PT1723172E

PT1723172E - Reformulação líquida de eritropoietina

Info

Publication number: PT1723172E
Application number: PT05707735T
Authority: PT
Inventors: Christof Schumann; Jan-Ole Hesse
Original assignee: Bioceuticals Arzneimittel Ag
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2007-10-29
Also published as: PL1723172T3; DE102004011663A1; US7767644B2; CY1106954T1; CA2558985A1; DE102004011663B4; EP1806361A1; EP1723172B1; EP1723172A1; DE502005010276D1; JP2007536215A; WO2005087804A1; CA2558985C; DE202004020676U1; ATE481419T1; ATE369382T1; US20080039371A1; SI1723172T1; EP1806361B1; JP4887281B2

Description

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO LÍQUIDA DE ERITROPOIETINA" A presente invenção refere-se a formulações líquidas de eritropoietina estáveis ao armazenamento e a um processo para a sua preparação. Em particular, a invenção refere-se a formulações líquidas de eritropoietina que contêm pelo menos quatro aminoácidos seleccionados do grupo composto por leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, ácido aspártico e fenilalanina e nas quais se pode prescindir da adição de agentes de conservação, ureia ou albumina de soro humano. A eritropoietina, denominada abreviadamente por EPO, é uma glicoproteína que estimula a formação de eritrócitos na medula óssea. A EPO é formada essencialmente nos rins e alcança, a partir daí, através da circulação sanguínea, o seu local alvo. No caso de insuficiência renal, os rins lesados não produzem EPO suficiente ou não produzem de todo qualquer EPO, o que tem como consequência que não se produzam eritrócitos suficientes a partir das células estaminais da medula óssea. Esta anemia renal pode ser tratada através da administração de EPO em quantidades fisiológicas, que estimulam a formação de eritrócitos na medula óssea. A EPO utilizada para a administração pode ser obtida a partir de urina humana ou pode ser produzida por métodos de tecnologia genética. Uma vez que a EPO no corpo humano apenas está contida em vestígios pequenos, o isolamento da EPO a partir de fontes naturais para aplicações terapêuticas é praticamente impossível. Por conseguinte, os métodos de tecnologia genética 1 oferecem a única possibilidade económica de produzir esta substância em maiores quantidades. A preparação recombinante de eritropoietina é possível desde a identificação do gene da eritropoietina humana no ano de 1984. Desde o início dos anos 90 têm sido desenvolvidos diferentes medicamentos que contêm eritropoietina humana que foi produzida por via de tecnologia genética em células eucariotas, sobretudo em células de CHO (ovário de hamster chinês) . A preparação de eritropoietina humana recombinante está descrita, por exemplo, nos documentos EP-A-0148605 e EP-A-205564. A EPO é formulada habitualmente na forma líquida e é injectada como tal por via intravenosa ou subcutânea. No entanto, no caso da formulação líquida de EPO, resultam problemas relativamente à estabilidade. Estes são possivelmente devidos a uma destruição das moléculas de eritropoietina por efeitos catalíticos da superfície dos recipientes que servem para a conservação. Além disso, supõe-se que ocorre uma adsorção das moléculas de EPO à parede do recipiente e que conduz a uma perda em proteína e actividade. Por conseguinte, no passado, tentaram-se diferentes preparações para estabilizar formulações líquidas de EPO através da adição de diferentes substâncias. Estes compostos estabilizadores incluem, por exemplo, substâncias poliméricas, como polietilenoglicol, dextranos e gelatina, bem como diversos açúcares e álcoois de açúcar, sais inorgânicos e compostos tiol. São também frequentemente adicionadas proteínas do soro, como albumina de soro humano (HSA). No entanto, a utilização destas proteínas do soro não é desejável sob o ponto de vista alergénico e imunológico.

No documento EP-A-0306824 é descrita a utilização de 2 diferentes aminoácidos como estabilizadores em formulações de EPO, em que os aminoácidos são empregues em conjunto com ureia para a estabilização da EPO. Além disso, o armazenamento das formulações descritas no documento EP-A-0306824 não se realiza na forma liquida, mas como liofilizado, que é reconstituído com água imediatamente antes da utilização.

No documento EP-A-0607156 são descritas formulações de EPO que são estáveis e duráveis graças à presença de um agente de conservação. É objectivo da presente invenção preparar uma preparação de EPO estável ao armazenamento, que possa ser armazenada na forma líquida durante mais tempo e que não necessite de substâncias aditivas como HSA, ureia ou agente de conservação. Deste modo deve ser disponibilizada uma formulação líquida estável de EPO, que evite o mais possível qualquer risco para a inocuidade da formulação.

