳動法、等電点分画法、 T B A (2-thiobarbituric acid) 法、 R I A (Radio Immuno Assay) 法、 P h o t i c a c i d e法、 f u r o s i n e測定法などにより行われている。

上記ヘモグロビン類の測定に際しては、基準となる標準物質ゃコントロール物質が必要となる。しかし、ヘモグロビン類は不安定な物質であり、酸化により、ヘム鉄が F e ^{2 +}から F e ³ +となり、鮮赤色から暗褐色のメトへモグロビンになつて、酸素結合能を失う。更にヘモグロビンは空気中にさらしておくだけでもメトヘモグロビンに酸化され、更には凍結乾燥することでもメトヘモグロビンに酸化されることが知られている。

このような酸化を防止する方法として、 0 ₂が結合する部位に C Oや N Oまたは C Nなどの酸素とほとんど大きさの等しい二分子原子を結合させる方法や、凍結乾燥時にアジ化ナトリウムを添加して行う方法がある。しかし上記方法は、操作が煩雑であったり、一部の測定法で顕著な低値を与えたり測定が不能であつたり、更にアジ化ナトリウムが有する毒性のため廃棄の問題などがある。また、含窒素化合物を添加する方法（特開昭 6 0 - 3 5 2 7 0号公報）が開示されているものの、ヘモグロビンからの鉄の遊離を防く、効果が開示されているのみである。糖類およびアミノ酸類を含有させる方法（特開昭 6 1 - 1 6 2 0号公報）はへモグロビンのメト化防止剤を開示しているが、この方法は代用血液として利用するへモグ口ビンの安定化を目的としており、ヘモグロビンとして m g /m Lレベルの濃度を対照としたものであり、臨床検査における標準物質またはコントロール物質などに要求される n g〜 g /m Lレベルのへモグロビンを安定化するには適当ではない。また、アミノ酸およびアルブミンを含有させる方法（特開平 8— 2 4 5 4 2 1号公報）によりヘモグロビン類を安定化させる方法があるが、これ - は、アミノ酸の他にアルブミンを添加する必要があり試薬組成に制限がかかる。

このように、従来のヘモグロビン類を安定化させる方法は、ヘモグロビン類を高精度で測定する必要のある臨床検査のコントロール物質および標準物質の安定化法としては適当でない。そのため、ヘモグロビン類を含むコントロール物質および標準物質の安定化方法の開発が、医薬分野および臨床検査の分野などで求められている。発明の開示

本発明者らは、コントロール物質や標準物質の安定化について研究した結果、ヘモグロビン類に含硫化合物、特に S H化合物を添加することによりへモグロビン類の安定性が向上することを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の態様の一は、含硫化合物を含有することを特徴とするへモグロビン類の安定化剤である。特に溶液状態のへモグロビン類を安定化することを特徴とするへモグロビン類の安定化剤を提供する。

本発明において含硫化合物は S H化合物でありうる。

さらに、本発明において、前記 S H化合物が、システィン、メチォニン、もしくはシスチンなどの含硫アミノ酸またはこれらの類縁体、ならびに、チォ安息香酸、チォグリコール酸、 1—チォグリセリン、チォジグリコール、メルカプトェ夕ノール、グル夕チオン、もしくはジチオスレイト一ルなどの含硫化合物またはこれらの類縁体の中から選ばれる 1つ以上の化合物でありうる。

本発明において、 S H化合物はシスティンまたはその類縁体でありうる。また、本発明は、含硫化合物を、ヘモグロビン類の 1重量部に対して 0 . 0 1 〜0 . 0 0 0 0 1重量部含有することを特徴とする。

本発明において、前記へモグロビン類がへモグロビンであってよい。

本発明において、前記ヘモグロビン類がグリコヘモグロビンであってよい。また、本発明の態様の一は、本発明のヘモグロビン類の安定化剤を添加することを特徴とするへモグロビン類の安定化方法である。

