JP4887281B2 - 液体エリスロポエチン製剤 - Google Patents

Description

本発明は、保存上安定な液体エリスロポエチン製剤およびその調製方法に関する。特に、本発明は、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも４種のアミノ酸を含有し、保存剤、尿素またはヒト血清アルブミンを添加する必要がないことを特徴とする液体エリスロポエチン製剤に関する。

エリスロポエチン、略称ＥＰＯは、骨髄における赤血球産生を刺激する糖タンパク質である。ＥＰＯは主に腎臓で生産され、腎臓から血液循環を介して目的地に到達する。腎不全の場合、損傷を受けた腎臓は十分なＥＰＯを産生できないかまたはＥＰＯを全く産生できず、その結果として骨髄の幹細胞からは赤血球がごくわずかしか生産されない。このような腎性貧血は、骨髄における赤血球産生を刺激する生理学的な量のＥＰＯを投与することによって治療可能である。投与に使用されるＥＰＯはヒトの尿から、または遺伝子工学的方法により得ることができる。ＥＰＯは人体に少量しか含まれていないので、治療目的で天然供給源からＥＰＯを単離するのはほとんど不可能である。よって、遺伝子工学的方法により、前記物質を比較的大量に製造する唯一の経済的可能性が提供される。

エリスロポエチンの組換え生産は、１９８４年にヒトエリスロポエチン遺伝子が同定されて以来可能となっている。９０年代初期から、真核細胞、特にＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で遺伝子工学的に生産されたヒトエリスロポエチンを含有する種々の医薬品が開発されている。組換えヒトエリスロポエチンの生産については、例えば特許文献１および特許文献２に記載されている。

ＥＰＯは従来液体形態として製剤化され、それ自体として静脈内または皮下に注射される。しかしながら、ＥＰＯの液体製剤には安定性の問題点が生じる。前記問題点は、保存用容器の表面の触媒作用によるエリスロポエチン分子の破壊が原因である可能性がある。さらに、ＥＰＯ分子が容器の内壁に吸着してタンパク質および活性に損失を生じることも考えられる。よってこれまで、種々の物質を添加することで液体ＥＰＯ製剤を安定化するための様々な手法が追及されてきた。これらの安定化用化合物には、例えばポリエチレングリコール、デキストラン、ゼラチンなどの高分子物質や、種々の糖および糖アルコール、無機塩類、ならびにチオール化合物がある。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質も添加されることが多い。しかしながら、アレルギーや免疫学の観点から、前記血清タンパク質の使用は望ましくない。

特許文献３には、ＥＰＯ製剤における安定化剤としての種々のアミノ酸の使用について記載されており、この場合アミノ酸はＥＰＯを安定化するために尿素とともに用いられる。さらに、特許文献３に記載の製剤は液体形態ではなく凍結乾燥物の形態で保存され、該凍結乾燥物が使用直前に水で再構成される。

特許文献４には、保存剤の存在により安定で保存可能なＥＰＯ製剤が記載されている。
欧州特許出願公開第０１４８６０５号明細書 欧州特許出願公開第２０５５６４号明細書 欧州特許出願公開第０３０６８２４号明細書 欧州特許出願公開第０６０７１５６号明細書

本発明の目的は、液体形態で長期間保存可能であり、ＨＳＡ、尿素または保存剤などの添加物を必要としない、保存上安定なＥＰＯ調製物を生産することである。このようにして、望ましくは製剤の耐容性に関するあらゆるリスクを回避する、安定な液体ＥＰＯ製剤が提供される。

本発明によれば、上記課題は請求項１に記載の主題により解決される。好適な実施形態は従属項に定義されている。
ＨＳＡ、尿素または高分子安定化剤が存在しなくても、特定の組み合わせのアミノ酸を含有するＥＰＯ組成物は、安定性を著しく損ねることなく長期間液体形態で安定な条件下で保存可能であることが見出された。

従って、本発明は保存上安定な液体エリスロポエチン製剤に関し、該製剤は、
（ｉ）ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびフェニルアラニンからなる群から選択された少なくとも４種のアミノ酸を含むことと、
（ｉｉ）保存剤、尿素、および血清タンパク質を含まないことと、
（ｉｉｉ）凍結乾燥物から再構成されたものではないことと
を特徴とする。

