JP2023540193A - ヘモペキシン：ヘム複合体の検出に使用するためのｃｄ９１ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の検出および数量化のためのＣＤ９１ポリペプチドの使用、生体試料からのヘモペキシン：ヘム複合体の分離のためのＣＤ９１ポリペプチドの使用、ならびにＣＤ９１ポリペプチドを使用する溶血治療の監視に関する。【選択図】図２

Description

本発明は、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の検出および数量化のためのＣＤ９１ポリペプチドの使用、生体試料からのヘモペキシン：ヘム複合体の分離のためのＣＤ９１ポリペプチドの使用、ならびにＣＤ９１ポリペプチドを使用する溶血治療の監視に関する。

溶血は、赤血球の破壊を特徴とし、赤血球異常に関連する貧血性障害、例えば、酵素欠損症、異常ヘモグロビン症、遺伝性球状赤血球症、発作性夜間ヘモグロビン尿症および棘細胞性貧血、ならびに外的要因、例えば、脾腫、自己免疫障害（例えば、新生児溶血性疾患）、遺伝性障害（例えば、鎌状赤血球症またはＧ６ＰＤ欠損症）、微小血管障害性溶血、グラム陽性菌感染症（例えば、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ））、寄生虫感染症（例えば、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ））、毒素および外傷（例えば、熱傷）の顕著な特徴である（非特許文献１）。溶血はまた、輸血、特に大量輸血のおよび体外心肺補助装置を使用している患者における、一般的な障害である（非特許文献２）。

溶血に関連する状態を有する患者に見られる有害作用は、赤血球からの鉄および鉄含有化合物、例えば、ヘモグロビン（Ｈｂ）およびヘムの放出に大いに起因する（非特許文献３）。生理的条件下では、放出されたヘモグロビンは、可溶性タンパク質、例えば、ハプトグロビンによって結合され、マクロファージおよび肝細胞に輸送される（非特許文献４および非特許文献５）。しかし、溶血の発生が加速され、本質的に病的になる場合、ハプトグロビンの緩衝能力が圧倒される（非特許文献６）。その結果、ヘモグロビンは急速に酸化されてフェリヘモグロビンとなり、これが次に遊離フェム（プロトポルフィリンＩＸおよび鉄を含む）を放出する。ヘムはいくつかの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす（例えば、ヘモグロビンおよびミオグロビンなどの必須タンパク質の一部として）が、遊離ヘムは非常に有毒である。遊離ヘムは酸化還元活性鉄の供給源であり、脂質膜、タンパク質および核酸に損傷を与える毒性の高い反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成する（非特許文献７）。ヘム毒性は、脂質膜にインターカレートするその能力によってさらに悪化し、膜成分の酸化を引き起こして、細胞溶解および細胞死を促進する。生理学的な定常状態条件下および軽度の溶血中に、継続的な低レベル細胞外Ｈｂ／ヘム曝露の進化圧が、遊離Ｈｂ／ヘムの有害作用を制御する代償メカニズムをもたらしている。これらの系は、Ｈｂスカベンジャーであるハプトグロビン（Ｈｐ）ならびにヘムスカベンジャータンパク質であるヘモペキシン（Ｈｐｘ）およびα１－ミクログロブリンを含む、Ｈｂまたはヘムに結合する血漿タンパク質の群の放出を含む。

血漿および脳脊髄液中の主なヘム結合タンパク質はヘモペキシンである。したがって、ヘモペキシンは、細胞に対するヘムの悪影響に対する重要な防御である。線形ではないが有意な関係性で、複合体においてヘモペキシンによってヘムが結合されると、ヘモペキシン：ヘム複合体が、肝細胞、マクロファージ、合胞体栄養細胞を含むさまざまな細胞によって、受容体媒介メカニズムによって細胞内に取り込まれ、複合体はリソソームで分解される。ヘモペキシン：ヘム複合体の受容体タンパク質はＣＤ９１タンパク質である（非特許文献８）。

表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）９１（ＣＤ９１）（非特許文献９および非特許文献１０）は、とりわけ、プロ低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（略して：ＬＲＰ１）、アルファ－２－マクログロブリン受容体（Ａ２ＭＲ）またはアポリポタンパク質Ｅ受容体（ＡＰＯＥＲ）としても知られ、非特許文献１１に初めて記載された。ヒトプレプロタンパク質は６００ｋＤａの前駆体タンパク質であり、フューリンによってタンパク質分解性にプロセシングされて、非共有結合的に会合した５１５ｋＤａのアルファ鎖と８５ｋＤａのベータ鎖（ＳＤＳによって特定）となる。一次アミノ酸配列に基づく総タンパク質の分子量は５０４，６０６ｋＤａである。これは、マクロファージ、肝細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、ニューロン、血管平滑筋細胞および合胞体栄養細胞を含む広範囲の細胞型で、最も豊富には血管平滑筋細胞、肝細胞およびニューロンで発現される。ＣＤ９１オルソログは脊椎動物に見られ、そのヌクレオチドおよびアミノ酸構造が多くの種について解明されている。

タンパク質の低密度リポタンパク質受容体ファミリー（ＬＤＬＲファミリー）のメンバーとして、ＣＤ９１は、システインリッチな補体型リガンド結合リピート、上皮増殖因子前駆体型リピート（ＥＧＦリピート）、β－プロペラドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ＣＤ９１の細胞外ドメインはアルファ鎖であり、それぞれ２、８、１０および１１個のリピートを含む４つの「リガンド結合ドメイン」（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと番号付けされている）に配置された３１個のシステインリッチな補体型リガンド結合リピートを含む。リガンド結合ドメインは、細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤複合体およびリポタンパク質代謝に関与する他のタンパク質を含む、様々なリガンドを結合する。４つのドメインのうち、ドメインＩＩおよびＩＶはリガンドの大部分を結合する（非特許文献１２）。システインは、リガンド結合ドメインの安定性に重要と考えられている分子内ジスルフィド結合を形成する。システインリッチなＥＧＦリピートの２２個のコピーがリガンド結合ドメインに隣接している。ＥＧＦリピートおよびβープロペラドメインは、エンドソーム内などの低ｐＨ条件においてリガンドを放出する働きをし、β－プロペラドメインはリガンド結合リピートにおいてリガンドに取って代わると推論されている。膜貫通ドメインは、１００残基の細胞質テールを含むβ鎖である。このテールは、エンドサイトーシスおよびシグナル伝達における機能を担う２つのＮＰｘＹモチーフを含む。

ＣＤ９１は、細胞内シグナリングおよびエンドサイトーシスにおいて重要な役割を果たし、したがって、脂質およびリポタンパク質の代謝、プロテアーゼ分解、血小板由来増殖因子受容体の調節、インテグリンの成熟および再循環、血管緊張の調節、血液脳関門透過性の調節、細胞増殖、細胞遊走、炎症ならびにアポトーシスを含む多くの細胞内プロセスおよび生物学的プロセス、ならびに疾患、例えば、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症およびがんに関連付けられている（非特許文献１３および非特許文献１４）。

ＣＤ９１タンパク質はまた、受容体タンパク質として、肝細胞、マクロファージおよびニューロンを含むさまざまな細胞において、受容体媒介メカニズムによるヘモペキシン：ヘム複合体のエンドサイトーシスに関与し、細胞へのヘム取込およびリソソームでのヘモペキシン分解につながり、したがって、血液から危険なヘムを排除する。ＣＤ９１は、最も高い親和性を有するヘモペキシン：ヘム複合体の受容体として公知である（非特許文献１５）。

内因性ヘモペキシンは、生理学的な定常状態条件下においては遊離ヘムの有害作用を制御できるが、病態生理学状態、例えば、溶血に関連する状態では定常状態のヘムレベルを維持することにはほとんど効果がなく、高レベルのヘムは内因性ヘモペキシンの枯渇をもたらし、ヘム媒介性酸化的組織損傷を引き起こす。ヘモペキシン注入が、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびβ－サラセミアなどの溶血性障害の実験的マウスモデルにおいて、ヘム誘導性内皮活性化、炎症および酸化的傷害を軽減することが、研究により示されている。ヘモペキシン投与はまた、炎症誘発性サイトカインのレベルを有意に低減し、溶血動物のヘム誘導性血管収縮を相殺することが示されている（非特許文献１６および非特許文献１７）。

病態生理学的状態で放出されるヘムの複合体形成には、ヘムの複合体形成およびその有害な影響の補償のために、ヘモペキシンの追加投与が必要であり得るため、ヘモペキシン：ヘム複合体の検出および対象におけるその量の決定が最重要である。

Ｓｃｈａｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２０１３年；１２１（８）：１２７６～８４頁 Ｒｅｚｏｇａｌｉら、Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ． Ｖａｓｃ． Ａｎｅｓｔｈ．、２０１７年；３１（２）：５０５～１５頁 Ｂｕｅｈｌｅｒら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２００４年；４４（１０）：１５１６～３０頁 Ｓｃｈａｅｒら、Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１４年；５：４１５頁 Ａｌａｙａｓｈら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１３年；３１（１）：２～３頁 Ｍｕｌｌｅｒ－Ｅｂｅｒｈａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ、１９６８年；３２（５）：８１１～５頁 Ｒｏｕｍｅｎｉｎａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．、２０１６年；２２（３）：２００～１３頁 Ｈｖｉｄｂｅｒｇら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年；１０６（７）：２５７２～９頁 Ｌｉｌｌｉｓら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．、２００８年；８８（３）；８８７～９１８頁 Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．、２０１４年；３４（３）：４８７～９８頁 Ｈｅｒｚら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８８年；７（１３）：４１１９～２７頁 Ｋａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２０１４年；５３：１５～２３頁 Ｌｉｌｌｉｓら、Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ．、２００５年；３（８）：１８８４～９３頁 Ｓｍｉｔｈら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１９９７年；２３２：２４６～５４頁 Ｈａｄａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、２０１４年；１８４０（７）：２３５１～６０頁 Ｂｅｌｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２０１４年；１２３（３）：３７７～９０頁 Ｂｅｌｃｈｅｒら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１８年；１３（４）：ｅ０１９６４５５

しかし、これまで、好適な検出剤は見出されていない。ＣＤ９１は、ヘモペキシン：ヘム複合体への親和性が高いため、溶血に関連する状態を有する対象の試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の検出および数量化に好適な薬剤であるが、ＣＤ９１タンパク質はサイズが大きいため、取り扱いが難しい。例えば、組換え産生は、タンパク質のサイズが大きいことを考慮すると、可能でないか、または悪化した条件下でしか可能でない。他方、タンパク質の単なる単離および精製では、検出剤としての複雑でない使用に十分な収量が得られない。したがって、ヘモペキシン：ヘム複合体の効率的な検出を可能にするヘモペキシン：ヘム複合体の検出剤、ならびに効率的な検出剤を高収量で簡単に、迅速にかつコスト効率よく生成することが必要とされている。

本発明は、ヘモペキシン：ヘム複合体に高親和性で結合するＣＤ９１ポリペプチドを提供することによって、この課題を解決する。

以下において、本発明を詳述する。本発明の特徴を、個々の段落または節において説明する。しかし、これは、段落または節において説明される特徴が、他の段落または節において説明される１つまたはそれ以上の特徴から切り離されていることを意味するものではない。むしろ、段落または節において説明される特徴は、他の段落または節において説明される１つまたはそれ以上の特徴と組み合わされることが可能である、さらに、段落または節において説明される特徴の意味は、同じ特徴が別の段落または節において別の文脈で言及されている場合にも、適用可能である。

本明細書中で使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ／ｅｓ／ｉｎｇ）」という用語は、開示された特徴と具体的に述べられていないさらなる特徴とを「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）または網羅する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ））ことを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ／ｅｓ／ｉｎｇ）」という用語はまた、示された特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ／ｓ／ｉｎｇ ｏｆ）という意味で、したがって示された特徴以外のさらなる特徴を含まないという意味で、意味される。したがって、本発明の産物は、示されている特徴に加えて追加の特徴を特徴とすることもできる。

第１の態様において、本発明は、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の検出のためのＣＤ９１ポリペプチドの使用であって、ＣＤ９１ポリペプチドが、３００～１０００アミノ酸長を有し、かつヘモペキシン：ヘム複合体に結合できるＣＤ９１のリガンド結合ドメインＩＩＩまたはその断片を含むまたはそれからなる、使用を提供する。

本発明はさらに、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体を検出するためのインビトロの方法であって、本発明の文脈で使用されるＣＤ９１ポリペプチドと共に生体試料をインキュベートする工程と、ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との結合を検出する工程とを含む、方法を提供する。

本発明はさらに、溶血または溶血に関連する状態を治療する方法において使用するための、本発明の文脈で使用されるＣＤ９１ポリペプチドを提供する。

本発明はさらに、本発明の文脈で使用されるＣＤ９１ポリペプチドを含むキットを提供する。

本発明はさらに、本発明の文脈で使用されるＣＤ９１ポリペプチドが連結されている固体支持体を提供する。

Ｈｉｓタグ付きタンパク質と標的分析物との相互作用の動態キャラクタライゼーションのワークフロー例を示す図である。アッセイは、５つのアッセイ工程からなる。工程１：平衡化、工程２：Ｈｉｓタグ付きタンパク質のロード（捕捉）、工程３：ベースライン、工程４：分析物の会合、工程５：分析物の解離。さらなる詳細については、ＴｅｃｈＮｏｔｅ ４３（６）を参照されたい。 ｈｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体（５）を示す略図である。４つの可溶性ミニ受容体のそれぞれを、全長内因性ｈｕｌＲＰ１と比較して図示する。４つの推定上のリガンド結合ドメインに、数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと名前を付けてある。 ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞におけるｈｕＬＲＰ１ミニ受容体の発現および精製を示す図である。（Ａ）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞において産生された、結合ドメインＩ～ＩＶ（ゲルの上部に表示）をコードするｈｕＬＲＰ１ミニ受容体のクーマシー染色還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ｈｕＬＲＰＡＰ１（ＲＡＰ）（＋）を同時発現させると、発現レベルの相対的増加が認められる。（Ｂ）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞において産生された、結合ドメインＩ～ＩＶ（ゲルの上部に表示）をコードするｈｕＬＲＰ１ミニ受容体の還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥの抗Ｈｉｓウエスタンブロットを示す図である。（Ｃ）タンデムニッケル－サイズ排除クロマトグラフィーによって精製された、結合ドメインＩ～ＩＶ（ゲルの上部に表示）をコードするｈｕＬＲＰ１ミニ受容体のクーマシー染色還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。 ヘム－ｈｘ複合体を結合する能力に関して分析されたＬＲＰ１ドメインのそれぞれの代表的なセンサーグラムを示す図である。個々のＬＲＰ１ドメインを、バイオセンサー表面に固定化した。ベースラインの記録後に、４つの濃度のヘム－ｈｐｘ複合体を試験した（２．５、１．２５、０．６２５、および０．３１２μＭ）。ＬＲＰ１．３については、参照減算および処理した動態データセットを、１：１結合モデルを使用して全体的にフィットさせた。フィッティングの正確度を、表５に示すＣｈｉ^２およびＲ^２によって記載した。ヘム－ｈｐｘを赤い曲線、黒い実線としての近似曲線で示す。ＬＲＰ１．１、ＬＲＰ１．２、ＬＲＰ１．４、ＬＲＰ１．５はフィットさせなかった。 図４－１の続き。 図４－２の続き。 ４つのＬＲＰ１ドメイン全てについての、手動ランから得られた代表的なセンサーグラムを示す図である。ポリクローナル抗ヘモペキシンを、その後のヘム－Ｈｐｘ捕捉工程でＣＭ５に固定。（Ａ）ＬＲＰ１ドメイン３および（Ｂ）ドメイン２を分析物として１０μＭで使用。（Ｃ）ヘム－Ｈｐｘの代わりに、非結合Ｈｐｘを、陰性対照として、分析物（１０μＭ）としてのＬＲＰ１ドメイン３で捕捉した。センサーグラム全て、参照減算してある。 図５－１の続き。 定性的ヘモペキシン捕捉アッセイを示す図である。（Ａ）アッセイセットアップの略図。（Ｂ）ＬＲＰ１．３のヘム－ｈｘ複合体への結合の代表的なセンサーグラム。用量依存的結合を示している。 ヘム－ｈｐｘとＬＲＰ１．３との相互作用のＳＰＲセンサーグラムを示す図である。（Ａ）アッセイセットアップの略図。（Ｂ）ヘム－ｈｐｘ複合体および（Ｃ）ＬＲＰ１．３へのヘモペキシンの結合の欠如の代表的なセンサーグラム。（Ｄ）ＬＲＰ１．３へのヘム－ｈｘ複合体結合の定常状態１：１フィット、および（Ｅ）わずかな負の協同的相互作用を示す各スキャッチャードプロット。 種々のバッチのヘム－ｈｐｘ複合体の代表的なセンサーグラムおよび各定常状態フィット。（Ａ）Ｈｐｘバッチ：ＴＯ４１１１２２、（Ｂ）Ｈｐｘバッチ：ＴＯ３４１０２２ＢＭ（「新」）、および（Ｃ）Ｈｐｘバッチ：ＬＲＰ１．３に結合したＴＯ３４２０２２Ｂ（「エイジング」）。 ヘモペキシン：ヘムアッセイが、ヘムに結合したヘモペキシン（ヘモペキシン：ヘム）に特異的であり、遊離ヘモペキシン（ヘモペキシン）には結合しないことを示すグラフである。ヘモペキシン：ヘム複合体または遊離ヘモペキシンのいずれかを使用して、７点標準曲線を作成した。

