WO2011058958A1 - ヘムタンパク質の安定化用組成物及びそれを用いたヘムタンパク質の安定化方法 - Google Patents

ヘムタンパク質の安定化用組成物及びそれを用いたヘムタンパク質の安定化方法 Download PDF

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haptoglobin
composition
dissociation constant
hemoprotein
hemoglobin
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光男 磯村
勉 齋藤
操治 増島
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富士レビオ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood

Definitions

  • the present invention relates to a composition for stabilizing heme protein contained in a sample such as stool and a method for stabilizing heme protein using the same.
  • the subject himself or herself often dissolves feces in a predetermined suspension and leaves it for several days. At this time, it may be exposed to high temperatures, and there is an urgent need to completely prevent denaturation / degradation of fecal hemoproteins at high temperatures.
  • Patent Document 1 a method of adding defatted albumin or a modified product thereof to a sample containing heme protein
  • Patent Document 2 a method of adding haptoglobin
  • Patent Document 3 a method of adding the animal serum
  • Patent Document 4 a method of adding non-human animal hemoglobin
  • Patent Document 5 a method of adding iron protoporphyrin, hematin, heme, hemin
  • Patent Document 7 Various additives for stabilizing heme proteins have been invented, such as a method of adding ferritin (Patent Document 6) and a method of adding ferrocyan compound (Patent Document 7).
  • a method of adding ferritin Patent Document 6
  • Patent Document 7 a method of adding ferrocyan compound
  • An object of the present invention is to provide a novel method for stabilizing a hemoprotein and a composition therefor, which are superior in the effect of stabilizing a hemoprotein in a specimen to a known method.
  • the inventors of the present application have (1) binding to haptoglobin and (2) heme protein, but the binding property is lower than that of haptoglobin and has an affinity for heme protein expressed by a dissociation constant.
  • the present inventors have found that heme protein in a sample can be highly stabilized by adding a composition containing a substance having a specific range in a specific concentration ratio to the sample, thereby completing the present invention.
  • the present invention is a composition for adding to a specimen having a possibility of containing a heme protein to stabilize the heme protein contained in the specimen, and a dissociation constant (as an affinity for haptoglobin or heme protein).
  • the present invention also provides a method for stabilizing the heme protein contained in the specimen, which comprises adding the composition of the present invention to a specimen having a possibility of containing heme protein.
  • a method for stabilizing a heme protein and a composition therefor have been provided, which are more effective in stabilizing a heme protein in a specimen than known methods.
  • the stabilization method of the present invention the heme protein in a specimen such as stool, which can be left at room temperature or a temperature higher than room temperature, is highly stabilized, particularly in occult blood tests and the like. More accurate test results can be obtained.
  • the composition of the present invention contains haptoglobin or a derivative satisfying specific properties (described later) as the first essential component.
  • Haptoglobin is a protein having a function of preventing free hemoglobin from being lost in urine by binding to free hemoglobin in blood, and its amino acid sequence is also known.
  • the amino acid sequence of human haptoglobin is described in, for example, GenBank Accession No. AAA88080. This amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a haptoglobin derivative having a dissociation constant (Kd1) of less than 10 ⁇ 9 M as an affinity for heme protein instead of or together with haptoglobin.
  • the dissociation constant for heme protein (hereinafter simply referred to as “dissociation constant”) can be measured, for example, by a known method described in Non-Patent Document Iwanami Biology Dictionary 4th Edition (Iwanami Shoten). Specifically, it can be calculated from numerical values obtained by a dialysis equilibrium method, an ELISA equilibrium method, or a protein-protein interaction measurement method.
  • the dissociation constant of human haptoglobin for human heme protein is 10 ⁇ 10 M.
  • haptoglobin As derivatives of haptoglobin, (1) a protein having a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more, with the amino acid sequence of human haptoglobin shown in SEQ ID NO: 1; (2) A protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids are substituted or deleted, or one to several amino acids are inserted or added in the amino acid sequence of human haptoglobin shown in SEQ ID NO: 1. , (3) a protein comprising the protein of (1) or (2) as a partial region, (4) Proteins of the above (1) to (3) that have been subjected to commonly used protein modification methods such as binding polyethylene glycol chains to increase stability, And the dissociation constant is less than 10 ⁇ 9 M, preferably 10 ⁇ 10 M or less.
  • sequence identity means that both amino acid sequences are aligned so that the amino acid residues of the two amino acid sequences to be compared match as much as possible. What is divided by the number of amino acid residues is expressed as a percentage.
  • a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary.
  • Such alignment of sequences can be performed using a known program such as BLAST, FASTA, CLUSTALUSW, and the like. When gaps are inserted, the total number of amino acid residues is the number of residues obtained by counting one gap as one amino acid residue.
  • the homology is the total number of amino acid residues in the longer sequence, and the number of amino acid residues matched. Is calculated by dividing.
  • the 20 amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having low side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), and neutral amino acids having hydrophilic side chains (Asn). , Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) It is known that protein properties often do not change if substitution is made between these groups.
  • the concentration of haptoglobin or a derivative thereof (the total of two or more of them) in the composition is preferably 0.01 to 0.2 ⁇ g / mL, more preferably 0.01 to 0.1 ⁇ g / mL.