特に好適な実施形態はアミノ酸であるグリシンをさらに含有する。
本発明の液体製剤は、免疫原性を有する可能性のある化合物を必要としない、含有する化合物の種類が全体として可能な限り少数であるといった利点だけではなく、製造工程のいずれの段階においても凍結乾燥を必要としないという利点も備えている。このことは、一方では凍結乾燥に関わる費用を節減し、他方では例えば凍結乾燥物が完全または十分に再構成できないなどの物理的問題のリスクを回避するものである。

本発明の範囲内において、用語「保存上安定な」とは、液体ＥＰＯ製剤を２５℃で３ヶ月間保存した後でなお活性ＥＰＯ分子の含量が初期濃度の８０％以上であることを意味するものと理解される。２５℃で３ヶ月間保存した後に、ＥＰＯ活性の残存含量が元の活性の少なくとも８５％であることが好ましく、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。エリスロポエチンの活性は、ＥＰＯに関する先行技術においてすでに示されているように、従来の活性試験を用いて測定可能である（さらに、欧州薬局方、２００２年１月、ｐ．１３１６（第４版）も参照されたい）。

本発明の範囲内において、用語「液体製剤」とは、エリスロポエチンと製剤中に含まれる別の物質との製剤が製造工程のいずれの段階においても、すなわち前記物質の混合前、混合中、混合後のいずれにおいても凍結乾燥されないこと、ならびに同製剤が注射用または輸液用の溶液として静脈内または皮下に施用されるためのものであることを意味するものと理解される。

本発明の製剤は、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、またはグリシン以外のアミノ酸を含有しない。好ましくは、該製剤はロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、およびグリシン以外のアミノ酸を含有しない。特に、本発明のＥＰＯ製剤はいかなるアルカリ性アミノ酸も含有しない。さらに、該製剤はアミノ酢酸を含有しない。本発明の製剤に血清タンパク質その他の安定化タンパク質、尿素および保存剤が全く含まれないことについては、すでに上記に述べたとおりである。

いずれの場合にも、イソロイシンおよびロイシンが本発明の製剤に含まれる場合、これ
らのアミノ酸の濃度は０．２５〜１．５ｇ／ｌ、好ましくは０．５〜１．２５ｇ／ｌの範囲にあり、特に好ましくは１．０ｇ／ｌである。

グルタミン酸およびアスパラギン酸が本発明の製剤に含まれる場合、前記アミノ酸の濃度は０．１〜０．５ｇ／ｌ、好ましくは０．２〜０．４ｇ／ｌの範囲にあり、特に好ましくは０．２５ｇ／ｌである。

スレオニンが本発明の製剤に含まれる場合、このアミノ酸の濃度は０．１〜０．５ｇ／ｌ、好ましくは０．２〜０．４ｇ／ｌの範囲にあり、特に好ましくは０．２５ｇ／ｌである。

フェニルアラニンが本発明の製剤に含まれる場合、このアミノ酸の濃度は０．２〜１．０ｇ／ｌ、好ましくは０．３〜０．８ｇ／ｌの範囲にあり、特に好ましくは０．５ｇ／ｌである。

グリシンが本発明の製剤に含まれる場合、該製剤中のこのアミノ酸の濃度は２．０〜１０．０ｇ／ｌ、好ましくは５．０〜８．０ｇ／ｌの範囲にあり、特に好ましくは７．５ｇ／ｌである。

本発明の製剤に使用するのに適したエリスロポエチンは、真核細胞で生産された組換えエリスロポエチンである。組換えエリスロポエチンは哺乳類の細胞で生産されることが好ましく、特に好ましくは、例えば特許文献１および２に記載されているようにＣＨＯ細胞で生産される。従来のプロトコールに従って実施される培養に続いて、クロマトグラフィ法を用いて組換えエリスロポエチンの精製工程が実施される。培養およびタンパク質精製のいずれについても、先行技術文献、例えば欧州特許出願公開第０８３０３７６号明細書に記載されている。エリスロポエチンの精製は、欧州特許出願公開第０２２８４５２号明細書、同第０４２８２６７号明細書、および国際公開公報第０３／０４５９９６号パンフレットの対象にもなっている。しかしながら、別の従来精製技術および一連の精製工程を採用することも可能である。

本発明の範囲内において、用語「エリスロポエチン」とは、骨髄における赤血球産生を刺激する能力を有し、かつ欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．；２００２年１月、ｐ．１３１６）に記載のアッセイ（赤血球増加症または正常な赤血球のマウスにおける活性測定）によりエリスロポエチンとして明白に特定されうる任意のタンパク質を意味するものと理解される。エリスロポエチンはヒト野生型エリスロポエチンでもよいし、１または複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有する変異型エリスロポエチンでもよい。同様に、本発明の製剤に含まれるエリスロポエチンは、同タンパク質が、例えばポリアルキレングリコールのようなポリマーとの結合体（いわゆるＰＥＧ化エリスロポエチン）の形態として存在する、結合体であってもよい。