以下において、本発明について説明する。

本発明の文脈において、驚くべきことに、ＣＤ９１のリガンド結合ドメインＩＩＩ（ＬＰＲ１）はヘモペキシン：ヘム複合体に結合するが、ヘモペキシン単独には結合しないことが判明した（実施例１を参照のこと）。これにより、血液中および他の生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の特定のためのその使用が可能になる（実施例２を参照のこと）。

種々の脊椎動物のさまざまなＣＤ９１タンパク質のヌクレオチドおよび核酸配列は、当技術分野において公知である。例示のみを目的として、これに限定されるものではないが、配列番号１として本明細書中に開示するヒトＣＤ９１のアミノ酸配列に言及する。対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４、ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能である。アイソフォーム１のアミノ酸配列は、受入番号Ｑ０７９５４．２で入手可能である（ＬＲＰ１＿ＨＵＭＡＮ；プロ低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１；略してＬＲＰ－１）。配列番号１はまた、以下に示す。リガンド結合ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶには下線を引いてあり、文献Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ－ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、２００１、１１４（５）：８９９～９０８頁に基づいて、表示した順に出現する。

配列番号１
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本明細書中で使用する「ＣＤ９１」または「ＣＤ９１タンパク質」という用語は、前駆体形態または成熟形態のいずれかの全長タンパク質を指す。これは、前駆体形態では４，５４４アミノ酸から、成熟形態では４，５２５アミノ酸からなる。アミノ酸１～１９はシグナル配列であり、アミノ酸２０～４４１９は細胞外配列であり、アミノ酸４４２０～４４４４は膜貫通領域であり、アミノ酸４４４５～４５４４は細胞質テールである。

本明細書中で使用する「ＣＤ９１ポリペプチド」という用語は、ヘモペキシン：ヘム複合体には結合するが、ヘムが結合していないヘモペキシンには結合しない、前駆体または成熟ＣＤ９１の任意のポリペプチドプチド部分を指し、全長前駆体または成熟ＣＤ９１を指すものではない。

特許請求の範囲によれば、ＣＤ９１ポリペプチドは３００～１０００アミノ酸長を有する。

本発明の文脈において使用するＣＤ９１ポリペプチドは、特に、４００、５００、６００、７００、８００または９００アミノ酸長を有し得る。それは、４００～９００アミノ酸長、５００～９００アミノ酸長、５００～８００アミノ酸長、６００～９００アミノ酸長または６００～８００アミノ酸長を有し得ることも予想される。

本発明の文脈において使用するＣＤ９１ポリペプチドは、ＣＤ９１に由来する配列とさらなるペプチド配列とを含むことができる。

好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２４８１～２９４２内の断片を含むまたはそれからからなり、この断片の開始点は、アミノ酸２４８１および／またはアミノ酸２９４２から最大で１００、７０、５０、３０、２０、１０または５アミノ酸離れている。

本発明の文脈で使用するＣＤ９１ポリペプチドは、ＣＤ９１の種々の部分を含み得る。例えば、それは、ＣＤ９１のＮ末端に位置するアミノ酸配列およびリガンド結合ドメインＩＩＩ、すなわち、アミノ酸２４８１～２９４２を含み得る。

特に指示のない限り、本出願におけるＣＤ９１ポリペプチド残基のアミノ酸番号付けは、ＣＤ９１分子が配列番号１の全ての残基を含む必要がないとしても、配列番号１を指す。

より好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドは、配列番号２に示される、配列番号１のアミノ酸２４８１～２９４２または相同ＣＤ９１の対応するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。配列番号２は、ＣＤ９１のリガンド結合ドメインＩＩＩを示す。配列番号２は４６２アミノ酸長を有する。
配列番号２：
PCRINNGGCQDLCLLTHQGHVNCSCRGGRILQDDLTCRAVNSSCRAQDEFECANGECINFSLTCDGVPHCKDKSDEKPSYCNSRRCKKTFRQCSNGRCVSNMLWCNGADDCGDGSDEIPCNKTACGVGEFRCRDGTCIGNSSRCNQFVDCEDASDEMNCSATDCSSYFRLGVKGVLFQPCERTSLCYAPSWVCDGANDCGDYSDERDCPGVKRPRCPLNYFACPSGRCIPMSWTCDKEDDCEHGEDETHCNKFCSEAQFECQNHRCISKQWLCDGSDDCGDGSDEAAHCEGKTCGPSSFSCPGTHVCVPERWLCDGDKDCADGADESIAAGCLYNSTCDDREFMCQNRQCIPKHFVCDHDRDCADGSDESPECEYPTCGPSEFRCANGRCLSSRQWECDGENDCHDQSDEAPKNPHCTSQEHKCNASSQFLCSSGRCVAEALLCNGQDDCGDSSDERGCHIN

さらに好ましい実施形態において、本発明に従って使用されるＣＤ９１ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸を含み、かつＣＤ９１ポリペプチドの培地への分泌のためのシグナル配列、好ましくは、配列番号１のシグナル配列、リンカー、好ましくはＡＩＤＡＰ（配列番号５）、ＣＤ９１ポリペプチド精製のためのタグ、好ましくは当技術分野において公知のＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＫ；配列番号６）をＮ末端に、およびＣＤ９１ポリペプチド精製のためのタグ、好ましくはＨｉｓタグをＣ末端にさらに含む。好ましいＣＤ９１ポリペプチドを、以下の配列番号３に示す。このコンストラクトは、以下の実施例２において使用されている。
配列番号３：
MLTPPLLLLLPLLSALVAAAIDAPDYKDDDDKKPCRINNGGCQDLCLLTHQGHVNCSCRGGRILQDDLTCRAVNSSCRAQDEFECANGECINFSLTCDGVPHCKDKSDEKPSYCNSRRCKKTFRQCSNGRCVSNMLWCNGADDCGDGSDEIPCNKTACGVGEFRCRDGTCIGNSSRCNQFVDCEDASDEMNCSATDCSSYFRLGVKGVLFQPCERTSLCYAPSWVCDGANDCGDYSDERDCPGVKRPRCPLNYFACPSGRCIPMSWTCDKEDDCEHGEDETHCNKFCSEAQFECQNHRCISKQWLCDGSDDCGDGSDEAAHCEGKTCGPSSFSCPGTHVCVPERWLCDGDKDCADGADESIAAGCLYNSTCDDREFMCQNRQCIPKHFVCDHDRDCADGSDESPECEYPTCGPSEFRCANGRCLSSRQWECDGENDCHDQSDEAPKNPHCTSQEHKCNASSQFLCSSGRCVAEALLCNGQDDCGDSSDERGCHINHHHHHHHH

当業者ならば、本発明の文脈で使用されるＣＤ９１ポリペプチドがさらに長くなり得ることも理解するであろう。例えば、それは、１１００、１２００、１３００、１４００、１６００またはさらには２０００もしくは２５００アミノ酸長であり得るであろう。

本発明のポリペプチドは、アミノ酸２４８１～２９４２に隣接する、すなわち、リガンド結合ドメインＩＩＩに隣接するＣＤ９１配列の部分をさらに含み得る。それは、リガンド結合ドメインＩＩおよびＩＶの部分さえも包含し得る。この文脈で、隣接とは、対応するアミノ酸配列が２４８０位で終了するまたは２９４３位で開始することを意味する。

本発明の文脈で使用するＣＤ９１ポリペプチドは、リガンド結合ドメインＩＩＩ、すなわち、アミノ酸２４８１～２９４２をさらに含み、リガンド結合ドメインＩＩＩとＩＩの間および／またはリガンド結合ドメインＩＩＩとＩＶの間に位置するペプチドストレッチを追加的に含み得る。好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドは、リガンド結合ドメインＩＩの終了（すなわち、アミノ酸１１８３）後に開始して、リガンド結合ドメインＩＶの開始（すなわち、アミノ酸３２９３）前に終了する、ＣＤ９１由来のアミノ酸の連続ストレッチを含み得る。ことによると、ＣＤ９１ポリペプチドは、１１８４位で開始しかつ／または３２９２位で終了する、ＣＤ９１由来のアミノ酸の連続ストレッチを含み、アミノ酸２４８１～２９４２を含む。

本発明のポリペプチドは好ましくはグリコシル化することができる。

「リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンド結合ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称する、ＣＤ９１タンパク質内の４つの定義された領域を指す。リガンド結合ドメインは、細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤複合体およびリポタンパク質代謝に関与する他のタンパク質を含む一連の種々のリガンドを結合する、リガンド結合ドメインＩ内に２個のリピート、リガンド結合ドメインＩＩ内に８個のリピート、リガンド結合ドメインＩＩＩ内に１０個のリピートおよびリガンド結合ドメインＩＶ内に１１個のリピートを有する、４個のリガンド結合ドメイン中に配置されたシステインリッチな補体型リガンド結合リピートから構成される。４個のドメインのうち、ドメインＩＩおよびＶＩは、大部分のリガンドを結合する。これまで、リガンド結合ドメインＩＩＩ（例えば、ＦＶＩＩＩａ）については、極めて少数のリガンドしか検出されていない。他のリガンドとしては、ａｐｏＥに富むβ－ＶＬＤＬおよびラクトフェリンが挙げられる（Ｃｒｏｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４；４３（２３）：７３２８～３５頁）。

ＣＤ９１ホモログは、脊椎動物に見られる。したがって、本明細書中で言及する「ＣＤ９１」または「ＣＤ９１タンパク質」という用語は、脊椎動物において見られる任意のＣＤ９１オルソログまたはホモログを指す。あるいは、本明細書中で言及するＣＤ９１は、配列番号１の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有する、任意のＣＤ９１を指す。あるいは、本明細書中で言及するＣＤ９１は、配列番号１の配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のアミノ酸相同性を有する、任意のＣＤ９１を指す。好ましくは、脊椎動物に見られる任意のＣＤ９１および上記で定義した配列番号１の配列とアミノ酸同一性または相同性を有する任意のＣＤ９１を含む、本明細書中で言及するＣＤ９１は、配列番号１によるＣＤ９１と同じ活性を有する。より好ましくは、本明細書中で言及するＣＤ９１は、ヒトヘモペキシン：ヒトヘム複合体に対する配列番号１のＣＤ９１と同じ親和性でまたはヒトヘモペキシン：ヒトヘム複合体に対する配列番号１のＣＤ９１の親和性の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である親和性で、ヘモペキシン：ヘム複合体、好ましくはヒトヘモペキシン：ヒトヘム複合体を結合する。関係、相同性、同一性および機能の前記定義を有するＣＤ９１は、本明細書において「ＣＤ９１ホモログ」とも称する。

ＣＤ９１ポリペプチドは、ＣＤ９１の一部である。「ＣＤ９１ポリペプチド」という用語は、上記で定義されている。したがって、本明細書中で言及する「ＣＤ９１ポリペプチド」という用語は、脊椎動物において見られるＣＤ９１オルソログまたはホモログおよび上記で示した配列番号１に対するそのアミノ酸同一性または相同性によって定義されるＣＤ９１を含む、上記で定義した任意のＣＤ９１の一部であるＣＤ９１ポリペプチドを指す。あるいは、ＣＤ９１ポリペプチドは、配列番号２の配列とアミノ酸同一性を有する、または配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％のアミノ酸同一性を有するもしくは配列番号２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％のアミノ酸相同性を有する、アミノ酸配列を含む。あるいは、ＣＤ９１ポリペプチドは、配列番号３の配列とアミノ酸同一性を有する、または配列番号３の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％のアミノ酸同一性を有するもしくは配列番号３と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％のアミノ酸相同性を有する、アミノ酸配列を含む。好ましくは、本明細書中で言及するＣＤ９１ポリペプチドは、配列番号１に由来するＣＤ９１ポリペプチドと、または配列番号２もしくは３に由来するＣＤ９１ポリペプチドと、それぞれ同じ活性を有する。より好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドは、ヘモペキシン：ヘム複合体、好ましくはヒトヘモペキシン：ヒトヘム複合体を結合する。結合は、配列番号１に由来するＣＤ９１ポリペプチドもしくは配列番号２もしくは３のＣＤ９１ポリペプチドと同じ親和性であり得る、または配列番号１に由来するＣＤ９１ポリペプチドもしくは配列番号２もしくは３のＣＤ９１ポリペプチドがヘモペキシン：ヘム複合体、好ましくはヒトヘモペキシン：ヒトヘム複合体に結合する親和性の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である親和性であり得る。

本発明のＣＤ９１ポリペプチドは、好ましくはヘモペキシン：ヘムを１００μＭ未満、５０μＭ未満、１０μＭ未満、または５μＭ未満のＫｄで結合する。好ましくは、Ｋｄは４μＭ未満または２μＭ未満である。Ｋｄは、０．１μＭ超であり得、または０．０１μＭ超であり得る。

実施例において示されるように、ヘモペキシン：ヘム複合体に対するリガンド結合ドメインＩＩＩの親和性は、約１．５μＭまたは約２μＭであり得る。

配列同一性の百分率は、２つの最適にアラインされた配列の対応する位置で同一であるアミノ酸残基の百分率を指す。それは、２つの最適にアラインされた配列を比較ウインドウ全体にわたって比較することによって決定される。比較ウインドウにおけるアミノ酸配列の一部は、２つの配列の最適アライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を含み得る。この百分率は、同一アミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で除算し、計算結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって算出する。比較のための配列の最適アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｄ．ＡＰＬ Ｍａｔｈ、１９８１年；２：４８２～９頁）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年；４８：４４３～５３頁）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似法（ＰＮＡＳ、１９８８年；８５：２４４４～８頁）によって、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（ＰＮＡＳ、１９９０年；８７：２２６４～８頁）をＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌが修正したもの（ＰＮＡＳ、１９９３年；９０：５８７３～７頁）によって、またはこれらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＰＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または精査によって行うことができる。好ましくは、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴを使用して、最適アライメントを決定する。典型的には、ギャップ重み（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）には５．００のデフォルト値およびギャップ重み長（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ ｌｅｎｇｔｈ）には０．３０のデフォルト値を使用する。

