KR20020026463A - 헤모글로빈 안정화수단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 함황화합물을 함유한 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화제 및 그 안정화제를 첨가하는 헤모글로빈의 안정화방법, 특히 용액상태에서의 헤모글로빈류를 안정화시키는 안정화제 및 안정화방법을 제공하는 것이고, 이에 의하여 고정밀도로 측정할 필요가 있는 임상검사용의 헤모글로빈류를 함유한 콘트롤물질 및 표준물질 등의 안정화를 달성하였다.

Description

헤모글로빈 안정화수단{MEANS OF STABILIZING HEMOGLOBINS}

헤모글로빈은 적혈구에 존재하는 헴단백질이고, α류 및 β류라고 명명된 폴리펩타이드쇄(각 쇄(chain)는 헴(heme)1분자와 결합하고 있다) 2쌍으로 된 4량체로 구성되어 있고, 분자량은 65,000이다. 헤모글로빈은 혈액중에 성인 남성은 16~18g／dL, 여성은 14~15g／dL 함유되어 있으며, 가역적으로 산소를 철분자에 탈착시킴으로써 생체중에서 산소운반기능을 하고 있다.

이러한 역할을 하기 때문에, 임상검사에 있어서 헤모글로빈의 측정은 기본적인 측정항목의 하나로 되어 있고, 적혈구수나 헤마토클릿값과 조합하여 빈혈(예를들면, 철결핍성빈혈, 재생불량성빈혈, 용혈성빈혈등)의 진단에 이용되고 있다. 또한, 최근에는 변에 함유되어 있는 미량의 헤모글로빈을 측정함으로써 대장암 등의 진단에도 이용되고 있다.

한편, 글리코헤모글로빈은 헤모글로빈과 글루코스와의 비효소적 반응에서 생긴다. 혈중에서의 글리코헤모글로빈의 측정은 과거 3~4주간의 혈당콘트롤을 반영하고, 식사에 영향을 받지 않는 장기의 혈당콘트롤의 지표로서 매우 유용하다. 이후 이 헤모글로빈과 글리코헤모글로빈을 합하여 헤모글로빈류라고 칭한다.

현재, 임상검사의 현장에서는 상기 헤모글로빈류의 측정은 HPLC법,면역학적방법, 애피니티법, 전기영동법, 등전점분획법, TBA(2-thioba rbituric acid)법, RIA(Radio Immuno Assay)법, Photic acid법, furos ine측정법 등에 의하여 행하여지고 있다.

상기 헤모글로빈류의 측정에 있어서는, 기준이 되는 표준물질이나 콘트롤물질이 필요하게 된다. 그러나, 헤모글로빈류는 불안정한 물질이고, 산화에 의하여 헴철이 Fe²⁺부터 Fe³⁺로 되고, 선적색부터 암갈색의 메토헤모글로빈이 되어, 산소결합능을 상실한다. 또한, 헤모글로빈은 공기중에 노출시켜 두는 것만으로도 메토헤모글로빈에 산화되며, 또한, 동결건조시킴으로써도 메토헤모글로빈에 산화되는 것이 알려져 있다.

이러한 산화를 방지하는 방법으로서 O₂가 결합하는 부위에 CO나 NO 또는 CN 등의 산소와 거의 크기가 같은 2분자원자를 결합시키는 방법이나, 동결건조시에 아지화나트륨을 첨가하여 행하는 방법이 있다. 그러나, 상기방법은 조작이 번잡하거나 일부측정법에서 현저한 낮은 값을 주거나 측정이 불능하거나, 또한 아디화나트륨이 갖는 독성 때문에 폐약의 문제 등이 있다. 또한, 함질소화합물을 첨가하는 방법(특개소 60-35270호 공보)이 개시되어 있으나, 헤모글로빈으로부터의 철의 유리를 방지하는 효과가 개시되어 있을 뿐이다. 당류 및 아미노산류를 함유시키는 방법(특개소 61-1620호 공보)은 헤모글로빈의 메토화방지제를 개시하고 있으나, 이 방법은 대용혈액으로서 이용하는 헤모글로빈의 안정화를 목적으로 하고 있으며, 헤모글로빈으로서 ㎎／mL레벨의 농도를 대조한 것이고, 임상검사에 있어서의 표준물질 또는 콘트롤물질 등에 요구되는 ng~㎍／mL레벨의 헤모글로빈을 안정화시키려면 적당하지 않다. 또, 아미노산 및 알부민을 함유시키는 방법(특개평 8-245421호 공보)에 의하여 헤모글로빈류를 안정화시키는 방법이 있으나, 이것은 아미노산외에 알부민을 첨가할 필요가 있어서 시약조성에 제한이 있다

이와 같이, 종래의 헤모글로빈류를 안정화시키는 방법은 헤모글로빈류를 고정밀도로 측정할 필요가 있는 임상검사의 콘트롤물질 및 표준물질의 안정화방법으로서는 적당하지 않다. 그 때문에 헤모글로빈류를 함유한 콘트롤물질 및 표준물질의 안정화방법의 개발이 의약분야 및 임상검사분야 등에서 요구되고 있다.