好適な実施形態では、本発明の製剤は安定化のための糖も糖アルコールも含まない。同様に該製剤は安定化剤として高分子化合物を含まないことが好ましい。さらに、該製剤は保存剤を含まない。ここで保存剤とは、保存安定性を増大させるための保存剤として従来使用されており、標準的な濃度では殺菌作用を有する物質として理解されるべきものである。特に、該製剤は、クロロエタン、ベンジルアルコール、ｐ‐クロロ‐ｍ‐クレゾール、およびピロカルボン酸ジアルキルエステル、ならびに塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含まない。

該製剤のｐＨは血液のｐＨより著しく高いことはない。すなわちｐＨ７．４よりも高くないことが好ましい。通常、該製剤のｐＨは６．０〜７．４であり、好ましくは６．５〜
７．４であり、特に好ましくは７．０〜７．４である。所望のｐＨ範囲を達成するために調整を要する場合は、適切な溶液を用いて、すなわちｐＨ値を低下させる必要がある場合は酸性溶液、ｐＨ値を上昇させる必要がある場合はアルカリ性溶液を用いて、ｐＨ値を調整する。それぞれＨＣｌおよびＮａＯＨを用いてｐＨ値を調整することが好ましい。

注射用に、純水を溶媒として使用することが好ましい。しかしながら、医薬製剤に適した従来のその他の溶媒を使用することもできる。
使用される緩衝剤は、注射溶液または輸液を上記に特定したｐＨ範囲にするのに必要な濃度で緩衝作用を示すことのできる、任意の生理学的に許容可能な緩衝剤であってよい。適切な緩衝剤は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、およびＨＥＰＥＳである。リン酸緩衝剤を使用することが好ましい。緩衝剤化合物は、約２０〜１００ｍＭ、好ましくは３０〜８０ｍＭ、特に好ましくは４０〜６０ｍＭの濃度で使用される。

好適な実施形態では、本発明の製剤は追加成分として表面活性剤を含有する。界面活性剤の使用は、容器内壁へのＥＰＯの吸着を低減することを想定したものである。この目的に対しては、通常は少量の界面活性剤で十分である。基本的に、生理学的に許容可能な任意の界面活性剤を本発明の範囲内で使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類またはソルビタントリオレエートが特に適しており、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類が特に好適である。ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルは、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０のうち少なくともいずれか一方であることが好ましく、ポリソルベート２０が最も好ましい。界面活性剤の濃度は、０．０１〜１．０ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．２ｇ／ｌの範囲にあり、最も好ましくは０．１ｇ／ｌである。

好適な実施形態では、製剤は少量の生理学的に許容可能な錯化剤をさらに含有する。錯化剤は、例えばカルシウム塩、クエン酸塩、またはＥＤＴＡである。本発明の範囲内において、カルシウムを含有する塩、例えば塩化カルシウムなどが特に好ましい。カルシウム塩の濃度は０．００５〜０．０５ｇ／ｌ、好ましくは０．００８〜０．０１２ｇ／ｌ、特に好ましくは０．０１ｇ／ｌである。

浸透圧を調整するために任意の適切な塩を使用することができる。この目的については、塩化ナトリウムの使用が好ましい。本発明において、塩化ナトリウムの濃度は０．５〜２．５ｇ／ｌ、好ましくは１．０〜２．０ｇ／ｌ、特に好ましくは１．３〜１．６ｇ／ｌの範囲内にある。

液体製剤の浸透圧は２００〜４００ミリオスモル／ｋｇ、好ましくは２５０〜３００ミリオスモル／ｋｇ、最も好ましくは２６０〜２９０ミリオスモル／ｋｇである。
本発明の好適な実施形態では、活性物質であるＥＰＯに加えてアミノ酸であるロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、およびグリシン、ならびに塩化カルシウム、ポリソルベート、リン酸緩衝剤および塩化ナトリウムを含有し、その他の含有成分が存在しないことを特徴とする液体ＥＰＯ製剤が提供される。

使用されるエリスロポエチンの活性は１００，０００ＩＥ／ｍｇ未満であってはならない（欧州薬局方、２００２年１月、ｐ．１３１６（第４版）も参照されたい）。好ましくは、ＥＰＯの活性は少なくとも１１０，０００ＩＥ／ｍｇであり、特に好ましくは少なくとも１２０，０００ＩＥ／ｍｇである。