配列相同性の百分率は、２つの最適にアラインされた配列の対応する位置において相同であるアミノ酸残基の百分率を指す。２つの配列間の「相同性の百分率」は、計算において同一な位置でだけでなく相同な位置も考慮に入れるという事実を除いて、「同一性の百分率」の決定に関して前述した方法と実質的に同一の方法で確定する。２つの相同アミノ酸には、２つの同一または相同アミノ酸がある。相同アミノ酸残基は、類似した化学的－物理的性質を有する、例えば、アミノ酸が、同じ群：芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、極性アミノ酸（ＧＩｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、ヒドロキシル基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、または短い側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）に属する。このような相同アミノ酸間の置換はタンパク質の表現型を変化させない（保存的置換）ことが予想される。

さらに、本明細書中で言及するＣＤ９１ポリペプチドとは、ＣＤ９１ポリペプチドがヘモペキシン：ヘム複合体に結合する限り、ＣＤ９１ポリペプチドの１つのホモログ、または同じ種の２つ以上の個体に由来するおよび／もしくは異なる種の２つ以上の個体に由来するＣＤ９１ポリペプチドホモログの混合物を指し得る。

ヘモペキシン－ヘム複合体をヒトで検出しようとする場合、ＣＤ９１ポリペプチドはヒトＣＤ９１に由来することが一般に好ましい。しかし、ＣＤ９１ポリペプチドの非ヒトホモログがヒトヘモペキシン－ヘム複合体に結合する能力を有する限り、ＣＤ９１の非ヒトホモログに由来するＣＤ９１ポリペプチドをヒトにおけるヘモペキシン－ヘム複合体の検出に使用できることを理解すべきである。その他の場合には、ヒトＣＤ９１またはＣＤ９１の非ヒト相同体に由来するＣＤ９１ポリペプチドを、非ヒトにおけるヘモペキシン－ヘム複合体の検出に使用することができる。それによって、ＣＤ９１ポリペプチドのヒトまたは非ヒトホモログが非ヒトにおいてヘモペキシン－ヘム複合体に結合する能力を有する限り、ＣＤ９１ポリペプチドの非ヒトホモログは同じ種のものであっても他の種のものであってもよい。上記と同様に、ＣＤ９１ポリペプチドが非ヒトにおけるヘモペキシン－ヘム複合体の検出を意図する場合には、ＣＤ９１ポリペプチドは、ヘモペキシン－ヘム複合体を検出しようとする種と同じ種に由来することが一般に好ましい。ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはトリ起源のＣＤ９１を含むＣＤ９１の非ヒトホモログの例示的な例は、当業者によく知られている。

配列番号によって特定される特定のアミノ酸配列または配列番号によって特定される特定のアミノ酸配列の特定のアミノ酸領域に言及する場合、異なるＣＤ９１ホモログまたは異なるＣＤ９１ポリペプチドホモログの対応するアミノ酸配列または対応するアミノ酸領域はそれぞれ、特定のアミノ酸配列または特定のアミノ酸領域に含まれることが理解される。例えば、配列番号１のアミノ酸２４８１～２９４２内の断片に言及する場合、ＣＤ９１ポリペプチドホモログの対応するアミノ酸領域が網羅される。配列番号２によるアミノ酸２４８１～２９４２に言及する場合、ＣＤ９１ポリペプチドホモログの対応するアミノ酸領域が網羅される。

本明細書中で使用する「ＣＤ９１のリガンド結合ドメインＩＩＩの断片」もしくは「その断片」もしくは「断片」という用語または対応する表現は、ヘモペキシン：ヘム複合体、好ましくはヒトヘモペキシン：ヒトヘム複合体に結合することができるＣＤ９１のリガンド結合ドメインＩＩＩの任意の断片を意味する。結合は、配列番号１に由来するＣＤ９１ポリペプチドもしくは配列番号２もしくは３のＣＤ９１ポリペプチドと同じ親和性で、または配列番号１に由来するＣＤ９１ポリペプチドもしくは配列番号２のＣＤ９１ポリペプチドがヘモペキシン：ヘム複合体、好ましくはヒトヘモペキシン：ヒトヘム複合体に結合する親和性の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である親和性であり得る。重要なことは、断片が、ヘムが結合されていないヘモペキシンには結合しないことである。

本明細書中で使用する「～の長さを有するＣＤ９１ポリペプチド」という用語は、ＣＤ９１ポリペプチドが正確に、示された長さのものであり、追加のアミノ酸を含むことによりより長い長さとなっていることはないと、理解すべきである。しかし、その長さによって定義されるＣＤ９１ポリペプチドは、ポリペプチドをより長くするが示された長さに含まれていない、追加のアミノ酸をＮおよび／またはＣ末端に含むことができる。このような追加のアミノ酸は非ＣＤ９１タンパク質配列、例えば、シグナルペプチドおよび／もしくは融合タグに由来するか、またはＣＤ９１タンパク質内のＣＤ９１ポリペプチド配列から除去されるＣＤ９１タンパク質部分配列であって、シグナル配列、１つもしくはそれ以上の増殖因子リピートおよび／もしくは膜貫通ドメインである。

本明細書中で使用する「～に由来する」という用語は、ＣＤ９１ポリペプチドが由来する対象または種のＣＤ９１の対応するアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、またはそれと実質的に（すなわち、少なくとも９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であることを意味する。「～に由来する」という用語はまた、ヘモペキシンと関連して使用され、ヘモペキシンが、ヘモペキシンが由来する対象または種のヘモペキシの対応するアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、またはそれと実質的に（すなわち、少なくとも９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であることを意味する。

本明細書中で言及するＣＤ９１ポリペプチドは、「少なくとも部分的に精製された」、「単離された」または「精製された」形態で存在し得る。「少なくとも部分的に精製された」、「単離された」または「精製された」などの用語は、ＣＤ９１ポリペプチドが、それが天然の環境またはそれが産生される環境から分離され、単離されまたは精製されていることを意味する、単離されたおよび／または精製された形態で提供されることを意味するために本明細書中で使用する。したがって、ＣＤ９１ポリペプチドは好ましくは、自然に会合される物質、例えば、他のポリペプチドもしくは核酸、またはそれが調製中に自然に会合される物質（例えば、細胞培養物中の細胞の物質）を含まないまたは実質的に含まない。例えば、少なくとも部分的に精製されたＣＤ９１ポリペプチドは、５０％以下（総タンパク質の）の不純物、好ましくは４５％以下、好ましくは４０％以下、好ましくは３５％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２５％以下、好ましくは２０％以下（総タンパク質の）の不純物を含む可能性がある。単離または精製されたＣＤ９１ポリペプチドは、１５％以下、好ましくは１０％以下、好ましくは５％以下または好ましくは１％以下（総タンパク質の）の不純物を含む可能性があり、最も好ましくは不純物を全く含まない。不純物は、アッセイを実行するためのアッセイ液中に存在する成分を指すものではない。

ＣＤ９１ポリペプチドは、ＣＤ９１ポリペプチドを産生することができる、当技術分野において公知の任意の方法によって産生することができ、例えば、ＣＤ９１ポリペプチドは、当技術分野において周知のルーチンの方法および試薬を使用して、組換えまたは合成によって産生することができる。好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドは、好適な宿主細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞）において当技術分野において公知の方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２版、１９９２年およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）に従って、組換えによって産生する、すなわち、遺伝子組換えによって遺伝子改変する。

ポリペプチドを組換えによって産生する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ＣＤ９１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、好適な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））に導入して発現させることができ、発現されたＣＤ９１ポリペプチドを、ルーチンの方法および容易に入手できる試薬を使用して宿主細胞（例えば、封入体中）から単離／精製することができる。ＣＤ９１ポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入するための方法は、当技術分野において周知であり、その方法としては、例えば、標準的な形質転換およびトランスフェクション技術（例えば、エレクトロポレーション、化学的形質転換）が挙げられる。本発明の分野における当業者ならば、ＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入するための適当な方法を容易に選択できる。宿主細胞においてタンパク質を発現させるための様々な方法が当技術分野において周知である（例えば、大腸菌におけるＩＰＴＧ誘導発現）。本発明の分野における当業者ならば、宿主細胞においてＣＤ９１ポリペプチドを発現させる適当な方法を容易に選択できる。発現されたＣＤ９１ポリペプチドは、例えばリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む公知の方法および試薬を使用して、宿主細胞から単離することができる。別法として、発現されたＣＤ９１ポリペプチドを、シグナルペプチドによって培地中に分泌させる。それは、当技術分野において公知の方法によって培地から回収することができる。例えば、ＣＤ９１ポリペプチドは、標準的な技術および試薬を使用して支持体に結合させることによって、宿主細胞もしくは宿主細胞の細胞可溶化物からまたは培地から、精製することができる。例えば、ＣＤ９１ポリペプチドは、特異的受容体、例えば、ＣＤ９１ポリペプチドに特異的な抗体またはその断片を介して固体支持体に結合させることによって、単離する。別法として、ＣＤ９１ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法によって、精製を可能にするタグによって単離することができる。

組換えＣＤ９１ポリペプチドを産生するために、ＣＤ９１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトを、例えば、そのヌクレオチド配列をベクターのクローニングサイトにクローニングすることによって、産生する。好適なベクターは当技術分野において公知であり、好適なベクターとしては、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えば、細菌、酵母またはヒト）、バクテリオファージ、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス）またはナノ改変物質（例えば、オルモシル）が挙げられる。ベクターは好ましくは、好適な宿主において発現を行うことができる１つまたはそれ以上の好適な配列を含む。このような配列は、宿主細胞にとって内因性である１つまたはそれ以上のタンパク質によって認識されるプロモーター配列であって、宿主細胞においてプロモーターに操作可能に連結された核酸の転写を指示できるものであり得る。プロモーター配列に加えて、ＣＤ９１ポリペプチドヌクレオチド配列に操作可能に連結されることができる他の配列としては、これらに限定されるものではないが、融合タグをコードする配列、シグナルペプチドをコードする配列、開始配列、ターミネーター配列、転写および翻訳停止シグナル、ならびに選択可能なマーカー配列、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子を挙げることができる。さまざまな選択可能なマーカーが当技術分野において公知であり、本発明において使用できる。さらに、コンストラクトは、所望の目的のための、アミノ酸配列をコードする１つまたはそれ以上の配列、例えば、タンパク質タグ、もしくは別の種類のタグ、例えば、化学分子、例えば、ビオチンをＣＤ９１ポリペプチドに結合させるためのリンカー配列をさらに含み得る。例えば、タンパク質タグが存在する場合には、タンパク質タグのコード配列を、ＣＤ９１ポリペプチドのコードＤＮＡ配列中に、例えば、リーディングフレームを維持しながら開始コドン後ろにまたは停止コドンの前に、挿入することができる。これにより、ＣＤ９１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端タンパク質タグが生成される。

ヘモペキシンは、少なくとも部分的には、ヘムを高い親和性（Ｋｄ＜１ｐＭ）で結合しかつ血流から肝臓へのヘム特異的担体として機能するその能力に起因して、ヘム毒性に対する第一の防御ラインとなる。ヘモペキシンはまた、セリンプロテアーゼ活性、ならびにいくつかの他の機能、例えば、抗炎症活性および炎症促進活性、細胞接着およびある特定の二価金属イオンの結合を阻害する能力を有することが報告されている（Ｍａｕｋ，Ｍ．Ｒ．、２０１１年． Ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、７９１～８０５頁）。

ヘモペキシンは、２０～２２％の炭水化物含有量を有する単一の４３９アミノ酸長ペプチド鎖で構成される６１±２ｋＤａの血漿β－１ Ｂ糖タンパク質であり、２つの４ブレードβプロペラドメインによって形成されており、これは、９０°の角度で一緒に固定されかつドメイン間リンカーペプチドによって連結された２つの厚いディスクに似ている。ヘムは、血管内および血管外の溶血の結果として血液中に放出され、ドメイン間リンカーペプチドによって形成される高疎水性のポケット内において２つの４ブレードβプロペラドメイン間に結合される。残基Ｈｉｓ２１３およびＨｉｓ２６６は、ヘム鉄原子を配位し、ヘモグロビンと類似した、安定したビス－ヒスチジル錯体を生じる。

ヘモペキシンは、シアル酸、マンノース、ガラクトースおよびグルコサミンを含む炭水化物を２０～２２％含む。１２個のシステイン残基がタンパク質配列に見られた。これは、おそらく６個のジスルフィド架橋を構成する。ヘモペキシンは、ヘムを高い親和性（Ｋ_ｄ＜１ｐＭ）で結合しかつ血流から肝臓へのヘム特異的担体として機能するその能力のため、ヘム毒性に対する第一の防御ラインとなる。これは等モル比でヘムを結合するが、ヘムがタンパク質に共有結合される証拠はない。さらなる特徴は次の通りである：２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光係数が１．９７［ｍＬ（ｍｇ×ｃｍ）］；理論上のｐＩが６．５５；およびの疎水性の平均が－０．４３（高スコアの疎水性セグメントがない）。

本明細書中で使用する「ヘモペキシン」という用語は、脊椎動物、例えば、ヒト、ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはトリ、好ましくはヒトの血液中に天然に見られるような、ヘモペキシンタンパク質を意味することを意図する。好ましくは、ヘモペキシンは、配列番号４として示されるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００６０４．１のアミノ酸残基２４～４６２、または配列番号４と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性もしくは配列番号４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、成熟形態のヒトヘモペキシンである。
配列番号４
1 MARVLGAPVA LGLWSLCWSL AIATPLPPTS AHGNVAEGET KPDPDVTERC SDGWSFDATT
61 LDDNGTMLFF KGEFVWKSHK WDRELISERW KNFPSPVDAA FRQGHNSVFL IKGDKVWVYP
121 PEKKEKGYPK LLQDEFPGIP SPLDAAVECH RGECQAEGVL FFQGDREWFW DLATGTMKER
181 SWPAVGNCSS ALRWLGRYYC FQGNQFLRFD PVRGEVPPRY PRDVRDYFMP CPGRGHGHRN
241 GTGHGNSTHH GPEYMRCSPH LVLSALTSDN HGATYAFSGT HYWRLDTSRD GWHSWPIAHQ
301 WPQGPSAVDA AFSWEEKLYL VQGTQVYVFL TKGGYTLVSG YPKRLEKEVG TPHGIILDSV
361 DAAFICPGSS RLHIMAGRRL WWLDLKSGAQ ATWTELPWPH EKVDGALCME KSLGPNSCSA
421 NGPGLYLIHG PNLYCYSDVE KLNAAKALPQ PQNVTSLLGC TH

ＣＤ９１ポリペプチドによるヘモペキシン：ヘム複合体の検出は、受容体へのリガンドの結合を検出できる、当技術分野において公知の任意の方法によって実行することができる。このような方法としては、イムノアッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイ、または典型的なリガンド結合アッセイ、例えば、標識、無標識、熱力学的もしくは構造ベースのアッセイを挙げることができる（Ｙａｋｉｍｃｈｕｋ Ｋ．、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１年；１：１９９（最終修正：２０２０年３月２６日）を参照のこと）。

検出は固相または溶液中で実行することができる。好ましくは、方法は固相法である。したがって、ＣＤ９１ポリペプチドは固体支持体に連結することができ、または固体支持体に連結するのが好適であり得る。別法として、ヘモペキシン：ヒトヘム複合体を固体支持体に連結する。