  • concentration of haptoglobin or a derivative thereof is within this range, the effect of stabilizing the hemoprotein in the specimen is particularly high, which is preferable.
  • the composition of the present invention comprises, as a second essential component, a low-binding substance having a binding property to heme protein but having a binding property lower than that of haptoglobin and a dissociation constant of 10 ⁇ 9 M or more.
  • the dissociation constant of the low binding substance is 10 ⁇ 9 M or more, preferably 10 ⁇ 9 M to 10 ⁇ 5 M.
  • the amino acid sequence of bovine serum albumin is described in GenBank Accession No. CAA76847 and the like
  • the amino acid sequence of human hemopexin is described in GenBank Accession No No. AAA58678
  • the amino acid sequence of human AHSP is GenBank Accession No. It is described in NP_057717 etc. Since various commercial products are available for these proteins, commercial products may be used. However, if the dissociation constant is in the above range, other heme protein-binding proteins can be used.
  • proteins derivatives can also be used as low-binding substances in the composition of the present invention as long as the dissociation constant is 10 ⁇ 9 M or more.
  • examples of the “derivative” include those similar to (1) to (4) described above for haptoglobin (however, the reference is a known amino acid sequence of each protein).
  • albumin or a derivative thereof is preferable, and among these, mammalian (except human) serum albumin such as bovine serum albumin, for which a relatively inexpensive commercial product is available, is preferable.
  • mammalian (except human) serum albumin such as bovine serum albumin, for which a relatively inexpensive commercial product is available.
  • a heat shock method for example, Patent Document 8
  • a corn fraction V method for example, Non-Patent Document 1
  • the heat shock method is a method in which a fatty acid such as caprylic acid is added at a final concentration of 0.0075 to 0.02 M and then heated at 65 to 71 ° C. for 20 minutes or more to precipitate other proteins including antibodies and collect only serum albumin. .
  • the corn fraction V method is a method in which serum albumin is extracted with ethanol without heating.
  • serum albumin when serum albumin is used, it is preferable from the viewpoint of the effect of stabilizing the heme protein that serum albumin prepared by the corn fraction V method, which does not receive a thermal history and has no fatty acid binding, is used.
  • serum albumin prepared by the corn fraction V method is also commercially available, a commercially available product can be preferably used.
  • the composition of the present invention has a low binding substance at a molar concentration of haptoglobin or a derivative thereof (the total concentration when two or more thereof are included, the same shall apply hereinafter) of 1 dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1). Contained between the molar concentration multiplied by / 100 and the molar concentration multiplied by 100 of the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1) (hereinafter, the concentration of the low binding substance is dissociated to the molar concentration of haptoglobin or its derivative) The value multiplied by the constant ratio is sometimes referred to as “dissociation constant ratio product ratio” for convenience).
  • kd1 is the dissociation constant of haptoglobin or a derivative thereof contained in the composition (when two or more of these are included, the average dissociation constants measured by the method described in the following examples)
  • Kd2 is the dissociation constant of the low-binding substance (when two or more of these are included, the average dissociation constant measured by the method described in the examples below).
  • the concentration of the low binding substance is determined by multiplying the molar concentration of haptoglobin or its derivative by 1/100 of the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1), and multiplying it by 100 of the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1).
  • concentrations preferably between a molar concentration multiplied by 1/10 of the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1) to a molar concentration multiplied by 10 of the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1), more preferably Is between the molar concentration multiplied by 1/2 of the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1) to the molar concentration multiplied by 2 of the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1).
  • concentration of the low binding substance is within this range, a high stabilization effect of the hemoprotein can be obtained.
  • serum albumin can be preferably used as the low-binding substance, but the composition of the present invention preferably does not contain serum. Since serum contains various substances in addition to serum albumin, there is a possibility that the stabilizing effect of heme protein may be reduced by those substances, and since serum has quality variations among lots, This is not preferable because the reproducibility of the stabilizing effect of the heme protein is lowered.
  • composition of the present invention preferably further contains sodium azide and / or a protease inhibitor as an optional component in addition to the above-described essential components.
  • Sodium azide is a compound commonly used in biochemical reagent compositions as a bactericidal agent.
  • concentration of sodium azide in the composition is usually about 0.01% (w / v) to 0.5% (w / v), preferably about 0.05% (w / v) to 1% (w / v). .
  • Protease inhibitors are used to prevent degradation of haptoglobin, albumin, and the like, which are essential components of the composition of the present invention, by various proteases that may be contained in a specimen.
  • Protease inhibitors include aprotinin, urinastatin, hirudin, soybean protease inhibitor, lima bean protease inhibitor, corn protease inhibitor, gabexate mesylate, camostat mesylate, nafamostat mesylate, 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl hydrochloride Salted salmon (AEBSP), E-64, leupeptin hemisulfate-hydrate, ethylenediaminetetraacetic acid disodium dihydrogen salt (EDTA), bestatin, pepstatin A, benzamidine, phenylmethylsulfonyl fluoride, antipine, chymostatin, phosphoramidon, etc.
  • protease inhibitor cocktails in which a plurality of protease inhibitors are mixed are sold by Nacalai Tesque, Cosmo Bio, Roche, etc., and are similarly used.
  • the concentration of the protease inhibitor in the composition is usually about 0.001 ⁇ g / mL to 5 mg / mL, preferably about 0.002 ⁇ g / mL to 1 mg / mL.