본 발명은 헤모글로빈류의 안정화방법, 안정화제 및 안정화된 헤모글로빈류를 함유한 조성물에 관한 것이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명자들은 콘트롤물질이나 표준물질의 안정화에 대하여 연구한 결과, 헤모글로빈류에 함황화합물, 특히 SH화합물을 첨가함으로써 헤모글로빈류의 안정성이 향상되는 것을 알아내어 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명의 태양의 하나는 함황화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화제이다. 특히 용액상태의 헤모글로빈류를 안정화시키는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화제를 제공한다.

본 발명에 있어서 함황화합물은 SH화합물일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 상기 SH화합물이 시스테인, 메티오닌, 혹은 시스틴 등의 함황아미노산 또는 이들의 유연체 및 티오안식향산, 티오글리콜산, 1-티오글리세린, 티오디글리콜, 메르카프토에탄올, 글루타티온, 혹은 디티오슬레이톨 등의 함황화합물 또는 이들 유연체중에서 선택되는 1개 이상의 화합물일 수 있다.

본 발명에 있어서, SH화합물은 시스테인 또는 그 유연체일 수 있다. 또, 본 발명은 함황화합물을 헤모글로빈류의 1중량부에 대하여 0.1∼0.00001중량부 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 헤모글로빈류가 헤모글로빈이라도 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 헤모글로빈류가 글리코헤모글로빈이라도 좋다.

또, 본 발명의 태양의 하나는 본 발명의 헤모글로빈류의 안정화제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 해모글로빈류의 안정화방법이다.

또한, 본 발명의 태양의 하나는 본 발명의 헤모글로빈류의 안정화제를 함유하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류를 함유한 조성물이다.

또, 본 발명의 태양의 하나는 본 발명의 헤모글로빈류의 안정화제 및 헤모글로빈류를 적어도 함유하고 있는 키트이다.

또, 본 발명의 태양의 하나는 본 발명의 헤모글로빈 안정화제에 있어서의 함황화합물의 사용이다.

본 발명에 있어서, 헤모글로빈류란, 헤모글로빈과 글리코헤모글로빈을 의미한다. 글리코헤모글로빈으로서는 HbA_1c가 예시된다. 또한, 기타의 헤모글로빈류로서 HbA_1a, HbA_1b, HbF, HbA₀, HbA₂, 옥시헤모글로빈, 카르보닐헤모글로빈, 메토헤모글로빈, 시아노메토헤모글로빈, 알칼리변성헤모글로빈 등이나 기타 이상헤모글로빈이 예시된다. 또한, 수식헤모글로빈류, 즉, 헤모글로빈류의 인산에스테르유도체, 헤모글로빈-폴리알킬렌결합체, 헤모글로빈-이눌렌결합체, 헤모글로빈-하프트글로빈복합체도 본 발명의 범위에 포함된다. 또, 본 발명은 사람유래에 한하지 않고, 여러 가지 동물유래, 예를 들면 소, 돼지, 양, 말, 개, 원숭이, 토끼, 닭 등의 해모글로빈류에 대해서도 적용가능하다. 이들 헤모글로빈류는 각종 임상검사 등을 위한 표준물질 또는 콘트롤물질로서 사용된다. 이들 사용에 제공되는 제품은 보다 바람직하게는 동결건조제제와 같은 건조제제로서 제공되나, 희망에 따라 동결제제, 액상제제 등이라도 좋다.

본 발명의 헤모글로빈류의 안정화방법 및 안정화제의 일차적인 의의는 헤모글로빈류의 용액상태에 있어서의 안정성의 확보에 있다. 그 의미는 액상제제로서의 또는 건조제제나 동결제제의 용해시에 있어서의 용액상태의 헤모글로빈류의 안정성을 확보하는 것에 있다.