好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドは固体支持体に連結するか、または固体支持体に連結するのが好適である。任意の好適なポリマー、好ましくは合成ポリマーを固体支持体として使用することができる。固体支持体への連結は直接的であってもよく、これは、固体支持体の表面へのＣＤ９１ポリペプチドの親和性が高い場合には特に、ＣＤ９１ポリペプチドが中間体なしで連結されることを意味する。したがって、この連結は、吸着を介して非特異的であり得る。ＣＤ９１ポリペプチドを連結するのに好適な表面の例は、ＣＤ９１ポリペプチドの荷電領域が高親和性を有する荷電表面である。好ましくは、表面は、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート上に存在するような高荷電ポリスチレン表面である。一実施形態によれば、固体支持体は、樹脂材料またはビーズ様粒子であり得、いずれもクロマトグラフィー法に好適であり得る。別法として、固体支持体への連結は間接的であってもよく、これは、ＣＤ９１ポリペプチドが連結用化合物を介して連結されることを意味する。連結用化合物は、中間体化合物として、固体支持体に、固体支持体表面とＣＤ９１ポリペプチドとの間で結合される。間接的連結の例は、抗原－抗体結合であり、この場合、ＣＤ９１ポリペプチド（抗原である）に特異的な抗体が固体支持体に結合され、ＣＤ９１ポリペプチドが抗体によって固体支持体に連結される。別法として、抗体以外の、ＣＤ９１ポリペプチドのための結合用化合物を、固体支持体に結合させてもよい。さらなる別法として、ＣＤ９１ポリペプチドが、固体支持体に結合された親和性結合パートナーを介してＣＤ９１ポリペプチドを固体支持体に連結するタグを含んでいてもよい。このようなタグとしては、親和性タグ、例えば、チキン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓｔｒｅｐタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）もしくはポリ（Ｈｉｓ）タグまたは結合対の結合パートナー、例えば、ビオチンが挙げられ、これらは、当技術分野において公知であり、本明細書中で論じられる。固体支持体へのＣＤ９１ポリペプチドの連結は、ＣＤ９１ポリペプチドへのヘモペキシン：ヘム複合体の結合を妨害するものではない。

好ましくは、検出方法は、イムノアッセイであり、好ましくは生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の存在または濃度を、ヘモペキシンに特異的に結合する検出抗体を使用することによって測定する。最も好ましくは、方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）であり、これはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイであってもよい。

特に好ましい実施形態において、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の量を決定する。

この方法を実行するために、ＣＤ９１ポリペプチドは好ましくは、固体支持体に連結させる。次いで、生体試料を固体担体に添加する。固体支持体の表面上に検出抗体を適用して、検出抗体が、ＣＤ９１ポリペプチドに結合したヘモペキシン：ヘム複合体のヘモペキシンに結合できるようにする。抗体は、酵素に連結させてもよいし、または酵素に連結された二次抗体によって検出してもよい。最終工程で、酵素の基質を含有する反応溶液を含む読み取り成分を添加する。酵素反応によって、検出可能なシグナルを生成される。検出可能なシグナルは、色、蛍光または電気化学シグナルであり得る。色、蛍光または電気化学シグナルを生成するための酵素および基質の種類は、当技術分野において公知である。各工程間で、すなわち、連結工程、生体試料の添加工程、検出抗体の添加工程および基質の添加工程の間で、固体支持体は典型には、中性洗剤溶液で洗浄して、結合していないまたは非特異的に結合しているあらゆる成分、例えば、タンパク質または抗体が除去される。最終洗浄工程後に、酵素基質を添加することによって、固体支持体を発現させて、シグナルを生成する。吸光度、蛍光または電気化学シグナルを測定して、生体試料中におけるヘモペキシン：ヘム複合体の存在および／または量を決定する。

ＣＤ９１ポリペプチドを使用してヘモペキシン：ヘム複合体を検出するための条件の実験的検討の間に、古典的なプレートベースのフォーマットがヘモペキシン：ヘム複合体の検出および定量化に非常に有効であることが判明した。したがって、ＣＤ９１ポリペプチドは、極性基または親水性基を有する分子に対して高親和性を有するＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高結合プレートに被膜として非特異的に結合させる。試料のヘモペキシン：ヘム複合体は、プレートに結合したＣＤ９１ポリペプチドに結合し、ウサギ抗ヘモペキシン抗体および抗ヘモペキシン抗体に対するＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体を使用して検出される。検出抗体および二次抗体は当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。例えば、検出抗体は、抗ヘモペキシン抗体、例えば、Ａｂｃａｍからのウサギポリクローナル抗体（Ａｂ４８１３５）である。二次抗体は、抗検出抗体、例えば、非特異的ヤギ抗ウサギ抗体、例えば、過酸化水素による種々の有機基質の酸化を触媒する酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結された、例えば、Ｓｅｒａｃａｒｅからのもの（５２２０－０３３６）である。ペルオキシダーゼ基質としてＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を使用して、検出可能なシグナルを発生させる。その結果、ＴＭＢ基質とＨＲＰとの反応により、試料中のヘモペキシン：ヘム複合体のレベルと相関する、測定可能な色の変化（６５０ｎｍで直接読み取ることができる濃い青色、または酸溶液で停止した後に４５０ｎｍで読み取ることができる濃い黄色）が生じる。このようにして、ヘモペキシン：ヘム複合体の量を決定することができる。一般に、以下の実施例２に記載する条件を使用することができる。

ヘモペキシン：ヘム複合体の検出のために、ヘモペキシン：ヘム複合体中のヘモペキシンに対する検出抗体を使用することができる。「検出抗体」は、ヘモペキシンに特異的であり、ヘモペキシン：ヘム複合体中のヘモペキシンに結合する、その検出のための抗体である。検出抗体は、ＣＤ９１ポリペプチドへのおよびヘムへのヘモペキシンの結合を妨害しない。当業者ならば、特定のタンパク質に対する抗体を調製する方法を知っている。さらに、本発明において使用できるヘモペキシンに特異的な抗体は、商業的に入手可能であり、例えば、Ａｂｃａｍからのウサギポリクローナル抗ヘモペキシン抗体（Ａｂ４８１３５）がある。

検出抗体を介する生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の検出は、検出抗体に結合することができるが反応溶液中に存在する抗原には結合しない、「二次抗体」を介して行うことができる。二次抗体は通常、検出抗体の重鎖に結合することによって異なる種の抗体を識別する非特異的抗体であり、ヘモペキシンに結合する検出抗体の結合を妨害しない。したがって、検出抗体は通常、１種類の種、例えば、ウサギ種に由来し、二次抗体は、検出抗体の種特異的配列に向けられる。二次抗体は商業的に、例えば、Ｓｅｒａｃａｒｅ（５２２０－０３３６）から入手可能である。

「特異的結合」、「抗体の特異的結合」、「特異的抗体」という用語または対応する用語は、化合物または抗体が、抗体の場合には抗原である特定の結合パートナーと結合するが、反応混合物中に存在する他の分子にはそれほど多い量では結合しない（特定のタンパク質への結合の１０％未満）、結合反応を指す。一般に、結合パートナー、例えば、抗体の場合の抗原などのその対応する結合パートナーに「特異的に結合する」結合対の抗体は、その標的分子に対して約１０^５モル／リットル超（例えば、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２モル／リットルまたはそれ以上）の平衡親和性定数を有する。

本明細書中で使用する「抗体」という用語は、当技術分野において公知の全長抗体、または少なくとも１つの抗体可変ドメインを含むが抗体の構造全体を含まない分子と本明細書中で定義する「抗体派生物」を含む。抗体派生物は依然として、標的分子を結合することができる。派生物は、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ｓｃＦｖ、Ｆｖもしくはその部分、またはイムノグロブリンの他の派生物もしくは組合せ、例えば、ナノボディ、ダイアボディ、ミニボディ、ラクダ科動物の単一ドメイン抗体、単一ドメインもしくはＦａｂ断片、可変領域の重鎖および軽鎖のドメイン（例えば、Ｆｄ、ＶラムダおよびＶカッパを含むＶＬ、ＶＨ、ＶＨＨ）、および少なくとも２つの構造ループによって接続されたイムノグロブリンドメインの２つのベータ－ストランドからなるミニドメインであり得る。

ＣＤ９１ポリペプチドの連結またはヘモペキシン：ヘム複合体の検出はまた、「抗体模倣物」によって行うことができる。「抗体模倣物」は本明細書中で、抗体のようにＣＤ９１ポリペプチドまたはヘモペキシン：ヘム複合体を特異的に結合できるが、抗体と構造的に関連していない有機化合物と定義する。抗体模倣物は通常は、約３～２０ｋＤａ分子質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。抗体模倣物の非限定的例は、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、プロテインＡのＺドメイン、ガンマＢクリスタリン、ユビキチン、シスタチン、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来のＳａｃ７Ｄ、リポカリン、膜受容体のＡドメイン、アンキリンリピートモチーフ、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン、プロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｓドメイン、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン、合成ヘテロ二価またはヘテロ多価リガンドである（Ｊｏｓａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年；２２：１２７０～８頁，Ｓｈａｌｌａｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２０１４年；２５：３９３～４０５頁およびＸｕら、ＰＮＡＳ、２０１２年；１０９：２１２９５～３００頁）。

ＣＤ９１ポリペプチドの連結またはヘモペキシン：ヘム複合体の検出はまた、ＣＤ９１ポリペプチドまたはヘモペキシンにそれぞれ特異的に結合できるが、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の検出に必要な他の成分の結合を妨害しない、任意の他の化合物によって行うことができる。「特異的結合」は、前記意味で、すなわち、反応混合物中に存在する他の分子にはそれほど多い量では結合しない（それぞれＣＤ９１ポリペプチドまたはヘモペキシン：ヘム複合体への結合の１０％未満）という意味で、意味される。

本発明の検出方法はまた、抗体などの特異的化合物を介して生体試料のヘモペキシン：ヘム複合体を固体支持体に連結し、次いでＣＤ９１ポリペプチドを添加し、結合したＣＤ９１ポリペプチドの検出を介してヘモペキシン：ヘム複合体を検出することによって、実行することができる。

生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の検出はまた、溶液中でも行うことができる。生体試料は、ヘモペキシン：ヘム複合体を含む生体試料、または生体試料と、検出方法の完了を容易にする緩衝剤もしくは塩などの成分を含む溶液との混合物であり得る。したがって、ヘモペキシン：ヘム複合体へのＣＤ９１ポリペプチドの結合は溶液中で行う。ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との複合体の検出のために、固相を使用する検出と同様に、検出抗体を添加する。次いで、複合体全体を、固体支持体に連結し、読み取りを行う。

生体試料は、ヘモペキシン：ヘム複合体が存在する可能性がある任意の流体であり得る。

生体試料は、ヘモペキシン：ヘム複合体が存在するまたは存在すると予想される、対象からの任意の生物学的流体であり得る。ヘモペキシンは内因性ヘモペキシンであってもよく、および／または対象に、好ましくは溶血もしくは溶血に関連する状態を治療するために、投与される外来性ヘモペキシンであってもよい。生体試料の例は、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、尿、唾液、粘液、汗、気管支肺胞洗浄液、痰、精液、涙、糞便および／または胆汁であり得る。血液は、未処理であっても（および全血のままであっても）、または処理された血液であってもよい。好ましくは、本発明の使用および方法において使用する血液は、処理された血液である。処理された血液としては、血漿または血清を挙げることができる。

生体試料は、溶血に関連する状態を有する患者に由来し得る。好ましくは、溶血に関連する状態は、急性溶血状態および／または慢性溶血状態であり、より好ましくは、以下からなる群から選択される：鎌状赤血球貧血、溶血性貧血、骨髄無形成クリーゼ、過剰溶血クリーゼ、輸血によって誘導された溶血、溶血性尿毒症症候群、心筋梗塞、急性胸部症候群、肺高血圧、下腿潰瘍、発育遅滞、骨梗塞、妊娠子癇、腎不全、急性腎傷害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、出血性脳卒中を含む脳卒中、くも膜下出血、頭蓋内出血（ＩＣＨ）、脾臓血球貯留、脾梗塞、自己免疫性溶血性貧血を含む自己免疫疾患、微生物感染、感染に対する感受性の増加、マラリア感染、外傷、移植関連状態、心肺バイパスを使用する直視下心臓手術、熱傷、例えば、熱傷後の溶血を伴うヘモグロビン血症またはヘモグロビン血尿症、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、サラセミア、先天性赤血球形成異常性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿（ＰＮＨ）、全身性エリテマトーデスおよび慢性リンパ性白血病。さらに好ましいのは、溶血に関連する状態が鎌状赤血球貧血であることである。

生体試料は、ヘモペキシン：ヘム複合体が存在する可能性がある、製造プロセスから生じる任意の流体であることができる。このような流体の例は、タンパク質製造プロセスの中間生成物または最終生成物を含み得る。このようなプロセスは、ヒト血漿由来のタンパク質または組換え発現されたヒトタンパク質を生成することができる。例えば、「生体試料」という用語はまた、細胞培養物上清、および細胞培養物上清とヘムなどの他の成分との混合物を包含する。

本発明の好ましい実施形態において、使用するＣＤ９１ポリペプチドは、シグナルペプチドおよび／または１種またはそれ以上のタグをさらに含むことができる。

ＣＤ９１ポリペプチドは、ＣＤ９１ポリペプチドを単離するのに有用なおよび／または本発明の方法を行うのに有用な追加成分が添加されていてもよいし、または追加成分を添加してもよい。追加成分はヘモペキシン：ヘム複合体への結合に関与しない。それらがＣＤ９１タンパク質に由来する場合には、それらは、ＣＤ９１タンパク質内のＣＤ９１ポリペプチド配列に直接隣接しておらず、ヘモペキシン：ヘム複合体への結合に関与しない。好適な追加成分は、新たに合成されたＣＤ９１ポリペプチドのＮ末端に存在する短いペプチド配列（通常１６～３０アミノ酸長）であって、ＣＤ９１ポリペプチドを分泌経路に向けるために使用される、シグナルペプチドなどのペプチド配列であり得る。本発明において使用するためのシグナルペプチドは当技術分野において公知である。好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドに連結されるシグナルペプチドは、同じＣＤ９１タンパク質に由来する。シグナルペプチドは、分泌の間にＣＤ９１ポリペプチドから切断され、本発明のアッセイに使用されるＣＤ９１ポリペプチドの一部とはならない。

他の追加成分は１種またはそれ以上のタグであり得る。タグは、ＣＤ９１ポリペプチドに望ましい性質を提供するために、ＣＤ９１ポリペプチドに融合または結合される成分である。タグは、タンパク質タグであってもよい。タグは通常、Ｎ末端および／またはＣ末端でＣＤ９１ポリペプチドに融合されるので、融合タグとも称される。融合タグは、結合パートナーへの親和性によってタンパク質精製を可能にする親和性タグである。精製は、当技術分野において公知の方法、例えば、クロマトグラフィー法によって、結合パートナーへの結合を介して行われる。親和性パートナー、親和性パートナーを介する精製方法、ならびに系およびキットは、当技術分野において公知であり、および／または商業的に入手可能である（例えば、Ｋｉｍｐｌｅら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、２０１３年；７３：９．９．１－９．９．２３を参照のこと）。タグはまた、結合パートナー、蛍光または認識モチーフの存在を介する検出などの検出のために、発現を増加させるために、溶解性を増加させるために、タンパク質フォールディングを改善するために、または極性の増加により、例えば、ＨＰＬＣにおける分離をより容易にするために、有用であり得る。融合タグの例は当技術分野において公知であり、親和性技術による単離を可能にする親和性タグを含む。例は、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓｔｒｅｐタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはポリ（Ｈｉｓ）タグであり、親和性技術による単離を可能にする（親和性タグ）。例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグは金属マトリックスに結合する。安定化タグは、特に、大腸菌などのシャペロン欠損種において発現される組換えタンパク質に使用されて、タンパク質における適切なフォールディングを支援し、タンパク質が沈殿しないようにする。例は、チオレドキシンおよびポリ（ＮＡＮＰ）である。ＭＢＰおよびＧＳＴなどの一部の親和性タグは、可溶化剤として二重の役割を果たす。クロマトグラフィータグは、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変更して、特定の分離技術全体にわたって異なる分解能を提供するために使用する。例は、ポリアニオン性アミノ酸、例えば、ＦＬＡＧタグである。エピトープタグは、抗体に対して高親和性を有する短いペプチド配列である。例は、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｓｐｏｔタグ、Ｔ７タグおよびＮＥタグである。これらのタグは、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫沈降実験に特に有用である。蛍光タグは、目視読み取りを可能にする。一例は、ＧＦＰであり、そのバリアントは最も一般的に使用される蛍光タグである。ＧＦＰのより先進的な用途は、フォールディング受容体（フォールディングされている場合には蛍光、フォールディングされていない場合には無色）としてのその使用を含む。あるいは、タグは、ＣＤ９１ポリペプチドの検出を可能にする酵素、例えば、化学発光検出を可能にする西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。あるいは、タグは、結合対の結合パートナーであって、その結合パートナーへのタグの結合を介してＣＤ９１ポリペプチドの検出を可能にするものであり得る。一例は、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジン系であり、タグとして、ビオチンはＣＤ９１ポリペプチドに結合させることができ、アビジン／ストレプトアビジンは、ＣＤ９１ポリペプチドを捕捉するための固体支持体に結合させる。タグは、化学薬剤または酵素剤によって除去可能であり得、したがって、ＣＤ９１ポリペプチドを、例えば、単離中において融合タグのその親和性パートナーへの結合後に、タグから分離させることができる。