Este objectivo é solucionado de acordo com a invenção pelo objecto da reivindicação 1. Nas reivindicações dependentes são definidas formas de realização preferidas.

Descobriu-se que composições de EPO que contêm uma combinação determinada de aminoácidos podem ser armazenadas na forma líquida de modo estável durante mais tempo, também na ausência de HSA, ureia ou agentes de estabilização poliméricos, sem que ocorram perdas de estabilidade significativas. A presente invenção refere-se assim a uma formulação líquida de eritropoietina estável ao armazenamento, que (i) contém pelo menos quatro aminoácidos seleccionados do 3 grupo composto por leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, ácido aspártico e fenilalanina, (ii) está livre de agentes de conservação, ureia e proteínas do soro, e (iii) não foi reconstituída a partir de um liofilizado.

Numa forma de realização particularmente preferida está contido adicionalmente o aminoácido glicina. A formulação líquida de acordo com a invenção não oferece apenas as vantagens de prescindir de compostos potencialmente imunogénicos e de conter, na totalidade, um número tão pequeno quanto possível de diferentes classes de compostos, mas de também não requerer uma liofilização em qualquer fase da preparação. Deste modo, por um lado, poupam-se os custos associados a uma liofilização, por outro lado evitam-se os riscos de problemas mecânicos, p. ex. quando o liofilizado não se deixa reconstituir completamente ou de modo suficiente.

Sob o termo "estável ao armazenamento" entende-se, no âmbito da presente invenção, que o teor em moléculas de EPO activas perfaz ainda 80%, ou mais, da concentração de partida, após um armazenamento de três meses da formulação líquida de EPO a 25 °C. De um modo preferido, o teor residual em actividade da EPO, após um armazenamento de três meses a 25 °C, perfaz ainda pelo menos 85%, de um modo mais preferido pelo menos 90% e de um modo o mais preferido pelo menos 95% da actividade de partida. A actividade da eritropoietina pode ser determinada por meio de testes de actividade habituais, como estão já descritos para a EPO no estado da técnica, veja-se adicionalmente também a Farmacopeia Europeia, 01/2002: 1316 (4a edição). 4

Sob o termo "formulação líquida" entende-se, no âmbito da presente invenção, que a formulação de eritropoietina em associação com as outras substâncias contidas na formulação não é liofilizada em qualquer fase do processo de preparação, portanto nem antes, nem durante ou após a mistura das substâncias, e a formulação é destinada para a aplicação intravenosa ou subcutânea como solução para injecção ou infusão. A formulação de acordo com a invenção não contém quaisquer aminoácidos que não sejam leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, ácido aspártico, fenilalanina ou glicina. De um modo preferido, a formulação não contém quaisquer outros aminoácidos além de leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, fenilalanina e glicina. Em particular, a formulação de EPO de acordo com a presente invenção não contém quaisquer aminoácidos básicos. A formulação não contém igualmente qualquer ácido aminoacético. A ausência obrigatória de proteínas do soro ou de outras proteínas de estabilização, de ureia e de agentes de conservação na formulação de acordo com a invenção foi já mencionada acima. A concentração de isoleucina e leucina, desde que estes aminoácidos estejam contidos na formulação, perfaz respectivamente 0,25 até 1,5 g/L, de um modo preferido 0,5 até 1,25 g/L, e de um modo preferido em particular 1,0 g/L. A concentração de ácido glutâmico e ácido aspártico, desde que estes aminoácidos estejam contidos na formulação, perfaz 0,1 até 0,5 g/L, de um modo preferido 0,2 até 0,4 g/L, e de um modo preferido em particular 0,25 g/L. A concentração de treonina, desde que este aminoácido 5 esteja contido na formulação, perfaz 0,1 até 0,5 g/L, de um modo preferido 0,2 até 0,4 g/L, e de um modo preferido em particular 0,25 g/L. A concentração de fenilalanina, desde que este aminoácido esteja contido na formulação, perfaz 0,2 até 1,0 g/L, de um modo preferido 0,3 até 0,8 g/L, e de um modo preferido em particular 0,5 g/L. A concentração de glicina na formulação de acordo com a invenção, desde que este aminoácido esteja contido na formulação, perfaz 2,0 até 10,0 g/L, de um modo preferido 5,0 até 8,0 g/L, e de um modo preferido em particular 7,5 g/L. A eritropoietina que se adequa para a utilização nas formulações de acordo com a invenção é eritropoietina recombinante, preparada em células eucariotas. De um modo preferido, a eritropoietina recombinante é preparada em células de mamífero, de um modo preferido em células de CHO, como descrito p. ex. nos documentos EP-A-0205564 e EP-A-0148605. Após a fermentação, que se realiza de acordo com protocolos usuais, efectua-se uma purificação da eritropoietina recombinante por meio de métodos cromatográficos. Tanto a fermentação, como também a purificação da proteína estão igualmente descritas no estado da técnica, p. ex. no documento EP-A-0830376. A purificação de eritropoietina é também objecto dos documentos EP-A-0228452, EP-A-0428267 e WO-A-03/045996. Porém também podem ser aplicadas outras técnicas habituais de purificação e sequências de passos de purificação.