さらに、本発明の態様の一は、本発明のヘモグロビン類の安定化剤を含有することを特徴とするヘモグロビン類を含む組成物である。

さらにまた、本発明の態様の一は、本発明のヘモグロビン類の安定化剤およびへモグロビン類を少なくとも含んでなるキットである。

またさらに、本発明の態様の一は、本発明のヘモグロビン安定化剤における含硫化合物の使用である。発明を実施するための最良の形態

本発明においてヘモグロビン類とは、ヘモグロビンとグリコへモグロビンを意味する。グリコヘモグロビンとしては、 H b A _{l c}が例示される。さらに、その他、ヘモグロビン類として、 H b A _{l a}、 H b A _{l b}、 H b F、 H b A ₀、 H b A ₂、ォキシヘモグロビン、カルボニルヘモグロビン、メトヘモグロビン、シァノメトへモグロビン、アルカリ変性ヘモグロビンなどや、その他異常ヘモグロビンが例示される。さらに、修飾ヘモグロビン類、すなわちヘモグロビン類のリン酸エステル誘導体、ヘモグロビン—ポリアルキレン結合体、ヘモグロビン—ィヌレン結合体、ヘモグロビン一ハプトグロビン複合体も本発明の範囲に含まれる。また、本発明は、ヒト由来に限らず種々の動物由来、例えば、ゥシ、ブ夕、ヒヅジ、ゥマ、ィヌ、サル、ゥサギ、ニヮトリなどのへモグロビン類についても適用可能である。これらへモグロビン類は、各種臨床検査などのための標準物質またはコントロ一ル物質として使用に供される。これら使用に供せられる製品は、より好ましくは凍結乾燥製剤のような乾燥製剤として提供されるが、所望により凍結製剤、液状製剤などであってもよい。

本発明のへモグロビン類の安定化方法および安定化剤の第一義的な意義は、へモグロビン類の溶液状態における安定性の確保にある。その意味は、液状製剤としての、または乾燥製剤や凍結製剤の溶解時における溶液状態のヘモグロビン類の安定性を確保する事にある。

本発明のへモグロビン類の安定化方法は、含硫化合物をへモグロビン類の安定化のために共存させることである。含硫化合物の添加は、製剤調製時に行うことがより一般的で簡便であるが、所望により、製剤を溶解後、適宜添加することによっても目的は達成できる。製剤調製の段階で含硫化合物を添加すれば、へモグロビン類を主剤とし、含硫化合物を安定化剤として含む、ヘモグロビン類標準物質またはコントロール物質が提供される。また、用時添加型の製剤とするのであれば、主剤と含硫化合物を含む安定化剤とを別々の製剤としたキット製品として提供可能である。

含硫化合物とは、 S H化合物が一般的であり、広く利用できる。 S H化合物としては、システィン、メチォニン、シスチンなどの含硫アミノ酸、および、チォ安息香酸、チォグリコール酸、 1—チォグリセリン、チォジグリコール、メルカブトエタノール、グル夕チオン、ジチオスレィトールなどの含硫化合物、ならびにこれらの類縁体が挙げられる。これらは単独でまたは複数を組み合わせて使用できる。このなかで、好ましい化合物はシスティン、メチォニン、シスチンなどの含硫アミノ酸およびこれらの類縁体であり、特に好ましい化合物はシスティンおよびその類縁体である。

含硫化合物の使用量は、ヘモグロビン類の 1重量部に対して、 0 . 0 1 〜 0 . 0 0 0 0 1重量部であり、好ましくは 0 . 0 0 1 〜 0 . 0 0 0 1重量部である。また、溶液状態に調製した時の濃度としては、 2 〜 1 0重量％濃度のへモグロビン類に対して 0 . 0 1〜： L 0 O mM、好ましくは 0 . l 〜 1 0 mMである。

本発明において提供される安定性が確保されたへモグロビン類を含む標準物質またはコントロール物質は、へモグロビン類を含有する組成物ともいえるものであり、該組成物は、そのベース成分としての主剤および安定化剤に加えて、賦形剤、溶解時の濁り防止などのための p H調製剤、蛋白質、糖類、高分子化合物、無機塩、キレート化剤などを、所望により、公知技術を応用して、製剤調製時に配合されるかまたは用時配合されてもよい。