本発明の好ましい実施形態において、ＣＤ９１ポリペプチドは、固体支持体、好ましくは、高荷電ポリスチレン表面がある固体支持体、より好ましくはＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートに連結させる。

本明細書中で使用する固体支持体は、ヘモペキシン：ヘム複合体の検出のために、ＣＤ９１ポリペプチドの結合または生体試料のヘモペキシン：ヘム複合体の結合を可能にする任意の固体支持体である。好ましくは、ＣＤ９１ポリペプチドを固体支持体に連結させる。あるいは、固体支持体は、単離、精製または検出のために固体支持体に既に結合されているタグの親和性パートナーを介して、結合タグによるＣＤ９１ポリペプチドの結合を可能にする任意の固体支持体である。固体支持体の例は、プレート、好ましくはウェルプレート、ビーズ、電磁ビーズ、樹脂、カラムであり、ビーズもしくは樹脂はカラムの一部であることができ、またはカラム、フィルターもしくは膜を構成することができる。プレートベースの方法は、スループットがより高く、感受性がより大きく、実行がより容易であるという、非プレートベースの方法よりも有利な点を有するため、ヘモペキシン：ヘム複合体の検出のためのＣＤ９１ポリペプチドの連結において、好ましくは、プレートベースの方法が適用される。プレートは、より好ましくはウェルプレート、より好ましくはマルチウェルプレート、例えば、６、１２、２４、４８または９６プレートである。さらにより好ましくは、プレートの表面は、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート上に存在するような、高荷電ポリスチレン表面である。

ＣＤ９１ポリペプチドによる生体試料のヘモペキシン：ヘム複合体の検出は、対象における溶血の監視または溶血もしくは溶血に関連する状態の治療の監視、好ましくはヘモペキシンによる溶血もしくは溶血に関連する状態の治療の監視に役立つことができる。

ヘモペキシンによるヘムの複合体形成は、ヘム毒性から細胞を直接的に保護する。溶血に苦しむ対象において、ヘモペキシンの発現が増加して、毒性ヘムと複合体形成してそれを解毒する。次いで、ヘモペキシン：ヘム複合体を体から取り除く。しかし、対象が溶血に苦しんでいても、内因性ヘモペキシンは、体内で限定的にしか産生されないので、産生されるヘモペキシンは、大量のヘムと複合体形成するのに十分でない可能性がある。したがって、溶血の追加の治療が必要となる。このような治療は、大量のヘムと複合体形成してそれを解毒するための外来性ヘモペキシンの投与であり得る。

ヘモペキシンは、生物学的流体中のヘムと複合体形成してそれを解毒するのに役立つ。溶血中のヘムレベルの上昇は、限定的ではあるが、ヘモペキシンの発現の増加につながる。したがって、内因性ヘモペキシン：ヘム複合体レベルは、溶血または溶血の重症度を示す。したがって、ヘモペキシン：ヘム複合体レベルが高いほど、溶血の重症度は高い。しかし、ヘモペキシンは限定的にしか産生されないので、この相関は限定的である。したがって、体液中のヘモペキシン：ヘム複合体の濃度の検出は、対象における溶血の出現および溶血の重症度を示す。

加えて、対象におけるヘモペキシン：ヘム複合体の検出および数量化は、対象における溶血の治療が有効であるかどうかを監視するのに有用であり得る。したがって、溶血を有する対象におけるヘモペキシン：ヘム複合体のレベルが治療によって減少する場合には、これは、有効な溶血治療を示し得る。したがって、対象におけるヘモペキシン：ヘム複合体のレベルの決定は、溶血治療の有効性の監視に役立ち、ヘモペキシン：ヘム複合体の量に応じた治療の適応を可能にすることができる。

さらに、対象におけるヘモペキシン：ヘム複合体の検出および数量化は、対象における溶血の、ヘモペキシンによる治療が有効であるかどうかを監視するのに有用であり得る。高レベルのヘムが溶血中に生じかつ内因性ヘモペキシンがヘムと完全に複合体形成するのに十分に生成されない場合、外来性ヘモペキシンの投与は、内因性ヘモペキシン：ヘム複合体レベルを超えて、ヘモペキシン：ヘム複合体レベルを上昇させることができる。したがって、このような高いヘモペキシン：ヘム複合体レベルは、外来性ヘモペキシンによる大量のヘムとの効率的な複合体形成を示すが、対象において高レベルのヘムが産生されていることを示している可能性もあり、このことは、溶血が依然として進行中であり、重篤な状態であることを示している。したがって、対象におけるヘモペキシン：ヘム複合体のレベルの決定は、ヘモペキシン治療の有効性の監視に役立ち、対象におけるヘモペキシン：ヘム複合体のレベルに応じたヘモペキシン治療の適応を可能にすることができる。

あるいは、ヘモペキシン：ヘム複合体の検出は、ヘモペキシンに関する臨床試験中に溶血を有する対象における医薬品としてのヘモペキシの使用の効能の監視に役立ち得る。ある特定のレベルを超えるヘモペキシン：ヘム複合体レベルの数量化は、治療的に投与されたヘモペキシンがヘムとの複合体形成に有効であり、したがって医薬品として有効であることを示し得る。

このため、好ましい実施形態において、本発明の使用は、対象における溶血の診断もしくは監視、対象における溶血もしくは溶血に関連する状態の治療の監視を目的とする。

さらなる態様において、本発明は、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体を検出するためのインビトロの方法であって、上記で定義したＣＤ９１ポリペプチドと共に生体試料をインキュベートする工程と、ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との結合を検出する工程とを含む、方法に関する。

上記で定義した全ての実施形態はまた、本発明のこの方法に適用される。

一実施形態によれば、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体を検出するためのインビトロの方法は、少なくとも以下の方法工程：
－ 上記で定義したＣＤ９１ポリペプチドと共に生体試料をインキュベートする工程と、
－ ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との結合を検出する工程と
を含む。

一実施形態によれば、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体を検出するためのインビトロの方法は、少なくとも以下の方法工程：
－ 上記で定義したＣＤ９１ポリペプチドを連結させる固体支持体を用意する工程と、
－ 生体試料をＣＤ９１ポリペプチドと共にインキュベートする工程と、
－ 場合により、洗浄工程を実行する工程と、
－ ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との結合を検出する工程と、
－ 生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体の量を決定する工程と
を含む。

さらに好ましい実施形態において、本発明の方法は、生体試料、好ましくは血液または血清中の、ヘモペキシンとの結合に到達可能なヘムの量を決定するために使用する。

ヘモグロビンに結合しているもののように、血清中に存在する全てのヘムがヘモペキシンに到達可能とは限らないことは公知である。本発明の方法はまた、生体試料中の到達可能なヘムの量を決定するために、すなわち、ヘモペキシンと複合体を形成するために到達可能なヘムの量を決定するために使用することができる。このために、追加のヘモペキシン：ヘム複合体を生成する過剰のヘモペキシンを生体試料に添加する。次いで、ヘモペキシン：ヘム複合体の量を、過剰のヘモペキシンを添加したおよび添加していない試料において決定する。２つの試料間のモル濃度の差が、ヘモペキシンに到達可能なヘムの濃度である（ヘモペキシン：ヘムが１：１の比で結合するため）。

一実施形態によれば、生体試料中の到達可能なヘムの量を決定するための方法は、少なくとも以下の工程：
－ 追加のヘモペキシン：ヘム複合体を生成する過剰のヘモペキシンを生体試料に添加する（スパイクあり）、および過剰のヘモペキシンが添加されていない生体試料（スパイクなし）を用意する工程と、
－ 本明細書中で記載した、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体を検出するためのインビトロの方法を好ましくは適用することによって、過剰のヘモペキシンが添加された生体試料（スパイクあり）および過剰のヘモペキシンが添加されていない生体試料（スパイクなし）中のヘモペキシン：ヘム複合体の量を決定する工程と、
－ ヘモペキシン：ヘムが１：１の比で結合するという前提に基づいて、ヘモペキシンに到達可能なヘムの濃度を得るために、過剰のヘモペキシンが添加された（スパイクあり）および過剰のヘモペキシンが添加されていない（スパイクなし）２つの試料間における、決定されたヘモペキシン：ヘム複合体のモル濃度の差を算出する工程と
を含む。

一実施形態によれば、生体試料中の到達可能なヘムの相対濃度（Ｃ）を決定するための方法は、少なくとも以下の工程：
－ 追加のヘモペキシン：ヘム複合体を生成する過剰のヘモペキシンを生体試料に添加する（スパイクあり）、および過剰のヘモペキシンが添加されていない生体試料（スパイクなし）を用意する工程と、
－ 本明細書中に記載した、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体を検出するためのインビトロの方法を好ましくは適用することによって、過剰のヘモペキシンが添加された生体試料（スパイクあり）中のヘモペキシン：ヘム複合体の濃度（Ｂ）および過剰のヘモペキシンが添加されていない生体試料（スパイクなし）中のヘモペキシン：ヘム複合体の濃度（Ａ）を決定する工程と、
－ ヘモペキシンスパイクありの試料中に存在するヘモペキシン：ヘム複合体の濃度（Ｂ）から、スパイクスパイクなしの試料中に存在するヘモペキシン：ヘム複合体の濃度（Ａ）を減算し、ヘムがヘモペキシンに１：１の比で結合することを所与として、得られたデルタヘモペキシン：ヘム複合体濃度（Ｂ－Ａ）をヘモペキシンの分子量で除算することによって、ヘモペキシンに到達可能なヘムの濃度を決定する工程と、
－ 前工程のデルタ値をヘモペキシンの分子量で除算することによって、試料内のヘモペキシンに到達可能なヘムの相対濃度（Ｃ）を得る工程と
を含む。

したがって、到達可能なヘムの相対濃度は、（Ｃ）＝（［スパイクあり（Ｂ）－スパイクなし（Ａ）］／６３０００）＊１０００（μＭ）として算出することができる。

本発明はまた、生体試料からヘモペキシン：ヘム複合体をインビトロで分離するためのまたは体外で分離するための方法であって、上で定義したＣＤ９１ポリペプチドを生体試料と共にインキュベートする工程と、生体試料からＣＤ９１ポリペプチド－ヘモペキシン：ヘム複合体を分離する工程とを含む、方法に関する。

生体試料からのヘモペキシン：ヘム複合体の分離とは、ヘモペキシン：ヘム複合体をＣＤ９１ポリペプチドに結合させて、ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との得られた複合体を生体試料から除去することによって、生体試料からヘモペキシン：ヘム複合体を除去するまたは枯渇させることを意味する。生体試料からのヘモペキシン：ヘム複合体の分離は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。主に、分離は、本発明のヘモペキシン：ヘム複合体の検出の手順の第１の部分に相当し、ここで、ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体とを一緒に結合させる。したがって、前記記載は、生体試料からのヘモペキシン：ヘム複合体の分離の態様に適用される。好ましくは、前述のように、ＣＤ９１ポリペプチドを固体支持体に連結させ、ＣＤ９１ポリペプチドが連結されている固体支持体を生体試料と接触させ、ＣＤ９１ポリペプチドが連結されている固体支持体および結合されたヘモペキシン：ヘム複合体を生体試料から除去する。したがって、生体試料を、例えば、カラムに、樹脂、フィルターもしくは膜上に通す、またはその後に例えば遠心分離もしくは磁気分離によって除去できるビーズと接触させる場合に、有効な除去を得ることができる。

生体試料からのヘモペキシン：ヘム複合体の分離はインビトロであってもよいし、または体外であってもよい。これは、ヘモペキシン：ヘム複合体から生体試料を取り除くのに役立ち得る。「体外」分離とは、対象から得られた血液試料を用いて対象の外部で行われる操作を意味する。したがって、血液を対象から採取し、場合により、上記に示したように処理し、ＣＤ９１ポリペプチドと接触させる。ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との得られた複合体を血液から分離し、取り除かれた血液を対象に戻す。体外操作は、インビトロで実行することができ、すなわち、血液を対象から収集し、インビトロでＣＤ９１ポリペプチドと接触させ、ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン：ヘム複合体との得られた複合体を分離し、血液を体に戻す。別法として、体外操作は、血液を対象の循環に戻す前に、ヘモペキシン：ヘム複合体を分離して対象から対象へ循環する回路操作で実行してもよい。血液を体外に運搬する操作の全ては、体外回路で行う。好ましくは、操作はアフェレーシスであり、対象の血液を、ＣＤ９１ポリペプチドを使用することによってヘモペキシン：ヘム複合体を分離除去しかつ残りを循環に戻す、装置に通す。

本発明のさらなる態様は、状態に関してヘモペキシン：ヘム複合体のその内因性ＣＤ９１受容体への相互作用をブロックまたは低減するのが望ましいという前提で、前記状態を治療する方法において使用するための、上記で定義したＣＤ９１ポリペプチドである。このような状況において、ＣＤ９１受容体媒介エンドサイトーシスおよび／またはさらなる下流シグナリングをブロックするまたは減少させるために、本発明のポリペプチドをヘモペキシン：ヘム複合体のデコイとして、それを必要とする対象に投与することができる。

好ましくは、溶血に関連する状態は、急性溶血状態および／または慢性溶血状態であり、より好ましくは、以下からなる群から選択される：鎌状赤血球貧血、溶血性貧血、骨髄無形成クリーゼ、過剰溶血クリーゼ、輸血によって誘導された溶血、溶血性尿毒症症候群、心筋梗塞、急性胸部症候群、肺高血圧、下腿潰瘍、発育遅滞、骨梗塞、妊娠子癇、腎不全、急性腎傷害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、出血性脳卒中を含む脳卒中、くも膜下出血、頭蓋内出血（ＩＣＨ）、脾臓血球貯留、脾梗塞、自己免疫性溶血性貧血を含む自己免疫疾患、微生物感染、感染に対する感受性の増加、マラリア感染、外傷、移植関連状態、心肺バイパスを使用する直視下心臓手術、熱傷、例えば、熱傷後の溶血を伴うヘモグロビン血症またはヘモグロビン血尿症、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、サラセミア、先天性赤血球形成異常性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿（ＰＮＨ）、全身性エリテマトーデスおよび慢性リンパ性白血病。

「溶血に関連する状態」という用語は、溶血がその状態の原因である状態または溶血を引き起こす状態を含む、溶血が起こる対象における任意の状態を指す。

溶血または溶血に関連する状態の治療は、対象の血液中におけるヘモペキシン：ヘム複合体の複合体形成を含む。したがって、ＣＤ９１ポリペプチドを対象に投与して、体液中でヘモペキシン：ヘム複合体と複合体を形成することができる。

治療におけるＣＤ９１ポリペプチドの使用のために、ＣＤ９１ポリペプチドは、ＣＤ９１ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として提供する。医薬組成物の製造については、ＣＤ９１ポリペプチドは、ＣＤ９１ポリペプチドと、望ましい特性を提供する薬学的に許容される担体などの成分の混合物とを含む医薬剤形になければならない。医薬組成物は、当業者に公知である１種またはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む。