Por "eritropoietina" entende-se, no âmbito da presente invenção, qualquer proteína que seja capaz de estimular a 6 formação de eritrócitos na medula óssea e possa ser inequivocamente identificada como eritropoietina (determinação da actividade em murganhos policitémicos ou normocitémicos) no teste descrito na Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.; 01/2002: 1316) . A eritropoietina pode ser eritropoietina humana do tipo selvagem ou uma variante desta com uma ou várias substituições, deleções ou adições de aminoácidos. A eritropoietina contida na formulação de acordo com a invenção pode ser igualmente de um conjugado no qual a proteína está presente na forma conjugada, p. ex. com polímeros, como por exemplo, polialquilenoglicóis, a designada eritropoietina pegilada.

Numa forma de realização preferida, a formulação de acordo com a invenção não contém nem açúcar, nem álcoois de açúcar para a estabilização. É igualmente preferido que a formulação não contenha quaisquer compostos poliméricos como agentes de estabilização. A formulação é além disso livre de agentes de conservação, em que aqui se entendem substâncias que são empregues habitualmente como agentes de conservação para o aumento da estabilidade e as quais, nas concentrações usuais neste caso, actuam de forma bactericida. A formulação não contém, em particular, quaisquer agentes de conservação como cloretona, álcool benzílico, p-cloro-m-cresol e éster dialquílico do ácido pirocarbónico e cloreto de benzalcónio. O valor de pH da formulação não se encontra consideravelmente, acima do valor de pH do sangue, portanto, tanto quanto possível, não acima de 7,4. 0 valor de pH da formulação perfaz em regra entre 6,0 e 7,4, de um modo preferido entre 6,5 e 7,4, e de um modo preferido em particular entre 7,0 e 7,4. Caso seja necessário um ajuste para a gama de pH desejada, o valor de pH é ajustado com soluções adequadas, com 7 soluções ácidas quando é indicada uma diminuição do valor de pH, com soluções básicas quando é visado um aumento. De um modo preferido, o valor de pH é ajustado com HC1 ou NaOH.

Como solvente é utilizada, de um modo preferido, água purificada para finalidades de injecção. Porém, também podem ser empregues outros solventes habituais e adequados para preparações farmacêuticas. 0 tampão empregue, pode ser qualquer tampão fisiologicamente aceitável que possibilite tamponar na gama de pH acima indicada, nas concentrações necessárias para as soluções de injecção ou infusão. São tampões adequados, p. ex., fosfato, citrato, carbonato e HEPES. É preferida a utilização de um tampão fosfato. 0 composto ou compostos tampão são empregues numa concentração de cerca de 20 até 100 mM, de um modo preferido 30 até 80 mM, e de um modo preferido em particular 40 até 60 mM.

Numa forma de realização preferida, a formulação de acordo com a invenção contém como componente adicional um agente tensioactivo. A utilização de um detergente deve diminuir a adsorção de EPO às paredes do recipiente. Para o efeito são suficientes, em regra, quantidades pequenas de um detergente. Fundamentalmente, no âmbito da presente invenção, pode ser empregue qualquer detergente fisiologicamente aceitável. São adequados de um modo particular éster alquílico de polioxietileno sorbitano ou trioleato de sorbitano, em que é preferido de um modo particular éster alquílico de polioxietileno sorbitano. No caso do éster alquílico de polioxietileno sorbitano trata-se, de um modo preferido, de polissorbato 20 e/ou polissorbato 80, em que o mais preferido é polissorbato 20. A concentração do detergente perfaz entre 0,01 até 1,0 g/L, de um modo preferido entre 0,05 e 0,2 g/L e de um modo o mais preferido 0,1 g/L.