エリスロポエチンの濃度は、いずれの場合においても完成したシリンジ製品について所望される活性物質濃度に応じて変化する。一般的なＥＰＯ濃度は１，５００ＩＥ／ｍｌ〜４０，０００ＩＥ／ｍｌであり、例えばドイツ医薬品集２００４年版に記載の市販製品Ｎ
ｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）およびＥｒｙｐｏ（登録商標）を参照されたい。

製剤の構成成分は、従来の供給元、例えばシグマ社（Ｓｉｇｍａ）やメルク社（Ｍｅｒｃｋ）から入手可能である。
本発明の製剤の製造は、先行技術における慣用法により実施可能である。

本発明は、本発明の液体ＥＰＯ製剤を製造する方法にも関する。本発明において、上述の製剤の構成成分を水性緩衝液中に溶解する。上述のように、水性緩衝液はリン酸緩衝液であることが好ましい。

液体製剤を製造するための本発明の方法の好適な実施形態では、最初に溶媒、好ましくは注射用水が提供され、続いて緩衝剤としてリン酸二水素ナトリウム二水和物およびリン酸一水素二ナトリウム二水和物と、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、および使用するアミノ酸、好ましくはグリシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、およびフェニルアラニンを該溶媒に溶解する。構成成分を完全に溶解した後、ポリソルベートの（それぞれの溶媒中の）溶液を添加する。最後に、次の工程でエリスロポエチンの（それぞれの溶媒中の）溶液を添加する。

調製時および調製の最終段階において、溶液のｐＨを測定し、必要であれば適切な溶液、特にＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、７．０〜７．４の範囲に調整する。
最後に、完成した液体製剤を適切な容器に詰める。該液体製剤は施用時まで同容器内で保存される。前記容器は、特に、シリンジ製品、穿刺式の密栓フラスコ、またはアンプルである。

以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

液体エリスロポエチン製剤
濃度が３，３３３ＩＥ／ｍｌの液体エリスロポエチン製剤の調製。

含有成分は全て欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）に準拠した品質のものである。

活性物質濃度が１０，０００ＩＥ／ｍｌの液体エリスロポエチン製剤の調製
エリスロポエチンの含量を除き、シリンジ製品あたりの個々の成分の含量は実施例１に記載の含量に相当する。本実施例の場合、エリスロポエチンの含量は１０，０００ＩＥ／ｍｌである。

該製剤をガラス製のシリンジに充填し、シリンジ製品として保存する。

設定容量１リットルの液体ＥＰＯ製剤の調製
例えばタンパク質含量が１，０００μｇ／ｍｌで活性がタンパク質１ｍｇあたり１３０，０００ＩＥである例示的な１リットルの設定容量では、以下の表に示した組成となる（活性成分のバルクの密度を１．００８ｇ／ｌと仮定）。

ここで、エリスロポエチン、リン酸一水素二ナトリウム二水和物およびリン酸二水素ナ
トリウム二水和物、塩化ナトリウムおよび水を含有する薬剤溶液が調製されるが、その組成は秤量すべき個々の成分の量を計算する際に考慮されている。

液体ＥＰＯ製剤の調製方法
注射用水の８０％をセットアップ容器に用意する。水の温度を測定し、２５℃未満にしておかなければならない。続いて、上述の組成に対応するように秤量されたリン酸二水素
ナトリウム二水和物、リン酸一水素二ナトリウム二水和物、塩化カルシウム、グリシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、および塩化ナトリウムを、窒素による保護下で撹拌しながら慎重に添加する。この溶液を、全ての成分が完全に溶解して均質な溶液が形成されるまで、ただし少なくとも１５分間撹拌する。続いて、別途注射用水溶液として調製したポリソルベート２０をセットアップ容器に添加する。この溶液を少なくとも１５分間撹拌する。

ｐＨ値を調整するために、セットアップ容器中の調製物の温度およびｐＨ値を確認する。温度は１８〜２５℃と推定される。ｐＨ値は７．０〜７．４の範囲内にあると推定される。ｐＨ値が７．４を超えている場合は、０．１Ｎの塩酸を用いて調整する。ｐＨ値が７．０未満である場合は、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を用いて調整する。セットアップ容器中の溶液を１０分間撹拌する。