医薬品組成物は、全身、鼻腔、非経口、経腸または局所投与用に製剤化することができる。非経口投与としては、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または腹腔内投与が挙げられる。

医薬組成物は、経口投与用の固体剤形、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤；経口投与用の液体剤形、例えば、薬学的に許容される乳剤、マイクロ乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤；注射剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁剤；ならびに局所投与もしくは経皮投与用の剤形を含む、種々の剤形として製剤化することができる。

任意の特定の対象に対する具体的な治療有効用量レベルは、剤形、対象の年齢、体重および性別、治療の持続期間ならびに医療分野において周知の同様な要因を含む、さまざまな要因によって異なる。

好ましい実施形態において、溶血または溶血に関連する状態を治療するための方法は、ヘモペキシン：ヘム複合体を血液から分離するためのＣＤ９１ポリペプチドの使用を含む。ヘモペキシン：ヘム複合体を血液から分離する文脈で前述した全ての実施形態はまた、この実施形態にも適用される。

特に、分離はアフェレーシスなどによって、体外であることができ、または分離は血液中インビボであることができる。

体液からのＣＤ９１ポリペプチド－ヘモペキシン：ヘム複合体の複合体の除去については、複合体は対象によって取り除かれ、したがって天然のプロセスによって対象から除去される。別法として、ＣＤ９１ポリペプチド－ヘモペキシン：ヘム複合体の複合体は、インビトロでまたは対象の血液からの体外回路のいずれかで、体外で分離する。それによって、血液を対象から除去し、ＣＤ９１ポリペプチド－ヘモペキシン：ヘム複合体の複合体を血液から分離し、次いで、血液を対象に戻す。分離は、ＣＤ９１ポリペプチド－ヘモペキシン：ヘム複合体の複合体を、ＣＤ９１ポリペプチドまたはヘモペキシン：ヘム複合体を介して固体支持体に結合させ、固体支持体を血液から除去することによることができる。ＣＤ９１ポリペプチドまたはヘモペキシン：ヘム複合体の固体支持体への結合は、本明細書中に記載されている。

本発明はまた、薬学的に有効な量のＣＤ９１ポリペプチドを投与することよって対象を治療する方法を開示する。前述した全ての実施形態はまた、本発明のこの方法にも適用される。

ＣＤ９１ポリペプチドによって治療する対象は、動物、例えば、脊椎動物、例えば、ヒト、ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはトリ、好ましくはヒトである。

本発明のさらなる態様は、ＣＤ９１ポリペプチドを含むキットを指す。キットは、ＣＤ９１ポリペプチドと、および本発明の方法を行うのに必要なさらなる成分とを含む別個のユニットの集合体である。ＣＤ９１ポリペプチドは、本明細書中で定義するように、溶解して遊離形態で、もしくは溶液中での再構成のための粉末などの固体形態で存在してもよいし、または固体支持体に連結させてもよい。固体支持体にまだ連結されていない場合には、固体支持体は、方法の実行中にＣＤ９１ポリペプチドが連結されるキット中に追加的に存在し得る。ＣＤ９１ポリペプチドは、共有結合的にまたは非共有結合的に支持体に連結させることができる。ＣＤ９１ポリペプチドは、直接的にまたは間接的に支持体に連結させることができる。ＣＤ９１ポリペプチドは、本明細書中に記載した結合タグを備えることができる。場合により、さらなる試薬または溶液が存在し得る。このような溶液は、ＣＤ９１ポリペプチドを固体支持体に連結させるように適合させた溶液、生体試料中のヘモペキシン：ヘム複合体をＣＤ９１ポリペプチドに結合させるように適合させた溶液、抗ヘモペキシン検出抗体をヘモペキシン：ヘム複合体に結合させるように適合させた抗ヘモペキシン検出抗体を含む溶液、二次抗体を検出抗体に結合させるように適合させた二次抗体を含む溶液、および／または二次抗体に連結された酵素による基質の酵素反応に適合させた基質を含む溶液であることができる。適合させた溶液の代わりに、抗ヘモペキシン検出抗体、二次抗体もしくは基質はまた、粉末などの固体形態で存在することもでき、または保存溶液中に存在することもできる。固体形態または保存溶液は、各反応を行うための溶液中で使用するためのものである。キットはまた、本発明の方法を行うための説明書を含むことができる。

本発明のさらなる態様は、ＣＤ９１ポリペプチドが連結されている固体支持体に関する。固体支持体は、本明細書中で定義した通りである。ＣＤ９１ポリペプチドには、本明細書中で定義したタグが結合していてもよい。

本明細書中で言及する配列の概要を、下記表に提示する：

ここで、本発明を以下の実施例および図面によってさらに説明するが、これらの実施例および図面は例示を意図するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。

１．序論
ヘモペキシン（ＨＰＸ）は、遊離ヘムに高親和性で結合する血漿糖タンパク質である。内出血、溶血、筋融解または他の細胞損傷に起因してヘム結合タンパク質から放出されるヘムは、酸化的効果および炎症促進効果のため、毒性が高い。ヘモペキシンは遊離ヘムをスキャベンジし、このヘム－ヘモペキシン（ヘムーｈｐｘ）は、肝臓により、ＣＤ９１／ＬＲＰ１（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１）受容体媒介エンドサイトーシスによって取り込まれる。血漿ヘモペキシンは、ヘムの代謝プロセシングと、ヘムの酸化的触媒活性によって生じる毒性の阻害とに役立つ。

低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１、同義語アルファ２マクログロブリン受容体、アポリポタンパク質Ｅ受容体）としても知られる、ＣＤ９１は、Ｈｅｒｚら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８８年；７（１３）：４１１９～２７頁によって初めて記載された。ヒトタンパク質は約６００ｋＤａの前駆体タンパク質であり、フューリンによってタンパク質分解性にプロセシングされて、非共有結合的に会合した５１５ｋＤａのアルファ鎖と８５ｋＤａのベータ鎖となる。これは、マクロファージ、肝細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、ニューロン、血管平滑筋細胞および合胞体栄養細胞を含む広範囲の細胞型で、最も豊富には血管平滑筋細胞、肝細胞およびニューロンで発現される。ＣＤ９１オルソログは脊椎動物に見られ、ヌクレオチドおよびアミノ酸構造が多くの種について解明されている。

ＬＲＰ１のバイオジェネシスおよびリガンド結合特性の解析は、全長受容体の組換え発現が困難であることによって妨げられている。以前の研究（Ｂｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９６年；２７１（３６）：２２２１８～２４頁；Ｎｅｅｌｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９９年；２７４（４４）：３１３０５～１１頁およびＷｉｌｌｎｏｗら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９４年；２６９（２２）：１５８２７～３２頁）に基づき、ＬＲＰ１の４つの組換え可溶性リガンド結合ドメイン（Ｉ～ＩＶ）を作製し、ヘム－ｈｘ複合体へのその結合を試験するために使用した。

２．研究目的
第１の目的は、ＣＤ９１／ＬＲＰ１内に含まれるリガンド結合リピートの４つのクラスターの組換え変種を発現および精製するための検討およびそれができることであった。

第２の目的は、４つのドメインのうちのいずれが２つの異なるプラットフォーム（ＢＬＩおよびＳＰＲ）でヘム－ｈｐｘ複合体を結合できるかを検討することであった。

３．材料および方法
３．１ 細胞培養
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞および哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した（Ｒ７９０－０７、Ｖ７９０－２０）。細胞は、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。細胞は、８％ ＣＯ_２の雰囲気のインキュベーター中で３７℃に維持した。

３．２ ｃＤＮＡ発現プラスミドの作製
４つのリガンド結合ドメインＩ～ＩＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２３２３．２）およびｈｕｈＬＲＰＡＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２３２８．１）のそれぞれを含む可溶性ヒト（ｈｕ）ＬＲＰ１ミニ受容体をコードするｃＤＮＡを、ヒト発現にコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、それぞれ開始メチオニン（＋１）のすぐ上流のＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８７年；１５（２０）：８１２５～４８頁）（ＧＣＣＡＣＣ）を用いて合成した。ｈｕＬＲＰ１リガンド結合ドメインは、Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ－ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ、２００１年；１１４（５）：８９９～９０８頁によって以前に記載されたバウンダリ境界に基づいた。これを、図２に示す。各ｈｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体は、フレーム内で融合されたｈｕＬＲＰ１シグナルペプチド、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよびＣ末端８×Ｈｉｓタグをコードしていた。これらを、以下のように指定する：ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩ（アミノ酸２５～１１３）［ｈｕＬＲＰ１（１～２４）－ＦＬＡＧ－ｈｕＬＲＰ１（２５～１１３）－８Ｈｉｓ］；ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩＩ（アミノ酸８０６～１１８３）［ｈｕＬＲＰ１（１～２４）－ＦＬＡＧ－ｈｕＬＲＰ１（８０６～１１８３）－８Ｈｉｓ］；ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩＩＩ（アミノ酸２４８１～２９４２）［ｈｕＬＲＰ１（１～２４）－ＦＬＡＧ－ｈｕＬＲＰ１（２４８１～２９４２）－８Ｈｉｓ］；ＨｕＬＲＰ１結合ドメインＩＶ（アミノ酸３２９３～３７８３）［ｈｕＬＲＰ１（１－２４）－ＦＬＡＧ－ｈｕＬＲＰ１（３２９３～３７８３）－８Ｈｉｓ］。各ｃＤＮＡが完成したら、それをＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にライゲートした。製造元の説明書に従って、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｋｉｔｓ（１２１９１）を使用して、プラスミドＤＮＡの大規模な調製を行った。プラスミドコンストラクトのヌクレオチド配列を、ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．４３３７４５５）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して両方のストランドを配列決定することによって、検証した。

３．３ 組換えタンパク質の作製のための一過性トランスフェクション
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を使用した、ｈｕｌＲＰ１可溶性ミニ受容体結合ドメインＩ～ＩＶ（９０％）をヒトＬＤＬ受容体タンパク質関連タンパク質１（ｈｕＬＲＰＡＰ１、ＲＡＰ、１０％）と共にコードする発現プラスミドの一過性トランスフェクションを、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の説明書に従って行った。細胞は、生存細胞６×１０^６個／ｍＬの最終濃度でトランスフェクトし、振盪インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃において８％ＣＯ_２中で２０時間インキュベートした。２０時間後に、Ｅｎｈａｎｃｅｒ（商標）およびＦｅｅｄ（商標）を培養物に添加した。次いで、培養物を３２℃、５％ＣＯ_２、湿度７０％でさらに５日間インキュベートした。トランスフェクションの５日後に、第２のＦｅｅｄ（商標）を培養物に添加し、それらを、３２℃、５％ ＣＯ_２、湿度７０％のインキュベーターに戻した。細胞培養物上清を、２５００ｒｐｍでの遠心分離によって回収し、次いで精製前に０．４５μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通した。培養物上清中の組換えｈｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体の発現を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびまた、ウエスタンブロット解析によって抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓタグ抗体［ＦＩＴＣ］、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ＃Ａ０１６２０）によって確認した。

３．４ ＨＵＬＲＰ１可溶性ミニ受容体の精製
ＨｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのタンデムニッケル－サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。試料を、ＨｉｓＰｒｅｐ（商標）ＦＦ １６／１０ Ｎｉ＋セファロース ２０ｍＬカラムに２．５ｍＭ ＮｉＣｌ_２の存在下で適用した。カラムクロマトグラフィーは、製造元の説明書に従って生成した。溶出後の試料をＨｉ Ｌｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰＡ、ＵＳＡ）に直接適用し、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３中に溶出した。ＨｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体含有画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット１０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳ、ＵＳＡ）を使用して製造元のプロトコルに従って濃縮した。精製された組換えタンパク質の濃度を、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ、Ｇｅｎｔｂｒｕｇｇｅ、ベルギー）でＡ２８０ｎｍにおいて測定し、濃縮物の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって検証した。

３．５ 結合研究（ＢＬＩおよびＳＰＲ）に使用したＬＲＰ１ドメイン
以下の表１に記載したタンパク質を、結合研究に使用した：

３．６ 結合研究（ＢＬＩおよびＳＰＲ）に使用したヘモペキシンバッチ
以下の表２に記載したヘモペキシンバッチを、結合研究に使用した：

３．７ 抗ペンタＨｉｓ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサー
ＢＬＩによる固定化ＬＲＰ１可溶性ミニ受容体へのヘム－ｈｐｘ複合体のリアルタイム結合解析では、抗ペンタＨｉｓバイオセンサーを使用した（図１）。これらは、特異性の高いペンタ－Ｈｉｓ抗体で予め固定化されている。タンパク質の固定化は、その後の動態解析のために、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を直接捕捉することによって達成した。

３．８ Ｏｃｔｅｔで行ったミニＬＲＰ１結合研究（ＢＬＩ）
前述のように、抗ペンタＨｉｓ抗体プレコートバイオセンサー（カタログ番号：１８－５１２０、ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＴｅｃｈＮｏｔｅ ４３：Ａｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ） ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＩＳ－ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、２０１９年）を使用した。種々のＬＲＰ１ドメインを、１０×動態バッファー（ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）中１５μｇ／ｍＬの濃度で固定化した。ヘム－Ｈｐｘ複合体を１０×動態バッファー（ＰＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した。ヘム－ヘモペキシン複合体の会合および解離動態は、２．５、１．２５、０．６２５および０．３１２５μＭの濃度で行った。各結合工程の設定は、以下の表３に示すように選択した。全ての実験に参照対照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含めた（センサーに分析物なしでリガンドをロード）。データは、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で３０℃において以下の設定で取得した：

データは、データ解析ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、バージョン９．０）によって解析した。データは、ｙ軸へのベースラインアライメント、工程間補正、参照センサー減算、およびＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙ Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇによる曲線平滑化を行うことによって、処理した。処理した動態データセットを、１：１結合モデルを使用して全体的にフィットさせた。フィッティングの正確度は、測定結果がデータの解析に使用したモデルから算出されたものにどの程度類似しているかを表すパラメーター、Ｃｈｉ^２およびＲ^２によって記載した。

３．９ Ｂｉａｃｏｒｅ（ＳＰＲ）で行ったミニＬＲＰ１結合研究
３．９．１ 定性的ヘモペキシン捕捉アッセイ
３．９．１．１ ヘム－Ｈｐｘ複合体を結合するＬＲＰ１ドメイン
標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ化学反応を使用して、ウサギ抗ヘモペキシンポリクローナル抗体をＣＭ５センサーチップのカルボキシメチルデキストラン表面に約１８，０００ＲＵまで直接固定化した。ＣＳＬ，Ｋａｎｋａｋｅｅ製のヘム－ｈｐｘ複合体を、各サイクルの始めにそれぞれフローセル２および４で約３５０ＲＵまで捕捉した。参照表面（フローセル１および３）は、抗ヘモペキシンポリクローナル抗体のみからなるものであった。ＬＲＰ１（詳細については表１を参照のこと）の各画分（ドメイン１、２および４）の１０μＭを、ヘムｈｐｘ捕捉抗体表面に１２０秒間注入した。

３．９．１．２ ヘム－Ｈｐｘ複合体を結合するＬＲＰ１．３
ＬＲＰ１．３（画分３、プ－ル－１、試料４２０４）を、２倍希釈系列で０．３１２～２０μＭの範囲の濃度で、ヘム－ｈｐｘ複合体捕捉表面に３０秒間にわたって二重反復で注入した。解離を６０秒間監視した。抗体表面を、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を４回、各２０秒間注入することによって、プレコンディショニングした。各サイクルの終わりに、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を２０秒間使用して、再生を行った。活性表面（フローセル２および４）からの生データを、参照表面（フローセル１および３）およびブランク注入からシグナルを減算することによって、二重参照した。

アッセイは、ｐＨ７．３の５ｍＭ ＣａＣｌ_２を補充したＨＢＳ－Ｎ中において３７℃で三重反復で行った。全てのバッファーおよび溶液は、使用前に濾過した（０．２２μｍ）