  • the composition of the present invention includes an aqueous medium as a medium for dissolving the various components described above, and the aqueous medium preferably includes various buffer solutions containing physiological concentrations of sodium chloride, such as phosphate buffered saline.
  • buffer solutions include phosphate buffer solution, acetate buffer solution, citrate buffer solution, borate buffer solution, tartaric acid buffer solution, Tris buffer solution and the like.
  • the pH of the buffer is preferably neutral (about 6.5 to 7.5).
  • the composition of the present invention is added to a specimen having a possibility of containing heme protein and used to stabilize the heme protein contained in the specimen.
  • specimens include, but are not limited to, stool, urine, tears, saliva, nasal discharge, semen, and the like.
  • the composition of the present invention has a high possibility of degeneration of heme protein.
  • the specimen is collected in a specimen such as stool, urine, saliva, nasal discharge, semen, etc. It is particularly effective for stabilizing heme proteins.
  • hemoproteins include hemoglobin, myoglobin, cytochrome, catalase, and the like. Usually, many tests require stabilization of hemoglobin.
  • the amount of the composition of the present invention to be added to the specimen is appropriately selected according to the nature of the specimen and the like, but is usually about 0.001 to 0.1, preferably about 0.005 to 0.02, with respect to the specimen 1 by weight ratio. .
  • the addition may be simply by adding the liquid composition of the present invention to the specimen.
  • composition of the present invention by adding the composition of the present invention to a specimen, hemoproteins such as hemoglobin contained in the specimen are stabilized, and a more accurate test than in the past is performed. Is possible.
  • Example 1 and Comparative Example 1 (1) Preparation of fecal extraction solution 0.15M phosphate buffered saline (pH 7.2), 0.1% bovine serum albumin (Calbiochem, Corn Filaction V), 0.1 ⁇ g / mL haptoglobin (human origin, sigma Manufactured at a specified concentration of 121 ° C for 60 minutes, 0.2% (w / v) for gelatin, 0.09% (w / v) for sodium azide, and 0.0025% (w / v) for polyethylene glycol 6000 This was dissolved into a stool extraction solution.
  • Example 1 25 ⁇ L of the test solution prepared in (2) above and 25 ⁇ L of 0.2% anti-human hemoglobin antibody-sensitized magnetic particles (manufactured by Fujirebio) were added to a predetermined container, and stirred for 5 minutes with a plate mixer. Next, the container containing the test solution and the particle suspension was moved onto the magnetic table and attracted with a magnet for 1 minute. Immediately, the microplate was tilted at 60 degrees for 2 minutes, and the flow-out length of the particles was measured. The hemoglobin concentration in the specimen was calculated from a calibration curve created from the measured particle length of the flow of each standard hemoglobin solution. In Example 1, the dissociation constant ratio (Kd2 / Kd1) was 10 ⁇ 4 .
  • Examples 2 to 6 and Comparative Examples 2 to 6 (1) Preparation of test solution To the stool extraction solution of Example 1, human hemoglobin (Sigma) was added at 20 ng / mL, and haptoglobin (human origin, Sigma) was added to 0 to A test solution added with 2.5 ⁇ g / mL was prepared.
  • human hemoglobin Sigma
  • haptoglobin human origin, Sigma
  • test solution In the fecal extraction solution prepared in (1) above, human hemoglobin (manufactured by Sigma) is dissolved (or suspended) so that the stool of healthy persons is 0.3 mg / mL.
  • Example 15 It has been shown that a stabilizer for hemoglobin is effective when a mixture of haptoglobin having a high binding constant (1.00E + 10 L / mol) and serum albumin having a low binding constant (1.00E + 6 L / mol) is used.
  • the complex formation rate was calculated from the initial hemoglobin concentration, the initial haptoglobin concentration or the initial serum albumin concentration and the binding constant.
  • the molecular weight of hemoglobin is described as 64,500, and the initial hemoglobin concentration is described in Table 6-1.
  • the molecular weight of haptoglobin was 430,000, and the initial haptoglobin concentrations were 0.1 ⁇ g / ml and 0.05 ⁇ g / ml.
  • the binding constant k of haptoglobin is 1E + 10 (1 / M).
  • Reference example 1 (1) Preparation of elution solution 0.25% (w / v) gelatin 0.15M phosphate buffered saline (pH 7.2) heated at 121 ° C for 60 minutes and 0.09% (w / v) sodium azide ), 0.1% bovine serum albumin (Calbiochem, Corn Filaction V) or 0.1% bovine serum albumin (Sigma, heat shock) was added to 0.0025% (w / v) polyethylene glycol 6000 Alternatively, a solution without bovine serum albumin added was prepared and used as a stool extraction solution.