これらの例示としては、 p Hを 5 〜 9に調整しうる各種緩衝液または p H調製剤、アルブミン、ゼラチンなどのタンパク質、グリセロール、シユークロース、好ましくはシユークロースなどの二糖類、デキストラン硫酸ナトリウム、へパリン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デキストランなどの多糖類、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコ一ルなどの高分子化合物を、単独または組み合わせて使用することができる。さらに、適宜、グルコース、マルト一ス、イノシトール、マンノース、フルクトース、グルシトール、グルコノー（5—ラクトン、トレハロース、マルチトール、ラフイノ一ス、マンニトールなどの糖類、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、乳酸カルシウムなどの無機塩、 E D T A

、 ethylenediaminetetraacetic acid ) 、 Ν Τ Α nitrilotriacetic acidノ、 t D D A ( ethylenediaminediacetic acid ) 、 C y D T A ( trans- 1，2-Diaminocyclohexane- Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetraacetic acid, monohydrate ) 、 D P T A — 〇 H ( l,3-Diamino-2- hydroxypropane-N,N,N',N'-tetraacetic acid ) 、 D T P A ( Diethylenetriamine- N,N,N',N",N"-pentaacetic acid)、 ED DP (Ethylenediamine-N,N'-dipropionic acid, dihydrochloride)、 E D D P 0 〔Ethylenediamine-N，N，-bis(methylenephosphonic acid) hemihydrate〕、 E GTA 〔ethyleneglycol-bis-( ? -amino-ethylether)tetraacetic acid〕、 H B E D CN,N'-Bis(2-hydroxybenzyl)ethylenediamine-N,N-diacetic acid〕、 H D T A

( l,6-Hexamethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid ) 、 H I D A C N-(2- Hydroxyethyl)iminodiacetic acid〕、 I D A ( Iminodiacetic acid ) 、 N T P

(Nitrilotripropionic acid) N T P 0〔Nitrilotris(methylenephosphonic acid), trisodium salt〕、 T T H A (Triethylenetetramine-N,N，N，，N",N'",N"，- hexaacetic acid) などのキレート剤、ひ一、 β―、 7 - CD (cyclodextrin) 、またはこれらの CDがヒド口キシルプロピル基またはジメチル基で修飾されたもの、ひ— CDポリマ一、 β — CDポリマ一、ァー CDポリマーなどの CD類を、単独または組み合わせて用いることができる。実施例

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

(実施例 1 )

下記に示す試薬に安定化剤として L—システィンを 1 mM添加したものおよび添加していないものを調製し、 5 m 1ガラス容器に 1 m 1分注し、凍結乾燥を行い、凍結乾燥製剤とした。なお、ヘモグロビン類として、 HbA_{l c}、 HbAi_a、 HbA_{l b}、 HbF、 HbA₀を含むヘモグロビン標品を用い、ヘモグロビン濃度が 7 %になるように添加した。

1 OmM リン酸緩衝液（pH 7. 0)

25 mM E D T A · 2 N a

7 % ヘモグロビン標品（JML社）

25% シュ一クロース

(試験例 1 )

実施例 1で調製した、安定化剤として L—システィンを含むおよび含まない凍結乾燥製剤をそれそれ精製水 1 mlで溶解し、溶液状態で 25°C25時間経過後のヘモグロビンの安定性を比較した。ヘモグロビンの測定は、 577 nmにおける吸光度（〇. D値）を測定することにより行った（Me t h o d s in E nz mo l o gy, 186， 265— 272 ) 。その結果、表 1に示すように、 L—システィンの添加により、溶液状態でのへモグロビンの充分な安定化効果が確認された。また、東ソー自動グリコヘモグロビン分析計 HLC— 723 GHb IIIにより各画分の分析を行ったが、クロマトグラムは変化なく、各成分とも安定であった。表 1