Em formas de realização preferidas, a formulação contém adicionalmente quantidades pequenas de um agente complexante fisiologicamente aceitável. O agente complexante é, por exemplo, sais de cálcio, citrato ou EDTA. São preferidos de um modo particular, no âmbito da presente invenção, sais contendo cálcio, como p. ex. cloreto de cálcio. A concentração do sal de cálcio perfaz entre 0,005 e 0,05 g/L, de um modo preferido entre 0,008 e 0,012 g/L, e de um modo preferido em particular 0,01 g/L.

Para o ajuste da osmolaridade pode ser empregue qualquer sal adequado. Para o efeito é utilizado de um modo preferido cloreto de sódio. Neste caso, a concentração do cloreto de sódio encontra-se na gama de 0,5 até 2,5 g/L, de um modo preferido entre 1,0 e 2,0 g/L, e de um modo preferido em particular entre 1,3 e 1,6 g/L. A osmolaridade da formulação liquida perfaz 200 até 400 mOsmole/kg, de um modo preferido 250 até 300 mOsmole/kg, e de um modo o mais preferido 260 até 290 mOsmole/kg.

Uma forma de realização preferida da invenção prevê uma formulação liquida de EPO que, a par da substância activa EPO, contém os aminoácidos leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, fenilalanina e glicina, bem como cloreto de cálcio, polissorbato, tampão fosfato e cloreto de sódio, em que não existem ingredientes adicionais. 9 A actividade da eritopoietina utilizada não deverá encontrar-se abaixo de 100.000 IE/mg (veja-se também Farmacopeia Europeia, 01/2002: 1316 (4a edição). De um modo preferido, a eritropoietina tem uma actividade de pelo menos 110.000 IE/mg, de um modo preferido em particular de pelo menos 120.000 IE/mg. A concentração em eritropoietina regula-se pela respectiva concentração desejada de substância activa na injecção terminada. Concentrações típicas de EPO encontram-se entre 1500 IE/mL até 40.000 IE/mL, vejam-se p. ex. os produtos comerciais NeoRecormon® e Erypo® na ROTE LISTE 2004.

Os componentes da formulação podem ser adquiridos de fontes habituais, p. ex. da firma Sigma ou da firma Merck. A preparação da formulação pode realizar-se de acordo com métodos usuais no estado da técnica. A invenção refere-se também a um processo para a preparação da formulação líquida de EPO de acordo com a invenção. Neste caso, os componentes da formulação acima indicados são dissolvidos num tampão aquoso. O tampão aquoso é, como exposto acima, de um modo preferido, um tampão fosfato.

Numa forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção para a preparação da formulação líquida, em primeiro lugar, é providenciado o solvente, de um modo preferido água para finalidades de injecção, e em seguida são dissolvidos, no solvente, di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado e hidrogenofosfato dissódico di-hidratado como tampão, cloreto de cálcio, cloreto de sódio e os aminoácidos empregues, nos quais se trata, de um modo preferido, de glicina, leucina, isoleucina, 10 treonina, ácido glutâmico e fenilalanina. Após dissolução completa dos componentes é adicionada uma solução de polissorbato (no solvente respectivo). Finalmente, no passo seguinte, é adicionada uma solução de eritropoietina (no solvente respectivo).

Durante a preparação e no final da preparação, o valor de pH da solução é determinado e, caso necessário, é corrigido para a gama entre 7,0 e 7,4, por adição de soluções adequadas, em particular NaOH ou HC1.

Finalmente, a formulação liquida terminada é colocada num recipiente adequado, no qual é armazenada até à aplicação. Os recipientes são, em particular, seringas prontas, frascos de perfuração ou ampolas.

Os exemplos seguintes devem ilustrar a invenção, sem a limitar.