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Abstract

要約　検体中のヘムタンパク質の安定化効果が公知の方法よりも優れた新規なヘムタンパク質の安定化方法及びそのための組成物が開示されている。ヘムタンパク質を含有する可能性を有する検体に添加して同検体に含有されるヘムタンパク質を安定化するための組成物は、ハプトグロビン又はヘムタンパク質に対するアフィニティとして解離定数（Kd1）が10-9M未満であるその誘導体と、ヘムタンパク質に対するアフィニティとして解離定数(Kd1)が10-9M以上である低結合性物質を含有し、前記低結合性物質を、前記ハプトグロビン又はその誘導体のモル濃度に、解離定数比（Kd2/ Kd1)の1/100を乗じたモル濃度から、解離定数比(Kd2/Kd1)の100を乗じたモル濃度の間にて含有する。

Description

ヘムタンパク質の安定化用組成物及びそれを用いたヘムタンパク質の安定化方法
　本発明は、便などの検体中に含まれるヘムタンパク質の安定化用組成物及びそれを用いたヘムタンパク質の安定化方法に関する。
　便潜血検査では、被験者自身が自宅などで糞便を所定の懸濁液に溶解させ数日間、放置する事が多い。この際に高温にさらされる事もあり、高温下での糞便中のヘムタンパク質の変性・分解の完全な防止が急務となっている。
　ヘムタンパク質の変性・分解を防止するために、ヘムタンパク質を含有する検体中に、脱脂アルブミンまたはその修飾物を添加する方法（特許文献１）、ハプトグロビンを添加する方法（特許文献２）、ヒト以外の動物血清を添加する方法（特許文献３）などがある。
また、ヘムタンパク質の変性・分解を防止するために、ヒト以外の動物ヘモグロビンを添加する方法（特許文献４）、鉄プロトポルフィリン、ヘマチン、ヘム、へミンを添加する方法（特許文献５）、トランスフェリン、フェリチンを添加する方法（特許文献６）、フェロシアン化合物を添加する方法（特許文献７）などヘムタンパク質の安定化のためのさまざまな添加剤が発明されている。しかしながら、公知の安定化方法による検体中のヘムタンパク質の安定化効果は必ずしも満足できるものではない。
特開２００３－１９４８２５号公報 特開平１０－１３２８２４号公報 特開平４－１４５３６６号公報 特開平２－２９６１４９号公報 特開平５－２８１２２７号公報 特開平８－２６２０２０号公報 特開平１１－１６６９３２号公報 米国特許第２７６５２９９号 特許第２６８３９４４号公報
J. Am. Chem. Soc,68, 459-475,1946
　本発明の目的は、検体中のヘムタンパク質の安定化効果が公知の方法よりも優れた新規なヘムタンパク質の安定化方法及びそのための組成物を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、(1)ハプトグロビンと、(2)ヘムタンパク質との結合性を有するが、その結合性がハプトグロビンよりも低く、かつ、解離定数で表わされるヘムタンパク質に対するアフィニティが特定の範囲にある物質とを、特定の濃度比率で配合した組成物を検体に添加することにより、検体中のヘムタンパク質を高度に安定化できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、ヘムタンパク質を含有する可能性を有する検体に添加して同検体に含有されるヘムタンパク質を安定化するための組成物であって、ハプトグロビン又はヘムタンパク質に対するアフィニティとして解離定数（Kd1）が10-9M未満であるその誘導体と、ヘムタンパク質に対するアフィニティとして解離定数(Kd1)が10-9M以上である低結合性物質を含有し、前記低結合性物質を、前記ハプトグロビン又はその誘導体のモル濃度に、解離定数比（Kd2/ Kd1)の1/100を乗じたモル濃度から、解離定数比(Kd2/Kd1)の100を乗じたモル濃度の間にて含有する、ヘムタンパク質の安定化用組成物を提供する。また、本発明は、ヘムタンパク質を含有する可能性を有する検体に、上記本発明の組成物を添加することを含む、前記検体に含まれる前記ヘムタンパク質の安定化方法を提供する。
　本発明により、公知の方法よりも検体中のヘムタンパク質の安定化効果が優れた、ヘムタンパク質の安定化方法及びそのための組成物が提供された。本発明の安定化方法を適用することにより、特に、被験者が室温又は室温よりも高い温度で放置する可能性がある、便等の検体中のヘムタンパク質が高度に安定化され、潜血検査等において、より正確な検査結果が得られる。
　上記の通り、本発明の組成物は、第１の必須成分として、ハプトグロビン又は特定の性質（後述）を満足するその誘導体を含有する。ハプトグロビンは、血中の遊離ヘモグロビンと結合することにより、遊離ヘモグロビンが尿中に喪失することを防止する機能を持ったタンパク質であり、そのアミノ酸配列も知られている。ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列は、例えば、GenBank Accession No.AAA88080に記載されている。このアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
　本発明では、ハプトグロビンに代えて、又はハプトグロビンと共に、ヘムタンパク質に対するアフィニティとして解離定数（Kd1）が10-9M未満であるハプトグロビンの誘導体を用いることも可能である。ヘムタンパク質に対する解離定数（以下、単に「解離定数」と略す)は、例えば、非特許文献岩波生物学辞典第４版（岩波書店）に記載されている公知の方法により測定することが可能であり、具体的には透析平衡法、ＥＬＩＳＡ平衡法、蛋白－蛋白相互作用測定法により得られた数値から算出することができる。一般的にヒトハプトグロビンのヒトヘムタンパク質に対する解離定数は、10-10Mである。
　ハプトグロビンの誘導体としては、
(1)　配列番号１に示すヒトハプトグロビンのアミノ酸配列と、90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは99%以上の配列同一性を有するタンパク質、