(実施例 2)

下記に示す試薬に安定化剤として、 L一システィンを 1 mM添加したものおよび添加していないものを調製した。実施例 1同様、 HbA_{l c}、 HbA_{l a}、 Hb Aiい Hb F、 Hb A₀を含むへモグロビン標品を用い、へモグロビン濃度が 7 % になるように添加した。

1 OmM リン酸緩衝液（p H 7. 0)

2 5 mM E D T A · 2 N a

7 % ヘモグロビン標品（JML社）

(試験例 2)

実施例 2で調製した、 L一システィンを含むおよび含まない試薬について、調製直後および 2 5°C2 5時間経過後のヘモグロビンの安定性を、試験例 1と同様のヘモグロビン測定法で検討した。結果は表 2に示した。 L一システィンの添加により、糖（シユークロース）の有無に関係なく充分なヘモグロビンの安定性が得られた。また、東ソー自動グリコヘモグロビン分析計 HL C— 723 G H b III により各画分の分析を行ったが、クロマトグラムは変化なく、各成分とも安定であった。表 2

0時間 2 5時間後

L—システィン添加 0. 85 0. 85

無添加 0. 85 0. 43 産業上の利用の可能性

本発明の含硫化合物を添加することを特徴とするへモグロビン類の安定化方法および安定化剤により、ヘモグロビンゃグリコヘモグロビンなどのへモグロビン類の溶液状態における安定性が確保される。従って、本発明のヘモグロビン類の安定化手段を導入することにより、例えばヘモグロビン類を含む各種臨床検査などのための標準物質ゃコントロール物質の安定性が向上し、より確度の高い検査結果を得ることができる。このように、本発明は、臨床検査および医薬分野に寄与する有用な発明である。

Claims

請求の範囲

1. 含硫化合物を含有することを特徴とするへモグロビン類の安定化剤。

2. 請求の範囲第 1項に記載のヘモグロビン類の安定化剤であって、溶液状態のへモグロビン類を安定化することを特徴とするへモグロビン類の安定化剤 c

3. 前記含硫化合物が、 S H化合物である請求の範囲第 1項または第 2項に記載のへモグロビン類の安定化剤。

4. 前記 S H化合物が、システィン、メチォニン、もしくはシスチンなどの含硫アミノ酸またはこれらの類縁体、ならびに、チォ安息香酸、チォグリコール酸、 1—チォグリセリン、チォジグリコール、メルカプトエタノール、グル夕チオン、もしくはチォグリセロールなどの含硫化合物またはこれらの類縁体の中から選ばれる 1つ以上の化合物である請求の範囲第 3項に記載のへモグロビン類の安定化剤。

5. 前記 S H化合物がシスティンまたはその類縁体である請求の範囲第 3項に記載のへモグロビン類の安定化剤。

6. 前記含硫化合物を、ヘモグロビン類の 1重量部に対して 0 . 0 1〜0 . 0 0 0 0 1重量部含有することを特徴とする請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか 1項に記載のへモグロビン類の安定化剤。

7. 前記へモグロビン類がへモグロビンである請求の範囲第 1項から第 6項に記載のへモグロビン類の安定化剤。

8. 前記へモグロビン類がグリコへモグロビンである請求の範囲第 1項から第 6項に記載のヘモグロビン類の安定化剤。

9. 請求の範囲第 1項から第 8項に記載のへモグロビン類の安定化剤を添加することを特徴とするヘモグロビン類の安定化方法。

10. 請求の範囲第 1項から第 8項のいずれか 1項に記載のヘモグロビン類の安定化剤を含有することを特徴とするへモグロビン類を含む組成物。

11. 請求の範囲第 1項から第 8項のいずれか 1項に記載のヘモグロビン類の安定化剤およびヘモグロビン類を少なくとも含んでなるキット。

12. 請求の範囲第 1項から第 8項のいずれか 1項に記載のヘモグロビン安定化剤における含硫化合物の使用。