３．９．２ ＮＴＡ捕捉架橋アッセイ
ヘム－ｈｐｘ複合体結合ＬＲＰ１．３はまた、ＮＴＡチップを使用する捕捉架橋法を使用して解析した。Ｈｉｓタグ付きＬＲＰ１．３（（画分３、プール－１、試料４２０４）を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応を使用してＮＴＡチップのフローセル４に係留した。ＮＴＡチップ上におけるＬＲＰ１．３係留は、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用して予め活性化させた表面上にＨｉｓタグ－ニッケル－ＮＴＡ複合体を形成することによって、行った。同じように処理したがＬＲＰ１．３係留を行わなかったフローセル３を、参照セルとして使用した。固定化は中性ｐＨで行った。この方法は、Ｈｉｓタグ付きＬＲＰ１．３を１μｇ／ｍｌで１分間の注入で約８００ＲＵまで係留してリガンドを配向させることによって、チップ表面の不均一性を低減する。

捕捉架橋プロトコル法は、以下の工程に従って手動モードで行った：

係留後の表面の残留アミン活性は一晩バッファーを流すことによって非活性化した。エタノールアミンを使用する化学的非活性化工程は、リガンド活性に影響を及ぼすことが判明しているので、これによって回避した。

ヘム－ｈｐｘ複合体を、２倍希釈系列で０．６２～２０μＭの範囲の濃度で３０秒間にわたって二重反復で、２回注入した。解離を６０秒間監視した。複合体が完全に解離したため、サイクル間に再生工程は必要ではなかった。活性表面（フローセル４）からのセンサーグラムデータを、参照表面（フローセル３）およびブランク注入からシグナルを減算することによって、二重参照した。センサーグラムデータを、１：１定常状態モデルにフィットさせた。

４．結果および知見
４．１ ヒトＬＲＰ１可溶性ミニ受容体の発現および精製
ｈｕｌＲＰ１結合ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのヘモペキシン：ヘム結合特性を検討するために、本発明者らは、可溶性ミニ受容体のそれぞれをコードするプラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞において一過性に発現させた（ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩ（アミノ酸２５～１１３）、ＨｕＬＲＰ１結合ドメインＩＩ（アミノ酸８０６～１１８３）、ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩＩＩ（アミノ酸２４８１～２９４２）、ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩＶ（アミノ酸３２９３～３７８３））（図２）。ｈｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体の発現は、ｈｕＬＲＰＡＰ－１（ＲＡＰ）同時発現を伴ってまたは伴わずに実行した（図３Ａ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により、ＲＡＰ同時発現はｈｕＬＲＰ１ミニ受容体の分泌に必須ではないが、ＲＡＰ同時発現を伴うミニ受容体の発現が約２倍高いことが実証された（図３Ａ）。これは、ＲＡＰの同時発現がｈｕＬＲＰ１ミニ受容体の分泌を促進する可能性があることを示している（５）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により、全てのタンパク質がその予測分子量よりも高く移動することが実証された（ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩ－１２．３ｋＤａ、ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩＩ－４３．６ｋＤａ、ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩＩＩ－５３．４ｋＤａ、ｈｕＬＲＰ１結合ドメインＩＶ ５７．２ｋＤａ）。これは、グリコシル化による可能性が最も高い（図３Ａ～Ｃ）。

４．２ ヘム－ｈｐｘ複合体に対する結合ドメインとしてのＬＲｐ１．３の特定
ＬＲＰ１ドメインのうちのいずれがヘム－ｈｐｘ複合体に結合するかを検討および決定するために、ドメインのそれぞれを、発現Ｈｉｓタグを介してバイオセンサー（ＨＩＳ１Ｋ；抗ペンタＨｉｓ）に係留した。図４に示されるように、ＬＲＰ１の４つのリガンド結合ドメイン全てを、ヘム－ｈｐｘ複合体へのそれらの結合について試験した。ＬＲＰ１．３のみが複合体への明確な結合を示した。ＬＲＰ１．３は、単純な１：１動態モデルによって説明される約１．５μＭの親和性で、用量依存的にヘム－ｈｐｘ複合体に結合した。

４．３ 定性的ヘモペキシン捕捉ＳＰＲアッセイによるＩＲＰ１．３の確認
ＬＲＰ１の４つのドメイン全てを、チップ表面の固定化抗ｈｐｘ抗体を介してヘム－ｈｐｘ複合体を捕捉および固定化することにより、ヘム－ｈｐｘ複合体へのそれらの結合について試験した。アッセイ戦略は、図６Ａに概説する。ＢＬＩ結合実験で観察されかつ図５Ａに示されるように、ＬＲＰ１．３のみが複合体への明確な結合を示した。ＬＲＰ１．２への結合は示されていない。ヘモペキシン（１０μＭ）単独は、試験したＬＲＰ１画分への有意な結合を示さなかった（図５Ｃ）。さらに、ヘム－ｈｐｘ複合体に結合したＬＲＰ１．３を、約２μＭの親和性で用量依存的に試験した。濃度依存的な二次成分も観察され、データは単純な１：１動態モデルでは十分に説明できなかった（図６Ｂ）。したがって、代替的なアッセイセットアップを、動態パラメーターの推定のために使用した。

４．４ ＮＴＡ捕捉架橋ＳＰＲアッセイに基づく動態パラメーターの推定
次のステップで、前述のようにして、図７Ａに示すような代替的アッセイセットアップを開発した。図７Ｂに示されるように、ヘム－ｈｐｘ複合体はＬＲＰ１．３を用量依存的に結合し、表６に要約される約２μＭの定常状態親和性によって、再現性のあるＫ_Ｄを算出することができた。

決定された通り、ヘム－ｈｐｘ複合体結合ＬＲＰ１．３の親和性は、約２．６μＭと報告された。追加の複合体をこのアッセイセットアップで試験し、全てが約１．４μＭの同様な定常状態親和性を示していた（表７および図８）。

５．考察および結論
異なるＬＲＰ１免疫受容体（ドメイン）を発現できることにより、インビトロでのヘム－ヘモペキシン結合ドメインの特定が容易になった。要約すると、本発明者らは、異なる方法論（ＢＬＩおよびＳＰＲ）および異なる捕捉戦略を用いて、ＣＤ９１／ＬＲＰ１ドメインＩＩＩがヘム－ヘモペキシン複合体の結合に関与することを実証することができた。複合体形成していないヘモペキシン（ａｐｏＨｐｘ）は結合しないため、ヘモペキシンがヘム分子と複合体形成すると、結合が高特異性となる。これは、本研究で使用した両プラットフォームで再び、確認された。ＣＤ９１／ＬＲＰ１ドメインＩ、ＩＩおよびＩＶはいずれも、ヘムヘモペキシン複合体を結合しないことがさらに判明した。

さらに、本発明者らは、表８においてＬＲＰ１．３について要約する通り、使用したプラットフォームおよびヘモペキシンバッチとは独立して、類似した結合動態を実証することができた。

６．ヘム－ヘモペキシン複合体の調製
ヘム－ヘモペキシン（ヘム－ｈｐｘ）複合体の調製
１． ヘモペキシン（１００ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ ｐＨ７．４で約２８～３１ｍｇ／ｍＬ（約４６０～５０９μＭ）まで希釈する（最終容量＝バッチサイズに依存）。注：ヘモペキシン濃縮物は、既にＰＢＳ ｐＨ７．４中で約３０ｍｇ／ｍＬであるので、希釈を必要としない。
２． 層流のフード中にある状態で、攪拌棒を備えた、滅菌ボトルまたは熱ショックを与えたボトルに、ＰＢＳ希釈ヘモペキシンを０．２μｍ濾過する。
３． １０ｍＬを取り出し、滅菌バイアルに入れる。ヘミンを含まない対照として使用するために取っておく。
４． ６０，８８８の分子量を使用してＰＢＳ希釈ヘモペキシンのμＭ濃度を決定する。
５． １／５０希釈がヘモペキシンについて決定された同じμＭ濃度につながる濃度（通常、約１５～１７ｍｇ／ｍＬ）で、１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ ｎｏ：Ｄ２４３８－１０ｍＬ、滅菌濾過済、バイオパフォーマンス認定済、ＥＰ、ＵＳＰ試験仕様に適合）中、ヘミン（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ ｎｏ：Ｈ６５１－９、ｍ．ｗ．＝６５１．９４）を調製する。使用直前に調製する。最終容量はヘモペキシンバッチサイズに依存する。
６． ヘモペキシン中でヘミンを１／５０に希釈するのに必要な容量のヘミンを添加する。これにより、１００％飽和標的に対して等μＭのヘモペキシンおよびヘム（例えば、５００μＭ＋５００μＭ）が得られるはずである。これは、依然として層流フード下にある状態で行うべきである。
７． 直ちに、蓋締めして、反転および回旋によって混合する。
８． 工程ｃ）からの１０ｍＬのヘモペキシンを含むバイアル中でＤＭＳＯを１／５０希釈する。これを、飽和パーセントを決定するための対照およびブランクとして使用する。
９． 複合体と対照の両方を、撹拌プレートを装着したインキュベーター中で３７℃において一晩インキュベートし、穏やかに撹拌して、ヘム－ｈｐｘ複合体の形成を進行させる。
１０． 飽和分析のために１ｍＬの試料を取り出す。
１１． ２８～３１ｍｇ／ｍＬの初期ヘモペキシン濃度に基づき、約０．４５ｍｇ／ｍＬおよび０．２５ｍｇ／ｍＬへの、ＰＢＳ中における１０％ＤＭＳＯ中複合体および対照の２種の希釈物を調製する。これにより、約０．８３および約０．４５の４１４ｎｍ吸光度値が得られるはずである。
１２． ブランクとして対照を使用して、４１４ｎｍにおいて飽和パーセントを決定する。
１３． １２３．１の吸光係数を使用して、各濃度におけるヘム－ヘモペキシン複合体のμＭを算出する。
１４． 反応物中の複合体のμＭをヘモペキシンのμＭで除算し、１００を乗算して、飽和％を得る。最終飽和百分率の２つの読み取り値を平均する。

ヘム－ヘモペキシン複合体の限外濾過およびダイアフィルトレーション
１． ヘム－ｈｘ複合体を０．２μＭ濾過する。
２． ＢｉｏＭａｘ １０ｋｄ ｍｗｃｏ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎカセットを使用して、目標濃度／容量まで限外濾過する。
３． １０×容量のヘモペキシンＦＩＮバッファー（０．９ｍＭクエン酸塩、１４．１ｍＭ Ｓ．ホスフェート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に対してダイアフィルトレーションする。
４． ウルトラフィルトレーションして、最終目標容量まで戻す。
５． 分析のための保持液を取り出す。
６． 約０．４５ｍｇ／ｍＬおよび０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈して、ヘム－ｈｘ複合体のμＭおよびｍｇ／ｍＬを決定する。これは次に、飽和百分率を使用してヘモペキシンｍｇ／ｍＬを逆算するために使用できる。
７． 分取し、チューブにラベルを付ける。
８． －６５℃以下で冷凍する。

ヘモペキシン：ヘム複合体およびヘモペキシンに到達可能なヘムのアッセイ設計
１．序論
以下の実験の目的は、１－２４－ＦＬＡＧ－ＨｕＬＲＰ１－ドメインＩＩＩ（ＣＤ９１ドメインＩＩＩ）を、血液試料中のヘモペキシン：ヘム複合体を測定するためのコーティング試薬として使用できるかどうかを判定することである。このために、ヘモペキシン：ヘム複合体に特異的に結合するこのコンストラクトを、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートにコーティング試薬として適用する。インキュベーション後、ＬＰＲ１コーティングプレートを洗浄し、次いでＰＢＳ中１％カゼインでブロックして、非特異的結合を低減する。ブロック後、プレートを洗浄し、各試料を２つのフォーマットでプレートに添加する：
１． 血清試料を５０倍希釈し、アッセイして、ヘモペキシン：ヘム複合体を測定する。
２． 試料中のあらゆる遊離ヘムと複合体を形成するヘモペキシンで、スパイクしない（内因性複合体濃度を数量化する）およびスパイクする（ヘモペキシンに到達可能なヘムを測定するため）。

試料タイプ２は、ヘモペキシン：ヘム複合体のみを数量化する場合には省略してもよい。

本実施例２において言及する試料は、健常な個体または鎌状赤血球症患者のいずれかから入手した血清試料である。

試料のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、一次検出抗体である抗ヘモペキシンウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ａｂ４８１３５）と共にインキュベートする。プレートを洗浄してから、二次検出抗体であるヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体を添加する。別のインキュベーション後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに適用し、ＨＲＰ中で水素ペルキシダーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を還元して、青色に変色させる。硫酸の添加によって反応を停止させ、還元された水素ペルオキシダーゼを黄色に変色させる。その強度は、試料中に存在するヘモペキシン：ヘム複合体の濃度に比例する。

プレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍ（６２０ｎｍ対照）で読み取る。各試料からのヘモペキシン：ヘム複合体の濃度を、標準曲線から内挿する。ヘモペキシンに到達可能なヘムの相対的準定量的濃度を、スパイクなしの試料中に存在するヘモペキシン：ヘム複合体の濃度（Ａ）をヘモペキシンスパイクありの試料中に存在するヘモペキシン：ヘム複合体の濃度（Ｂ）から減算することによって、決定する。得られたデルタヘモペキシン：ヘム複合体濃度（Ｂ－Ａ）を、ヘモペキシンの分子量で除算する。ヘムはヘモペキシンに１：１の比で結合するので、デルタ値をヘモペキシンの分子量で除算した後に得られる濃度は、試料中のヘモペキシンに到達可能なヘムの相対的準モル濃度（Ｃ）である。

到達可能なヘムの相対濃度（Ｃ）＝（［スパイクあり（Ｂ）－スパイクなし（Ａ）］／６３０００）＊１０００（μＭ）

２． 機器およびソフトウェア
・ １μＬ～１ｍＬを送出可能なキャリブレーション済み容量可変シングルチャンネルピペット
・ １μＬ～３００μＬを送出可能なキャリブレーション済み容量可変マルチチャンネルピペット
・ Ａ４５０ｎｍで読み取り可能なプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｍ２００または同等品）
・ ＭａｇｅｌｌａｎソフトウェアＶ７．２
・ Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ
・ プレートシェーカー（Ｍｉｃｒｏｍｉｘ ５または同等品）
・ ボルテックスミキサー
・ タイマー
・ ９６ウェルプレートウォッシャー（ウェル当たり３００μＬを分配して、５回の洗浄を実行可能でなければならない）

３．材料
・ ９６Ｆ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ Ｎｏ．４３９４５４）

４．試薬
・ １－２４－ＦＬＡＧ－ＨｕＬＲＰ１ドメインＩＩＩ（ＣＤ９１ドメインＩＩＩ）
・ ヘモペキシン：ヘム複合体
・ ヘモペキシン
・ Ａｂｃａｍ抗ヘモペキシンウサギポリクローナル抗体一次検出（１．０５６ｍｇ／ｍＬ）Ｃａｔ Ｎｏ．Ａｂ４８１３５。
・ ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体二次検出（Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｃａｔ Ｎｏ．５２２０－０３３６）
・ ブロッキングバッファー／アッセイ希釈液 ＰＢＳ中１％カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ Ｎｏ．３７５２８）
・ Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．＃Ｄ８５３７）
・ 洗浄バッファー：１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ
・ 基質：ＴＭＢ ＡおよびＢ（ＫＰＬ Ｃａｔ Ｎｏ．５１２０－００４９および５１２０－００３８）
・ 停止液：硫酸（０．５Ｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ Ｎｏ．１２４２４００１０）