(2)　 配列番号１に示すヒトハプトグロビンのアミノ酸配列において、１個～数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は１個～数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
(3)　(1)又は(2)のタンパク質を部分領域として含むタンパク質、
(4)　上記(1)～(3)のタンパク質に、ポリエチレングリコール鎖を結合して安定性を高める等の、常用されるタンパク質の修飾方法を施したもの、
であって、その解離定数が10-9M未満、好ましくは10-10M以下であるものが挙げられる。
　なお、上記(1)の誘導体に関し、「配列同一性」は、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行うことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、相同性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればタンパク質の性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、ハプトグロビン中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、ヘムタンパク質に対する解離定数が上記した要件を満足する、ヘムタンパク質に対する高親和性の誘導体が得られる可能性が高い。
　ハプトグロビン又はその誘導体（２種以上が含まれる場合にはそれらの合計)の、組成物中の濃度は、好ましくは0.01～0.2μg/mL、さらに好ましくは0.01～0.1μg/mLである。ハプトグロビン又はその誘導体の濃度がこの範囲内にあると、検体中のヘムタンパク質の安定化効果が特に高くなるので好ましい。
　本発明の組成物は、第２の必須成分として、ヘムタンパク質との結合性を有するが、その結合性がハプトグロビンよりも低く、かつ、解離定数が10-9M以上である低結合性物質を含む。低結合性物質の解離定数は、10-9M以上、好ましくは、10-9M～10-5Mである。
　このような低結合性物質の好ましい例として、アルブミン、ヘモペキシン及びαヘモグロビン安定化蛋白（AHSP）並びにそれらの誘導体から成る群から選択される少なくとも１種の物質を挙げることができる。これらのタンパク質は、いずれも周知であり、そのアミノ酸配列も周知である。例えば、ウシ血清アルブミンのアミノ酸配列は、GenBank Accession No. CAA76847等に記載されており、ヒトヘモペキシンのアミノ酸配列は、GenBank Accession No. AAA58678等に記載されており、ヒトAHSPのアミノ酸配列は、GenBank Accession No. NP_057717等に記載されている。これらのタンパク質は、種々の市販品が入手可能であるので、市販品を用いてもよい。もっとも、解離定数が上記の範囲にあれば、他のヘムタンパク質結合性タンパク質を用いることも可能である。
　これらのタンパク質の誘導体も、その解離定数が10-9M以上であれば、本発明の組成物における低結合性物質として使用することができる。ここで、「誘導体」としては、ハプトグロビンについて上記した(1)～(4)（ただし、基準となるものは各タンパク質の公知のアミノ酸配列)と同様なものを挙げることができる。
　低結合性物質としては、アルブミン又はその誘導体が好ましく、これらの中でも比較的安価な市販品が入手可能な、ウシ血清アルブミンのような哺乳動物（ヒトを除く)の血清アルブミンが好ましい。なお、血清アルブミンの調製方法としては、ヒートショック法(例えば、特許文献８）と、コーン・フラクションV法（例えば非特許文献１）が知られている。ヒートショック法は、脂肪酸、例えばカプリル酸を終濃度0.0075M～0.02M加えた後、６５～７１℃で２０分間以上加熱し、抗体を含め他の蛋白を沈殿させ血清アルブミンのみ回収する方法である。一方、コーン・フラクションV法は、加熱を行うことなくエタノールで血清アルブミンを抽出する方法である。本発明において、血清アルブミンを用いる場合、熱履歴を受けておらず、脂肪酸の結合もない、コーン・フラクションV法により調製された血清アルブミンを用いることが、ヘムタンパク質の安定化効果の観点から好ましい。コーン・フラクションV法により調製された血清アルブミンも市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。
　本発明の組成物は、低結合性物質を、ハプトグロビン又はその誘導体のモル濃度（これらが２種以上含まれる場合にはその合計濃度、以下同じ）に、解離定数比（Kd2/ Kd1)の1/100を乗じたモル濃度から、解離定数比(Kd2/Kd1)の100を乗じたモル濃度の間にて含有する（以下、低結合性物質の濃度が、ハプトグロビン又はその誘導体のモル濃度に解離定数比を乗じた値を便宜的に「解離定数比濃度積倍率」と呼ぶことがある）。ここで、kd1は、組成物中に含まれるハプトグロビン又はその誘導体の解離定数（これらが２種以上含まれる場合には、下記実施例に記載の方法により測定される、それらの平均的な解離定数）、kd2は、低結合性物質の解離定数（これらが２種以上含まれる場合には、下記実施例に記載の方法により測定される、それらの平均的な解離定数）である。低結合性物質の濃度は、ハプトグロビン又はその誘導体のモル濃度に、解離定数比（Kd2/ Kd1)の1/100を乗じたモル濃度から、解離定数比(Kd2/Kd1)の100を乗じたモル濃度の間であり、好ましくは、解離定数比（Kd2/ Kd1)の1/10を乗じたモル濃度から、解離定数比(Kd2/Kd1)の10を乗じたモル濃度の間であり、さらに好ましくは解離定数比（Kd2/ Kd1)の1/2を乗じたモル濃度から、解離定数比(Kd2/Kd1)の2を乗じたモル濃度の間である。低結合性物質の濃度がこの範囲内にあると、ヘムタンパク質の高い安定化効果が得られる。