본 발명의 헤모글로빈류의 안정화 방법은 함황화합물을 헤모글로빈류의 안정화를 위하여 공존시키는 것이다. 함황화합물의 첨가는 제제조제시에 행하는 것이 일반적이고 간편하나, 희망에 따라 제제를 용해 후 적절히 첨가함으로써도 목적은 달성할 수 있다. 제제조제의 단계에서 함황화합물을 첨가하면, 헤모글로빈류를 주제로 하고, 함황화합물을 안정화제로서 함유한 헤모글로빈류 표준물질 또는 콘트롤물질이 제공된다. 또, 사용시에 첨가형의 제제로 하는 것이면, 주제와 함황화합물을 함유한 안정화제를 따로따로 제제로 한 키트제품으로서 제공가능하다.

함황화합물이란, SH화합물이 일반적이고, 널리 이용할 수 있다. SH화합물로서는 시스테인, 메티오닌, 시스틴 등의 함황아미노산 및 티오안식향산, 티오글리콜산, 1-티오글리세린, 티오디글리콜, 메르카프트에탄올, 글루타티온, 디티오스레이톨 등의 함황화합물 및 이들의 유연체를 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 복수를 조합하여 사용할 수 있다. 이 중에서 바람직한 화합물은 시스테인, 메티오닌, 시스틴 등의 함황아미노산 및 이들의 유연체이고, 특히 좋은 화합물은 시스테인 및 그 유연체이다.

함황화합물의 사용량은 헤모글로빈류의 1중량부에 대하여 0.01∼0.00001중량부이고, 바람직하게는 0.001∼0.0001 중량부이다. 또, 용액상태로 조제한 때의 농도로서는 2∼10중량% 농도의 헤모글로빈류에 대하여 0.01∼100mM, 바람직하게는 0.1∼10mM이다.

본 발명에 있어서 제공되는 안정성이 확보된 헤모글로빈류를 함유한 표준물질 또는 콘트롤물질은 헤모글로빈류를 함유한 조성물이라고도 할 수 있는 것이고, 그 조성물은 그 기본성분으로서의 주제 및 안정화제에 더하여 부형제, 용해시의 혼탁방지 등을 위한 pH조제제, 단백질, 당류, 고분자화합물, 무기염, 킬레이트화제 등을 희망에 따라 공지기술을 응용하여 제제조제시에 배합하거나 또는 사용시에 배합하여도 좋다.

이들의 예시로서는 pH를 5∼9로 조정할 수 있는 각종 완충액 또는 pH조제제, 알부민, 젤라틴 등의 단백질, 글리세롤, 슈크로우즈, 바람직하게는 슈크로우즈 등의 이당류, 텍스트란황산나트륨, 헤바린, 콘드로이틴황산나트륨, 텍스트란 등의 다당류, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌글리콜 등의 고분자 화합물을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한 적절히 글루코스, 말토우즈, 이노시톨, 만노우즈, 풀크토우즈, 글루시톨, 글루코노-락톤, 트레하로스, 말티톨, 라피노우즈, 만니톨 등의 당류, 염화나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화칼륨, 유산칼슘 등의 무기염, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), NTA(nitrilotriacetic acid), EDDA(ethylenediaminediacetic acid), CYDTA(trans-1, 2-D iaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acid, monohydrate), DPTA-OH(1,3-Diamino-2hydroxypropane-N,N,N',N'-tetraacetic acid), DTPA(Diethylenetriamine-N,N,N',N",N"-pentaacetic acid), EDDP(Ethylened iamine-N,N'-dipropionic acid, dihydrochloride), EDDPO, EGTA, HBED, HDTA(1,6-Hexamethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid), HIDAN-(2-IDA(Iminodiacetic acid), NTP(Nitril otriproionic acid), NTPO, TTHA(Triethylenetetramine-N,N,N',N",N ,N -hexaace tic acid) 등의 킬레이트제, α-, β-, γ-CD(cyclodextrin), 또는 이들의 CD가 히드록실프로필기 또는 디메틸기로 수식된 것, α-CD중합체, β-CD중합체, γ-CD중합체 등의 CD류를 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더 상세히 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

다음에 예시한 시약에 안정화제로서 L-시스테인을 1mM 첨가한 것 및 첨가하지 않은 것을 조제하여, 5㎖유리용기에 1㎖분주하고, 동결건조시켜 동결건조제제로 하였다. 그리고, 헤모글로빈류로서 HbA_1c, HbA_1a, HbA_1b, HbF, HbA₀를 함유한 헤모글로빈 표품을 사용하여 헤모글로빈 농도가 7%로 되로록 첨가하였다.