ｐＨ値の調整に続いて、相応量のエリスロポエチンタンパク質をセットアップ容器中に入れる。
再度、調製物の温度（１８〜２５℃に設定）およびｐＨ値を確認する。ｐＨ値が７．４を超えているかまたは７．０未満である場合は、それぞれ０．１Ｎの塩酸および０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を用いて調整する。

セットアップ容器中の溶液を注射用水でフィルアップして計算された最終重量とし、続いて少なくとも１５分間撹拌する。必要であれば、上述のようにしてｐＨ値を再度７．０〜７．４の範囲内に調整しなければならない。完成した液体ＥＰＯ製剤をシリンジ製品に充填し、充填後にシリンジ製品をフラスコ用密栓で密封する。

本発明のＥＰＯ製剤の長期安定性
本発明のＥＰＯ製剤の長期安定性を、ＢＲＰ標準品を基準として比較することにより確認した。この試験は、ＥＰＯ溶液を保存すると分解反応および副反応が生じ、該反応により、とりわけメチオニンおよびシステインの側鎖の酸化が引き起こされるという事実に基づくものである。ＥＰＯのＭｅｔ４５は、酸化されてスルホキシドを形成することが特に多い。前記メチオニンスルホキシドは、トリプシンを用いてＥＰＯをタンパク質分解した後にＲＰ‐ＨＰＬＣ分析することによって検出可能である。本実施例では、酸化されたメチオニンの割合が保存安定性の指標である。すなわち、この割合が高いほど保存安定性が低いことになる。種々の保存温度（２〜８℃、２５℃、４０℃）および種々の保存期間（６週間、１２週間、６ヶ月）における本発明の製剤中のメチオニン酸化型分子種の割合を、従来技術の製剤と比較して測定した結果、本発明の製剤は従来技術の液体製剤に匹敵する安定性を有することが示された。

Claims (20)

1. 安定な液体エリスロポエチン製剤であって、
   （ｉ）少なくともロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、およびフェニルアラニンを含有し、
   （ｉｉ）保存剤、尿素およびヒト血清アルブミンを含有せず、
   （ｉｉｉ）凍結乾燥物から再構成されたものではない
   ことを特徴とする製剤。
2. グリシンをさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の製剤。
3. 非イオン性の界面活性剤をさらに含んでなることを特徴とする請求項１または２に記載の製剤。
4. 界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである、請求項３に記載の製剤。
5. ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、請求項４に記載の製剤。
6. 浸透圧が２５０ミリオスモル／ｋｇ〜３００ミリオスモル／ｋｇの範囲内にあることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の製剤。
7. 浸透圧が塩化ナトリウムで調整されることを特徴とする請求項６に記載の製剤。
8. 生理学的に許容可能な緩衝剤をさらに含んでなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
9. 緩衝剤はリン酸緩衝剤である、請求項８に記載の製剤。
10. ｐＨが７．０〜７．４の範囲内にあることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
11. カルシウムイオンをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
12. カルシウムイオンは塩化カルシウムに由来することを特徴とする請求項１１に記載の製剤。
13. 塩化カルシウム、ポリソルベート、リン酸緩衝剤および塩化ナトリウムをさらに含有する請求項２に記載の製剤。
14. イソロイシンおよびロイシンの濃度がそれぞれ０．２５〜１．５ｇ／ｌの範囲内にあることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製剤。
15. アスパラギン酸が含まれる場合、グルタミン酸およびアスパラギン酸の濃度が０．１〜０．５ｇ／ｌの範囲内にあることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤。
16. スレオニン濃度が０．１〜０．５ｇ／ｌの範囲内にあることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製剤。
17. フェニルアラニン濃度が０．２〜１．０ｇ／ｌの範囲内にあることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の製剤。
18. グリシンが含まれる場合、グリシン濃度が２．０〜１０．０ｇ／ｌの範囲内にあることを特徴とする請求項２〜１７のいずれか一項に記載の製剤。
19. 保存上安定な液体エリスロポエチン製剤を調製する方法であって、エリスロポエチン、アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、およびグリシン、ならびに塩化カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル、塩化ナトリウムを水性緩衝液に溶解する工程を含んでなり、該方法のいずれの段階においても製剤が凍結乾燥されないことと、該製剤が尿素を含まないこととを特徴とする方法。
20. 成分が以下の順序、すなわち
    （ａ）塩化カルシウム、
    （ｂ）塩化ナトリウム、
    （ｃ）ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、およびグリシン、
    （ｄ）ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル、および
    （ｅ）エリスロポエチン
    の順に溶解されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。