Exemplos 1. Formulação liquida de eritropoietina

Preparação de uma formulação liquida de eritropoietina com uma potência de substância activa de 3.333 IE/mL. 11

Componente Teor por injecção terminada EPO 3.333 IE/mL Polissorbato 20 0,1 mg Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado 1,43 mg Mono-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado 5, 6 mg CaCl2 x 2 H20 0,01 mg Glicina 7, 5 mg Leucina 1,0 mg Isoleucina 1,0 mg Treonina 0,25 mg Ácido glutâmico 0,25 mg Fenilalanina 0, 5 mg Cloreto de sódio 1,43 mg Hidróxido de sódio 0,1 N* q.s. Ácido clorídrico 0,1 N* q. s. Água até 1,0 mL Azoto** q.s. * Para o ajuste do valor de pH ** Para a desgaseificação da solução na preparação e enchimento

Todos os ingredientes apresentam uma qualidade de acordo com a Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.). 2. Preparação de uma formulação liquida de eritropoietina

com uma potência de substância activa de 10.000 IE/mL 12

Com excepção do teor em eritropoietina, os teores dos componentes individuais por seringa pronta correspondem aos do exemplo 1. Neste caso, o teor em eritropoietina perfaz 10.000 IE/mL.

As formulações são colocadas em seringas de vidro e são armazenadas como seringas prontas. 3. Preparação de uma formulação liquida de EPO com um volume de preparação de um litro

No caso de um volume de preparação a titulo de exemplo de 1 L, um teor em proteína de 1.000 pg/mL a título de exemplo, e uma actividade de 130.000 IE/mg de proteína, produz-se a composição indicada na tabela seguinte (densidade do volume de substância activa assumida: 1,008 g/L) .

Neste caso é preparada uma solução de substância activa, contendo eritropoietina, mono-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado e di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado, cloreto de sódio e água, cuja composição é considerada no cálculo das quantidades dos respectivos componentes a pesar. 13

Materiais de partida Quantidade de preparação* 1 L = 1.006,7 g 1 L = 1.006,7 g Potência da substância activa 3.333 IE/mL 10.000 IE/mL Teor da substância activa 25,6 pg/mL 76,9 pg/mL Solução de substância activa 25,64 g 76, 97 g Polissorbato 20 0,1 g 0,1 g Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado** 1,43 g 1,43 g Mono-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado** 5,6 g 5, 6 g CaCl2 x 2 H20 0,01 g 0,01 g Glicina 7,5 g 7,5 g Leucina 1,0 g 1,0 g Isoleucina 1,0 g 1,0 g Treonina 0,25 g 0,25 g Ácido glutâmico 0,25 g 0,25 g Fenilalanina 0,5 g 0,5 g Cloreto de sódio** 1,43 g 1,43 g Hidróxido de sódio 0,1 N*** q.s. q.s. Ácido clorídrico 0,1 N*** q.s. q.s. Água** 984,9 984,9 Azoto q.s. q.s. * 0 volume da preparação resulta da quantidade de substância activa empregue e do teor de proteína, que foi auxílio de RP-HPLC. determinado com o ** Quantidade a pesar. No cálculo das quantidades é considerado o teor das substâncias auxiliares da solução de substância activa. *** A quantidade consumida para o ajuste dc considerada no cálculo das quantidades. valor de pH é 14

4. Processo para a preparação da formulação líquida de EPO 80% da água para finalidades de injecção são colocados no recipiente da preparação. A temperatura da água é controlada, deve encontrar-se abaixo de 25 °C. Em seguida, realiza-se com cuidado, sob agitação e protecção de azoto, a adição das respectivas quantidades pesadas, segundo a composição indicada acima: di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado, hidrogenofosfato dissódico di-hidratado, cloreto de cálcio, glicina, leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, fenilalanina e cloreto de sódio. A solução é agitada até à completa dissolução de todos os componentes até formar uma solução homogénea, no entanto, pelo menos 15 minutos. Em seguida, é adicionado ao recipiente da preparação o polissorbato 20, na forma de uma solução em água para finalidades de injecção preparada separadamente. A solução é agitada pelo menos 15 minutos.

Para o ajuste do valor de pH são verificados a temperatura no recipiente da preparação e o valor de pH da preparação. A temperatura deve encontrar-se entre 18 e 25 °C. O valor de pH deve encontrar-se na gama de 7,0 - 7,4. Caso o valor de pH se encontre acima de 7,4, ajusta-se com ácido clorídrico 0,1 N. Caso o pH se encontre abaixo de 7,0, a correcção efectua-se com solução de hidróxido de sódio 0,1 N. A solução é agitada 10 minutos no recipiente da preparação.

Após o ajuste do valor de pH é adicionada a quantidade correspondente da proteína eritropoietina no recipiente da preparação. São novamente verificados a temperatura (deve estar entre 15 18 e 25 °C) e o valor de pH da preparação. Caso o valor de pH se encontre acima de 7,4 ou abaixo de 7,0 corrige-se, respectivamente, com ácido clorídrico 0,1 N ou solução de hidróxido de sódio 0,1 N.