　なお、上記のとおり、低結合性物質として血清アルブミンを好ましく採用することができるが、本発明の組成物は血清を含まないことが好ましい。血清は、血清アルブミンの他に種々の物質を含んでいるので、それらの物質によりヘムタンパク質の安定化効果が低減される恐れがあり、また、血清は、ロット間で品質のバラツキがあるため、ヘムタンパク質の安定化効果の再現性が低くなるので好ましくない。
　本発明の組成物は、上記した必須成分に加え、さらに任意成分として、アジ化ナトリウム及び／又はプロテアーゼインヒビターをさらに含むことが好ましい。アジ化ナトリウムは、殺菌剤として、生化学関連の試薬組成物に常用されている化合物である。アジ化ナトリウムの組成物中の濃度は、通常、0.01% (w/v) ～ 0.5% (w/v)程度、好ましくは0.05% (w/v) ～ 1% (w/v)程度である。
　プロテアーゼインヒビターは、検体中に含まれる可能性がある各種プロテーアーゼにより、本発明の組成物の必須成分であるハプトグロビンやアルブミン等が分解されることを防止するために用いられる。プロテアーゼインヒビターとしては、アプロチニン、ウリナスタチン、ヒルジン、ダイズプロテアーゼインヒビター、リマ豆プロテアーゼインヒビター、トウモロコシプロテアーゼインヒビター、メシル酸ガベキサート、メシル酸カモスタット、メシル酸ナファモスタット、フッ化4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニル塩酸塩 (AEBSP)、E-64、ロイペプチンヘミ硫酸塩－水和物、エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム (EDTA)、ベスタチン、ペプスタチンA、ベンズアミジン、フッ化フェニルメチルスルホニル、アンチパイン、キモスタチン、ホスホラミドン、等を例示することができる。また、複数のプロテアーゼインヒビターを混ぜ合わせたプロテアーゼインヒビターカクテルがナカライテスク、コスモバイオ、ロシュ等から販売されており、同様に用いられる。プロテアーゼインヒビターの組成物中の濃度は、通常、0.001μg/mL～5mg/mL程度、好ましくは0.002μg/mL～1mg/mL程度である。
　本発明の組成物は、上記した各種成分を溶解する媒体として、水系媒体を含み、水系媒体としては、好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水等の、生理的濃度の食塩を含む各種緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液の他に、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液等を例示することができる。緩衝液のpHは、中性(6.5～7.5程度）が好ましい。
　本発明の組成物は、ヘムタンパク質を含有する可能性を有する検体に添加して同検体に含有されるヘムタンパク質を安定化するために用いられる。このような検体の例としては、便、尿、涙液、唾液、鼻汁、精液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明の組成物は、これらの検体のうち、ヘムタンパク質の変性の可能性が高い、被験者が自分で採取して室温下に放置する、便、尿、唾液、鼻汁、精液等の検体中のヘムタンパク質の安定化に特に威力を発揮する。また、ヘムタンパク質としては、ヘモグロビン、ミオグロビン、シトクロム、カタラーゼ等を挙げることができ、通常、多くの検査では、ヘモグロビンの安定化が求められる。
　本発明の組成物の、検体に対する添加量は、検体の性質等に応じて適宜選択されるが、重量比で検体１に対して通常、0.001～0.1程度、好ましくは、0.005～0.02程度である。添加は、液状である本発明の組成物を検体に単に添加するだけでよい。
　下記実施例に具体的に記載するように、本発明の組成物を、検体に添加することにより、検体中に含まれるヘモグロビン等のヘムタンパク質が安定化され、従来と比較してより正確な検査が可能になる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１、比較例１
(1)　便抽出用溶液の調製
　0.15M リン酸緩衝生理食塩液（pH7.2）に、0.1%ウシ血清アルブミン（カルビオケム社製、コーン フィラクションV）、0.1μg/mLハプトグロビン（ヒト由来、シグマ社製）を所定濃度、121℃、60分間加熱処理したゼラチンを0.2%（w/v）、アジ化ナトリウムを0.09%（w/v）、ポリエチレングリコール6000を0.0025%（w/v）となるように溶解し、これを便抽出用溶液とした。
(2)　被検液の調製
　上記(1)で調製した便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を40ng/mL、健常人の糞便を0.3mg/mLとなるように溶解（又は懸濁）し、当日（０日）、30℃及び35℃で3日又は7日間保存したものを被検液とした。
(3)　測定方法
　被検液中のヒトヘモグロビンを、市販の抗ヒトヘモグロビン抗体感作磁性粒子を用いた凝集法により測定した。この方法は、例えば特許文献９に記載されている公知の方法であり、市販のキットを用いて実施可能である。被検液中のヒトヘモグロビンと抗ヒトヘモグロビン抗体感作磁性粒子とを抗原抗体反応させた後、粒子を磁力によりマイクロプレートのウェルの底部に集め、プレートを傾斜させた際の粒子塊の状態の変化を判定する方法である。被検液中にヒトヘモグロビンが含まれる場合には、抗原抗体反応により粒子の凝集が起き、プレートを傾斜させた際に粒子塊の状態はほとんど変化せず点状に残り、一方、被検液中にヒトヘモグロビンが含まれない場合には、抗原抗体反応により粒子の凝集が起きないので粒子塊が流れ出す。この粒子塊の流れ出し状態が被検液中に含まれるヒトヘモグロビンの量と相関するため、これを指標として被検液中のヒトヘモグロビンを定量するものである。被検液中のヒトヘモグロビンの量が少ないほど、アッセイカウントが大きくなる。