10mM 인산완충액 (pH 7.0)

25mM EDTAㆍ2Na

7% 헤모글로빈 표품(JML사)

25% 슈크로우즈

시험예 1

실시예 1에서 조제한 안정화제로서 L-시스테인을 함유한 및 함유하지 않은 동결건조제제를 각각 정제수 1㎖로 용해하고, 용해상태에서 25℃로 25시간 경과후의 헤모글로빈의 안정성을 비교하였다. 헤모글로빈의 측정은 577㎚에 있어서의 흡광도(O.D값)을 측정함으로써 행하였다(Methods in Enzymology, 186, 265~272). 그 결과, 표 1에 표시한 바와같이, L-시스테인의 첨가에 의하여 용액상태에서의 헤모글로빈의 충분한 안정화 효과가 확인되었다.

또, 동소-자동글리코헤모글로빈분석계 HLC-723GHbⅢ에 의하여 각 획분의 분석을 행하였는데, 크로마토그램은 변화가 없고, 각 성분이 모두 안정적이었다.

[표 1]

	0 시간	25 시간 후
L-시스테인 첨가	0.86	0.85
무첨가	0.86	0.41

실시예 2

다음에 예시한 시약에 안정화제로서 L-시스테인을 1mM 첨가한 것 및 첨가하지 않은 것을 조제하였다.

실시예 1과 똑같이 HbA_1c, HbA_1a, HbA_1b, HbF, HbA₀를 함유한 헤모글로빈 표품을 사용하여 헤모글로빈 농도가 7%로 되도록 첨가하였다.

10mM 인산완충액 (pH 7.0)

25mM EDTAㆍ2Na

7% 헤모글로빈 표품(JML사)

시험예 2

실시예 2에서 조제한 L-시스테인을 함유한 및 함유하지 않은 시약에 대하여 조제직후 및 25℃로 25시간 경과후의 헤모글로빈의 안정성을 시험예 1과 똑같은 헤모글로빈측정법으로 검토하였다. 결과는 표 2에 표시하였다. L-시스테인의 첨가에 의하여 당(슈크로우즈)의 유무에 관계없이 충분한 헤모글로빈의 안정성이 얻어졌다. 또한, 동소-자동글리코헤모글로빈분석계 HLC-723GHbⅢ에 의하여 각 획분의 분석을 행하였는데, 크로마토그램은 변화가 없고, 각 성분이 모두 안정적이었다.

[표 2]

	0 시간	25 시간후
L-시스테인 첨가	0.85	0.85
	0.85	0.43

본 발명의 함황화합물을 첨가함을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화방법 및 안정화제에 의하여 헤모글로빈이나 글리코헤모글로빈 등의 헤모글로빈류의 용액상태에 있어서의 안정성이 확보된다. 따라서, 본 발명의 헤모글로빈류의 안정화수단을 도입함으로써, 예를 들면 헤모글로빈류를 함유한 각종 임상검사 등을 위한 표준물질이나 콘트롤물질의 안정성이 향상되어 보다 확실도가 높은 검사결과를 얻을 수 있다.

이와같이, 본 발명은 임상검사 및 의약분야에 기여할 수 있는 유용한 발명이다.

Claims (12)

1. 함황화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화제.
2. 제 1항에 있어서, 용액상태의 헤모글로빈류를 안정화하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화제.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 함황화합물이 SH화합물인 헤모글로빈류의 안정화제.
4. 제 3항에 있어서, 상기 SH화합물이 시스테인, 메티오닌, 혹은 시스틴 등의 함황아미노산 또는 이들의 유연체 및 티오안식향산, 티오글리콜산, 1-티오글리세린, 티오디글리콜, 메르카프토에탄올, 글루타티온, 혹은 티오글리세롤 등의 함황화합물 또는 이들의 유연체 중에서 선택되는 1개이상의 화합물인 헤모글로빈류의 안정화제.
5. 제 3항에 있어서, 상기 SH화합물이 시스테인 또는 그 유연체인 헤모글로빈류의 안정화제.
6. 제 1항 내지 제 5항의 어느 한항에 있어서, 상기 함황화합물을 헤모글로빈류의 1중량부에 대하여 0.01∼0.00001중량부 함유한 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화제.
7. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한항에 있어서, 상기 헤모글로빈류가 헤모글로빈인 헤모글로빈류의 안정화제.
8. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한항에 있어서, 상기 헤모글로빈류가 글리코헤모글로빈인 헤모글로빈류의 안정화제.
9. 제 1항 내지 제 8항에 기재된 헤모글로빈류의 안정화제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류의 안정화방법.
10. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한항에 기재된 헤모글로빈류의 안정화제를 함유한 것을 특징으로 하는 헤모글로빈류를 함유한 조성물.
11. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한항에 기재된 헤모글로빈류의 안정화제 및 헤모글로빈류를 적어도 함유하고 있는 키트.
12. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한항에 기재된 헤모글로빈 안정화제에 있어서의 함황화합물의 사용.