Enche-se a solução no recipiente da preparação com água para finalidades de injecção até ao peso final calculado e agita-se em seguida pelo menos 15 minutos. Eventualmente, o valor de pH tem que ser mais uma vez corrigido como indicado acima, para a gama entre 7,0 e 7,4. A formulação líquida terminada de EPO é colocada em seringas prontas, que são fechadas com rolhas de êmbolo a seguir ao enchimento. 5. Estabilidade de longa duração das formulações de EPO de acordo com a invenção A estabilidade de longa duração das formulações de EPO de acordo com a invenção foi testada em comparação com o padrão BRP como referência. O teste baseia-se no facto de, durante o armazenamento de soluções de EPO ocorrerem reacções de degradação e reacções secundárias que podem conduzir, entre outros, à oxidação das cadeias laterais da metionina e cisteína. Em particular, a Met54 da EPO é frequentemente oxidada, com formação do sulfóxido respectivo. Este sulfóxido de metionina pode ser detectado após digestão proteolítica da EPO com tripsina, através de uma análise por RP-HPLC. Neste caso, a proporção da espécie de metionina oxidada é um indicador para a estabilidade ao armazenamento, isto é, quanto mais elevada a proporção, menor a estabilidade ao armazenamento. A determinação da proporção da espécie de metionina oxidada nas formulações de acordo com a invenção, a diferentes temperaturas de 16 armazenamento (2-8 °C, 25 °C e 40 °C) e diferentes períodos de armazenamento (6 semanas, 12 semanas e 6 meses), em comparação com formulações do estado da técnica, mostrou que as formulações de acordo com a invenção apresentam uma estabilidade que é comparável com as formulações líquidas do estado da técnica.

Lisboa, 16 de Outubro de 2007 17

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Formulação líquida de eritropoietina estável ao armazenamento, que (i) contém pelo menos quatro aminoácidos seleccionados do grupo composto por leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, ácido aspártico e fenilalanina, (ii) está livre de agentes de conservação, ureia e HSA, e (iii) não foi reconstituída a partir de um liofilizado.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, em que está adicionalmente contida glicina.
3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compreendendo adicionalmente um detergente não ionogénico.
4. Formulação de acordo com a reivindicação 3, em que, o detergente, é um éster alquílico de polioxietileno sorbitano.
5. Formulação de acordo com a reivindicação 4, em que, o éster alquílico de polioxietileno sorbitano, é polissorbato 20 ou polissorbato 80.
6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a osmolaridade perfaz 250 mOsmole/kg até 300 mOsmole/kg.
7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, em que a osmolaridade é ajustada com cloreto de sódio. 1
8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, contendo adicionalmente um tampão fisiologicamente aceitável.
9. Formulação de acordo com a reivindicação 8, em que o tampão é um tampão fosfato.
10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o valor de pH se encontra entre 7,0 e 7,4.
11. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, contendo adicionalmente iões cálcio.
12. Formulação de acordo com a reivindicação 11, em que os iões cálcio derivam de cloreto de cálcio.
13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a concentração de isoleucina e leucina, desde que contidas, perfaz respectivamente 0,25 até 1,5 g/L.
14. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a concentração de ácido glutâmico e ácido aspártico, desde que contidos, perfaz 0,1 até 0,5 g/L.
15. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a concentração de treonina, desde que contida, perfaz 0,1 até 0,5 g/L.
16. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a concentração de fenilalanina, desde que contida, perfaz 0,2 até 1,0 g/L. 2
17. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 16, em que a concentração de glicina, desde que contida, perfaz 2,0 até 10,0 g/L.
18. Processo para a preparação de uma formulação liquida de eritropoietina estável ao armazenamento compreendendo: dissolução dos componentes eritropoietina, dos aminoácidos leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, fenilalanina e glicina, bem como cloreto de cálcio, éster alquilico de polioxietileno sorbitano, cloreto de sódio num tampão aquoso, em que a formulação não é liofilizada em qualquer fase do processo e a formulação é livre de ureia.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que os componentes são dissolvidos na seguinte sequência: a) cloreto de cálcio, b) cloreto de sódio, c) leucina, isoleucina, treonina, ácido glutâmico, fenilalanina e glicina, d) éster alquilico de polioxietileno sorbitano e e) eritropoietina. Lisboa, 16 de Outubro de 2007 3