　上記(2)で調製した被検液25μLと0.2％抗ヒトヘモグロビン抗体感作磁性粒子（富士レビオ社製）25μLを所定の容器に加え、プレートミキサーで５分間、攪拌を行った。次に被検液と粒子の懸濁液の入った容器を磁石台の上に移動させ1分間、磁石吸引した。直ちにマイクロプレートを６０度で２分間傾斜させ粒子の流れ出し長を測定した。各標準ヘモグロビン溶液の流れ出しの測定粒子長から作成された検量線から検体中のヘモグロビン濃度を算出した。なお、実施例１では、解離定数比(Kd2/Kd1)は10-4であった。
(4)　結果
　結果を下記表１に示す（カットオフ値は208とした）。ウシ血清アルブミン及びハプトグロビンを含まない被検液の場合には３０℃及び３５℃いずれも３日以上でカウントが上昇し、陰性と判断された。ウシ血清アルブミン及びハプトグロビンを含む被検液の場合には３０℃及び３５℃いずれも７日でもカウントは上昇せず陽性のままであった。ウシ血清アルブミンにハプトグロビンを添加することで糞便中のヘモグロビンの安定性が向上し、ウシ血清アルブミン添加だけでは到達できない効果が見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２～６、比較例２～６
(1)　被検液の調製
　実施例1の便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を20ng/mLとなるように添加した溶液に、ハプトグロビン（ヒト由来、シグマ社製）を0～2.5μg/mL添加した被検液を調製した。
(2)　測定方法
　実施例１と同様に行った。
結果
　結果を下記表２に示す。本ヘモグロビン測定においてハプトグロビン濃度が０～0.16μg/mLではアッセイカウントは上昇せず陽性のままであったがハプトグロビン濃度が0.31μg/mL以上ではアッセイカウントは上昇し陰性と判断された。過剰のハプトグロビンの添加によって本測定系自体が抑制されたと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
(1)　抽出用溶液の調製
　0.15M リン酸緩衝生理食塩液（pH7.2）に、０．１％ウシ血清アルブミン（カルビオケム社製、コーン フィラクションV）、ハプトグロビン（ヒト由来、シグマ社製）濃度を０．２μg/mLまで濃度を変え、121℃60分間加熱処理したゼラチンを0.2%（w/v）、アジ化ナトリウムを0.09%（w/v）、ポリエチレングリコール6000を0.0025%（w/v）となるように溶解し、これを便抽出用溶液とした。
実施例７～１２、比較例７、８
(2)　被検液の調製
　上記(1)で調製した便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を40ng/mL、健常人の糞便を0.3mg/mLとなるように溶解（又は懸濁）した溶液または上記(1)で調製した便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を40ng/mLのみで糞便なしの溶液を、当日（０日）、35℃で3日又は7日間保存したものを被検液とした。
(3)　 測定方法
　実施例１と同様に行った。
結果
　結果を下記表３に示す。ハプトグロビン添加によって、いずれのハプトグロビン濃度（0.05μg/mLから0.2μg/mL）であっても糞便有無に関わらず、35℃7日でもカウントが上昇せず陽性のままであった。糞便中のヘモグロビンの安定性だけでなく便抽出液自体の安定性も少なくとも35℃７日までは向上させることができた。ハプトグロビン添加の効果が見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例１３、１４、比較例９，１０
(1)　抽出用溶液の調製
　0.15M リン酸緩衝生理食塩液（pH7.2）に、ハプトグロビン（ヒト由来、シグマ社製）濃度０．１μg/mL、121℃60分間加熱処理したゼラチンを0.2%（w/v）、アジ化ナトリウムを0.09%（w/v）、ポリエチレングリコール6000を0.0025%（w/v）に0.1%ウシ血清アルブミン（カルビオケム社製、コーン フィラクションV）またはウシ血清アルブミンを添加しない溶液を作製し、これを便抽出用溶液とした。
(2)　被検液の調製
　上記(1)で調製した便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を40ng/mL、健常人の糞便を0.3mg/mLとなるように溶解（又は懸濁）した溶液、または上記(1)で調製した便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を40ng/mLのみで糞便なしの溶液を、当日（０日）、35℃で3日又は7日間保存したものを被検液とした。
(3)　 測定方法
　実施例１と同様に行った。
結果
　結果を下記表４に示す。便抽出液をハプトグロビンのみに添加した場合、糞便無しの３５℃７日でアッセイカウントが上昇し陰性判定となり、ハプトグロビンだけでは便抽出液自体の劣化がみられた。ハプトグロビンだけでなく、ウシ血清アルブミンも添加した場合、糞便有無に関わらず、35℃7日でもカウントが上昇せず陽性のままであり、糞便中のヘモグロビンの安定性だけでなく便抽出液自体の安定性も向上させることができた。糞便中のヘモグロビン安定性および便抽出液自体の安定性にはハプトグロビンとフラクションＶウシ血清アルブミンの両方の添加が必要であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１５