５．操作／手順
５．１ 試薬の調製
・ １－２４－ＦＬＡＧ－ＨｕＬＲＰ１ドメインＩＩＩ（ＣＤ９１ドメインＩＩＩ）
○ ５μｇ／ｍＬで必要；Ｄ－ＰＢＳで希釈
○ プレート当たり１１ｍＬが必要
・ 一次検出抗体：抗ヘモペキシンウサギポリクローナル
○ １μｇ／ｍＬで必要；ブロッキングバッファー／アッセイ希釈液（ＰＢＳ中１％カゼイン）で希釈
○ プレート当たり１１ｍＬが必要
・ 二次検出抗体：ヤギ抗ウサギＨＲＰ
○ ストック試薬は１／２０００に希釈する必要があり、ブロッキングバッファー／アッセイ希釈液（ＰＢＳ中１％カゼイン）で希釈
○すなわち、１０９９４．５μＬのブロッキングバッファー／アッセイ希釈液に５．５μＬのＨＲＰ
・ 基質：ＴＭＢ ＡおよびＢ
○ 使用直前にＴＭＢ溶液ＡとＢを等容量で合わせる。
○ プレート当たり１２ｍＬが必要
○すなわち、６ｍＬのＴＭＢ Ａ＋６ｍＬのＴＭＢ Ｂ

５．２ 標準の調製
ヘモペキシン：ヘム複合体から、標準曲線を作成する。以下の前希釈（ＰＤ）工程は、ブロッキングバッファー／アッセイ希釈液（ＰＢＳ中１％カゼイン）中で実行する。

次いで、表２に示すように、アッセイの日にＰＤ１をブロッキングバッファー／アッセイ希釈液（ＰＢＳ中１×カゼイン）で２倍段階希釈することによって、標準曲線を作成する。

５．３ 対照の調製
陽性対照（ＰＣ）はヘモペキシン：ヘム複合体である。ＰＣは、１００％のプールしたヒト血清で表３に従って調製する。陰性対照（ＮＣ）は、ＰＣの調製に使用するのと同じ、１００％のプールしたヒト血清である。

・ プレーティング前に、ＰＣおよびＮＣに５０倍希釈を適用する。すなわち、５μＬの対照＋２４５μＬのブロッキングバッファー／アッセイバッファー。

５．４ 試験試料の調製
・ 試験試料は、アッセイを行う前に室温で解凍すべきである。検証中に判定されるように、試料は２４時間までは室温（ＲＴ）で安定である。試験試料は、ヘモペキシン：ヘム複合体（試料タイプ１）のみとして、またはヘモペキシン：ヘム複合体（１）とヘモペキシン：到達可能なヘム（試料タイプ２）の両方としてアッセイすることができる。
・ ヘモペキシン：ヘム複合体（試料タイプ１）の読み取り：
○ 血清試料をブロッキングバッファー／アッセイ希釈液で５０倍希釈する。
すなわち、５μＬの対照を２４５μＬブロッキングバッファー／アッセイ希釈液に入れる。
・ ヘモペキシンに到達可能なヘム（試料タイプ２）の読み取り：
○ 表４に従って、各試験試料に５００μｇ／ｍＬのヘモペキシンをスパイクする。室温で３０分間インキュベートする。
○ スパイクなしの試料は、最終的なヘモペキシンスパイクに従ってＤＰＢＳで希釈しなければならない。
○ すなわち、２．５μＬのＤＰＢＳを４７．５μＬの血清に入れる。注：これは、スパークありの試料と同じ希釈係数で、スパイクなしの試料の内因性複合体濃度を調整するために行わなければならない。
○ スパイクありの試料に５０倍希釈を適用する。すなわち、５μＬの対照を２４５μＬのブロッキングバッファー／アッセイ希釈液に入れる。

５．５ アッセイ手順
１． Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ ９６ウェルプレートに、捕捉コーティング溶液をウェル当たり１００μＬでコーティングする。プレートシーラーでプレートを覆い、ＲＴで１時間（±５分間）振盪しながらインキュベートする。
２． プレートを、ウェル当たり少なくとも２００μＬの１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファーで５回洗浄する（プレートウォッシャーまたは手動）。
３． プレートを、ウェル当たり２００μＬのブロッキングバッファー／アッセイ希釈液（ＰＢＳ中１％カゼイン）でブロックする。プレートシーラーでプレートを覆い、ＲＴで１時間（±５分間）振盪しながらインキュベートする。
４． プレートを、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファーで５回洗浄する（プレートウォッシャーまたは手動）。
５． 適当なウェルに、１００μＬの標準／対照／試料を添加する。プレートシーラーでプレートを覆い、ＲＴで１時間（±５分間）振盪しながらインキュベートする。
６． プレートを、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファーで５回洗浄する（プレートウォッシャーまたは手動）。
７． ウェル当たり１００μＬの抗ヘモペキシンウサギポリクローナル抗体一次検出溶液を添加する。プレートシーラーでプレートを覆い、ＲＴで１時間（±５分間）振盪しながらインキュベートする。
８． プレートを、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファーで５回洗浄する（プレートウォッシャーまたは手動）。
９． ウェル当たり１００μＬのヤギ抗ウサギＨＲＰ二次検出を添加する。プレートシーラーでプレートを覆い、ＲＴで１時間（±５分間）振盪しながら、光から保護して、インキュベートする。
１０． プレートを、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファーで５回洗浄する（プレートウォッシャーまたは手動）。
１１． ウェル当たり１００μＬの基質を添加し、ＲＴで３．５分間または最適な色の変化まで、振盪しながらインキュベートする。ウェル当たり５０μＬの停止液（硫酸０．５Ｍ）を、ＴＭＢを加えたのと同じピペット操作の向きで添加する。
１２．停止液を加えて１０分以内に４５０ｎｍ（６２０ｎｍ対照）においてプレートリーダーでプレートを読み取る。

６．ヘモペキシン：ヘムアッセイおよびヘモペキシンに到達可能なヘムのアッセイの検証データ
６．１ システムの適合性
１． １０の別個のアッセイを、二重反復でプレーティングして、１０点標準曲線を用いて行った。標準曲線は、５パラメーターのロジスティック曲線フィットを用いて、Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウェアを使用してフィットさせて、Ｒ値を生成し、ＣＶおよびＲＥをＥｘｃｅｌで算出した。
２． 以下に示すように、１０個の検証プレートのうち８つが、２５％内で許容可能な％ＣＶおよび％ＲＥを生成した。したがって、アッセイ標準曲線は、適格なアッセイに適合すると考えられた。

７．特異性
遊離ヘモペキシン（アポヘモペキシン）とヘモペキシン：ヘム複合体との間の交差反応性を評価するために、アッセイ特異性を試験した。ヘモペキシン：ヘム複合体または遊離ヘモペキシンのいずれかを使用して、７点標準曲線を作成した。図９に示されるように、アッセイは、ヘムに結合したヘモペキシンに特異的であり、遊離ヘモペキシンには結合しない。

８．中間精度／同時再現性
ヘモペキシン：ヘム複合体から作製された５つの陽性対照（ＵＨＰＣ、ＨＰＣ、ＭＰＣ、ＬＰＣ、ＵＬＰＣ）および陰性対照（ＮＣ）を、同時再現性について評価した（アッセイ内（１つのアッセイランにおいて３組の三重反復試験）、アッセイ間（１人の操作者による３つの独立したアッセイラン）および操作者間精度（２人の操作者が、それぞれ２つのアッセイランを実行））。

表６、７、および８に示すように、陰性対照は全てのパラメーターでＣＶ＜２５％であった。表６、７、および８に示すように、ＨＰＣ、ＭＰＣ、ＬＰＣおよびＵＬＰＣは、％ＣＶが２５％未満であるため、許容可能な精度を示した。

９．正確度
正確度は、精度のために作成された同じデータを使用して評価した（節７．３）。対照の正確度は、各セットのＮＣ（バックグラウンド）減算後に算出した。表６、７および８に示すように、ＨＰＣ、ＭＰＣ、ＬＰＣおよびＵＬＰＣは許容可能な正確度を示した（ＨＰＣ、ＭＰＣ、ＬＰＣではＲＥ±≦２５％、およびＵＬＰＣではＲＥ±≦３０％）。ＵＨＰＣはその正確度基準に不合格であった（ＲＥ±３０％）。これは、範囲（節７．５）においてさらに論じるように、アッセイ数量化上限をＨＰＣ濃度（プレート上で２０μｇ／ｍＬ）に低減する。

１０．範囲および定量化限界
既知量のヘモペキシン：ヘムスパイク対照をスパイクした、プールした健常血清対照を、標準曲線と組み合わせて使用して、ＣＶ≦２５％およびＲＥ±≦３０％に従う最高濃度および最低濃度を評価することによって、アッセイ範囲を求めた。アッセイの数量化の有効範囲は、スパイク対照の精度および正確度に基づく。アッセイの数量化の上限は、１０００μｇ／ｍＬ（プレート上で２０μｇ／ｍＬ）であり、数量化の下限は５０μｇ／ｍＬ（プレート上で１μｇ／ｍＬ）であると決定されている。アッセイの最低検出限界を決定するために、ヘモペキシン：ヘム複合体を、プールしたヒト血清に試料の５０倍希釈において５００μｇ／ｍＬでスパイクした。５０倍希釈後、アッセイ前に、スパイクありの試料を、スパイクなしの同様に希釈した血清試料と平行して、段階希釈した。

上記に示されるように、０．１５μｇ／ｍＬのプレート上濃度で許容可能なＲＥ（≦３０％）が達成された。したがって、アッセイの数量化範囲は、対照の性能に基づき、１００％ヒト血清において５０～１０００μｇ／ｍＬ（プレート上１～２０μｇ／ｍＬ）と決定される。しかし、範囲のデータに基づき、バックグラウンド減算後のプレート上では、０．１５μｇ／ｍＬまで低下した、許容可能な検出が達成された。したがって、ヘモペキシン：ヘム複合体のアッセイ検出限界は、バックグラウンド減算後のプレート上濃度で０．１５μｇ／ｍＬである。０．１５～１μｇ／ｍＬの濃度は、ある程度の不確実性を適用して、報告することができる。

１１．ｈｐｘに到達可能なヘムのアッセイの選択性
ヘモペキシンに到達可能なヘムの選択性については、個体を最初に、ヘモペキシンをスパイクして、各試料内に遊離ヘムと追加の複合体を生成することによって、評価した。ヘモペキシンに到達可能なヘムの相対濃度を、
ヘモペキシンに到達可能なヘムの相対濃度（μＭ）（Ｃ）＝（［スパイクあり（Ｂ）－スパイクなし（Ａ）］／６３０００）＊１０００
として計算した。

結果から、個体が血清中に基底レベルのヘモペキシン：ヘム複合体を有する間は、試験した試料中において遊離ヘムが比較的まれであることが示された。

ヘモペキシン単独をスパイクした場合（Ｂ）には、全ての個体において、内因性ヘモペキシン：ヘム複合体濃度（Ａ）を超える増加を検出できた（デルタ複合体濃度は０μｇ／ｍＬ超であった）。結果から、ＳＣＤ血清および血漿個体ならびに溶血個体（１人のドナーを除く）内のヘモペキシン：ヘム複合体の内因性濃度が低いことが示されたが、ヘモペキシンの添加は全試料においてわずかに陽性のデルタ複合体濃度を引き起こし、到達可能なヘムの陽性の測定値がもたらされた。

１２．結論
ヒト血清および血漿中のヘモペキシン：ヘム複合体およびヘモペキシンに到達可能なヘムの決定の適格な検証により、アッセイが、血清試料中の到達可能なヘムの複雑で相対的な傾向の準定量的なアッセイとしての使用に適合することが示された。ヘモペキシン：ヘム複合体のプレート上の数量化範囲は、１００％ヒト血清中５０～１０００ｇ／ｍＬ（プレート上１～２０μｇ／ｍＬ）と定義され、検出限界は、ある程度の不確実性を伴って０．１５μｇ／ｍＬ（プレート上濃度、バックグランドを除算）まで低下した。このアッセイは、遊離アポヘモペキシンとは対照的に、ヘムと複合体形成したヘモペキシンに対して選択的である。このアッセイは、許容可能なアッセイ間、アッセイ内、操作者間の精度および正確度を示した。ヘモペキシンに到達可能なヘムの決定は、このアッセイの複雑な数量化の側面と同じ結果をたどる。

このＥＬＩＳＡベースのアッセイは、１．）ヘモペキシン：ヘム複合体を準定量化するための、および２．）ヘモペキシンをスパイクした血清試料からの、相対的なヘモペキシンに到達可能なヘムを決定するための、適格なアッセイである。このアッセイは、ヘモペキシン：ヘム複合体濃度のみを測定する単一成分アッセイとして、またはヘモペキシン：ヘム複合体濃度およびヘモペキシンに到達可能なヘムを測定する２パートアッセイとして実行することができる。

１３． 定義／略語
Ｃｏｎｃ 濃度
ＣＶ 変動係数
ＤＦ 希釈係数
Ｈｐｘ ヘモペキシン
Ｈｐｘ：ヘム ヘモペキシン：ヘム複合体
μｇ／ｍＬ ミリリットル当たりのマイクログラム
ＯＤ 光学濃度
ＳＣＤ 鎌状赤血球症
ＵＨＰＣ 超高陽性対照
ＨＰＣ 高陽性対照
ＭＰＣ 中陽性対照
ＬＰＣ 比較的低い陽性対照
ＵＬＰＣ 超低陽性対照

Claims (17)

1. 生体試料中のヘモペキシン－ヘム複合体の検出のためのＣＤ９１ポリペプチドの使用であって、ＣＤ９１ポリペプチドは、３００～１０００アミノ酸長を有し、かつヘモペキシン－ヘム複合体に結合できるＣＤ９１のリガンド結合ドメインＩＩＩまたはその断片を含むまたはそれからなる、使用。
2. ＣＤ９１ポリペプチドは、４００～９００アミノ酸長、５００～９００アミノ酸長、５００～８００アミノ酸長、６００～９００アミノ酸長または６００～８００アミノ酸長を有する、請求項１に記載の使用。
3. ＣＤ９１ポリペプチドは、配列番号２によるアミノ酸配列もしくは対応する、相同ＣＤ９１のアミノ酸配列を含む、または配列番号２の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％のアミノ酸同一性を有するもしくは配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは１００％のアミノ酸相同性を有する、アミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の使用。
4. ポリペプチドは、シグナルペプチドおよび／または１種もしくはそれ以上のタグをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
5. ＣＤ９１ポリペプチドは、固体支持体に連結されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。
6. 固体支持体はウェルプレートである、請求項５に記載の使用。
7. 検出は、イムノアッセイ、好ましくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することによって実行される、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。
8. 生体試料中のヘモペキシン－ヘム複合体の量が決定される、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用。
9. 対象における溶血を診断もしくは監視するための、または対象における溶血もしくは溶血に関連する状態の治療を監視するための、好ましくは対象における溶血もしくは溶血に関連する状態の、ヘモペキシンによる治療を監視するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用。
10. 生体試料からヘモペキシン－ヘム複合体をインビトロで分離するためのまたは体外で分離するための、請求項１～６のいずれか１項において定義されたＣＤ９１ポリペプチドの使用。
11. 生体試料からヘモペキシン－ヘム複合体を枯渇させることを含む、請求項１０に記載の使用。
12. 生体試料中のヘモペキシン－ヘム複合体を検出するためのインビトロの方法であって、請求項１～６のいずれか１項において定義されたＣＤ９１ポリペプチドと共に生体試料をインキュベートする工程と、ＣＤ９１ポリペプチドとヘモペキシン－ヘム複合体との間の結合を検出する工程とを含む、方法。
13. 検出は、請求項７または８に定義されたようにして実行される、請求項１２に記載の方法。
14. 生体試料中のヘモペキシン－ヘム複合体の量を決定することをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 対象における溶血を監視するための、または溶血もしくは溶血に関連する状態の治療を監視するための、好ましくは溶血もしくは溶血に関連する状態の、ヘモペキシンによる治療を監視するための、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 請求項１～６のいずれか１項において定義されるＣＤ９１ポリペプチドを含むキット。
17. 請求項１～６のいずれか１項において定義されるＣＤ９１ポリペプチドが連結されている固体支持体。

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