　ヘモグロビンに対する安定化剤は結合定数の高い（１．００Ｅ＋１０　L/mol）ハプトグロビンと結合定数の低い（１．００Ｅ＋６　L/mol）血清アルブミンを混合して用いた場合に効果があることを示した。以下に初期ヘモグロビン濃度、初期ハプトグロビン濃度または初期血清アルブミン濃度及び結合定数から複合体形成率を算出した。なお、ヘモグロビンの分子量は６４，５００、初期ヘモグロビン濃度は表６－１に記載した。ハプトグロビンの分子量は４３０，０００、初期ハプトグロビン濃度は０．１μg/ml及び０．０５μg/mlとした。ハプトグロビンの結合定数ｋは１Ｅ＋１０（１/Ｍ）とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
結果
　糞便中のヘモグロビンの安定化に非常に強く寄与するハプトグロビン濃度を０．１μg/mLとした場合、便中ヘモグロビン濃度に従って複合体結合率は３０～６４％まで動いた。また、ハプトグロビンの５０％が活性低下または他の物質と結合した場合も、複合体結合率は１６～４５％と動いた。なお、ヘモグロビンの分子量は６４，５００、初期ヘモグロビン濃度は表６－１に記載した。血清アルブミンの分子量は６８，０００、初期ハプトグロビン濃度は１mg/mlとした。血清アルブミンの結合定数ｋは１Ｅ＋６（１/Ｍ）とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
結果
　糞便中のヘモグロビンの安定化に寄与する血清アルブミン濃度を０．１％（１mg/mL）とした場合、便中ヘモグロビン濃度にかかわらず複合体結合率は９４％とほぼ変わらなかった。
　糞便中のヘモグロビン安定化に寄与するハプトグロビン及び血清アルブミンを混合して用いた場合にはヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体かヘモグロビンと血清アルブミンとの複合体が形成されていると思われる。極端にいずれかの複合体のみが多くなった場合には単独の安定化剤の効果になってしまうことが想定される。よって、両者の結合定数と使用濃度を勘案する必要がある。
参考例１
(1)　溶出用溶液の調製
　0.15M リン酸緩衝生理食塩液（pH7.2）に、121℃60分間加熱処理したゼラチンを0.2%（w/v）、アジ化ナトリウムを0.09%（w/v）、ポリエチレングリコール6000を0.0025%（w/v）に０．１％ウシ血清アルブミン（カルビオケム社製、コーン フィラクションV）または０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製、ヒートショック）を添加した、またはウシ血清アルブミン未添加の溶液を作製し、これを便抽出用溶液とした。
(2)　被検液の調製
　上記(1)で調製した便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を40ng/mL、健常人の糞便を0.3mg/mLとなるように溶解（又は懸濁）した溶液または上記(1)で調製した便抽出用溶液に、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）を40ng/mLのみで糞便なしの溶液を、当日（０日）、35℃で3日又は7日間保存したものを被検液とした。
(3)　 　 測定方法
　実施例１と同様に行った。
結果
　結果を下記表６に示す。血清アルブミン未添加便抽出液に比べ、ヒートショック法ウシ血清アルブミンの添加によって糞便（－）の35℃３日におけるアッセイカウントの上昇が抑えられた。さらに、フラクションVウシ血清アルブミンにすることで35℃3日でのアッセイカウントの上昇が抑えられ陽性判定となった。フラクションVウシ血清アルブミンはヒートショック法ウシ血清アルブミンと比較して効果が見られた。糞便中のヘモグロビンの安定性だけでなく便抽出液自体の安定性も向上させることができた。しかしいずれの条件でも35℃、7日ではアッセイカウントが上昇し、いずれも陰性判定となっており、フラクションＶ血清アルブミンのみでは糞便中のヘモグロビンの安定性だけでなく便抽出液自体の安定性は不十分であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (9)

  1. 　ヘムタンパク質を含有する可能性を有する検体に添加して同検体に含有されるヘムタンパク質を安定化するための組成物であって、ハプトグロビン又はヘムタンパク質に対するアフィニティとして解離定数（Kd1）が10-9M未満であるその誘導体と、ヘムタンパク質に対するアフィニティとして解離定数(Kd1)が10-9M以上である低結合性物質を含有し、前記低結合性物質を、前記ハプトグロビン又はその誘導体のモル濃度に、解離定数比（Kd2/ Kd1)の1/100を乗じたモル濃度から、解離定数比(Kd2/Kd1)の100を乗じたモル濃度の間にて含有する、ヘムタンパク質の安定化用組成物。
  2. 　前記ハプトグロビン又はその誘導体を、0.01～0.2μg/mLの濃度範囲で含有する請求項１記載の組成物。
  3. 　ハプトグロビンを含有する請求項１又は２記載の組成物。
  4. 　前記低結合性物質が、アルブミン、ヘモペキシン及びαヘモグロビン安定化蛋白（AHSP）並びにそれらの誘導体から成る群から選択される少なくとも１種の物質である請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 　前記低結合性物質が、アルブミンである請求項４記載の組成物。
  6. 　前記アルブミンが、コーン・フラクションV法によって調製されたウシ血清アルブミンである請求項５記載の組成物。
  7. 　血清を含まない請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 　アジ化ナトリウム及び／又はプロテアーゼインヒビターをさらに含む請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 　ヘムタンパク質を含有する可能性を有する検体に、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物を添加することを含む、前記検体に含まれる前記ヘムタンパク質の安定化方法。
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