PT86810B

PT86810B - Processo para a preparacao de complexos estaveis de interferao

Info

Publication number: PT86810B
Application number: PT86810A
Authority: PT
Inventors: Zachary Yim; Michael A Zupon; Imtiaz A Chaudry
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1987-02-24
Filing date: 1988-02-23
Publication date: 1992-05-29
Also published as: ZA881258B; EP0281299B1; MY103212A; WO1988006456A1; DK167048B1; PT86810A; FI93309B; FI893929A0; FI893929A; IE61340B1; IE880480L; NO173279B; OA09737A; NO173279C; US4853218A; ATE76580T1; NO884596L; JPH03500286A; KR890700359A; KR940001372B1

Description

SCHERING CORPORATION

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS ESTÁVEIS DE

INTERFERÃO

presente invento está relacionado com complexos insolúveis de zinco-protamina-interferão alfa úteis como forma de dosagem injectável de libertação retardada para administração de interferão alfa.

As formulações farmacêuticas in jectáveis são bem conhecidas na especialidade. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 16^ Edição, 1980. Geralmente tais formulações são na forma de dispersão tais como colóides, emulsões e suspensões. Mais recentemente, têm sido usadas formulações injectáveis de libertação retardada que incluem polímeros.

As formulações injectáveis de li bertação retardada típicas incluem suspensões aquosas ou mis cíveis em água, mas tais suspensões apresentam muitas vezes problemas de estabilidade e podem não proporcionar um tempo de retenção suficientemente longo do elemento activo na formula ção, quer por a dispersão se quebrar, quer por a dispersão ser demasiado solúvel nos fluídos do corpo envolventes (e.g., o sangue e sistemas linfáticos).

Um exemplo de uma suspensão satisfatória de libertação retardada baseada em água é a suspensão de protamina-zinco-insulina. A entrada da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) para a suspensão indica uma formulação representativa como contendo 40-100 Unidades USP de Insulina/ml de uma solução aquosa de zinco (0,15 a 0,25 mg de zinco/100 Unidades USP de Insulina) e protamina (1 a 1,5 mg de Protami na/100 Unidades USP de Insulina) a pH entre 7,1 e 7,4. Tipi camente o pH é mantido com 0,15 a 0,25% (p/v) de fosfato de sódio dibásico e a formulação contem igualmente 1,4 a 1,8% (p/v) de glicerina e 0,18 a 0,22% (p/v) de cresol ou 0,22 a 0,28% (p/v) de fenol. Dependendo da concentração de insulina e da resposta do paciente, uma injecção liberta insulina duran

-3te até três dias.

Os interferões são uma família de proteínas que apresentam actividade antiviral contra certos vírus e actividade anticancro contra determinados cancros. Os interferões incluem interferão alfa (leucócitos), beta (fibroblastos) e gama (imune) natural ou recombinante, mas os interferões alfa são os preferidos para usar nas composições deste invento. 0 interferão alfa humano é uma mistura natural de pelo menos onze componentes incluindo os designados por interI ferão alfa^ e alfa₂, este último sendo o mais preferido neste invento. 0 interferão alfa humano apresentando propriedades biológicas semelhantes ao interferão alfa natural pode ser feito por métodos recombinantes. Rubenstein, Biochem. Biophys. Acta., 695, 5-16 (1982); Nagata et al., Nature, 284, 316-320 (1980); EP 32,134; e Patente U.S. 4 289 690 divulga métodos para a preparação do interferão alfa₂· Também incluídos no âm bito deste invento estão os chamados interferões alfa híbridos em que estão ligados fragmentos de duas ou mais espécies de interferão alfa nativo (Ver, por exemplo, EP 51 873). A administração parenteral do interferão alfa₂ foi divulgada como sendo eficaz no tratamento do sarcoma de Kaposi, carcinoma das células basais, mieloma múltiplo e verrugas virais. A dose efi caz do interferão alfa pode ser facilmente determinada pelos familiarizados com a matéria.

O presente invento está relacionado com um complexo insolúvel compreendendo zinco, protamina e interferão alfa, assim como glicina e albumina do soro humano (HSA) e como tal representa uma mistura complexa de componentes. Se bem que o conhecido complexo de zinco-protamina-insulina seja dependente daqueles três componentes para a insolubilização, o complexo de zinco-pr otamina-interferão alfa do presen te invento também compreende de preferência uma segunda proteí na, HSA, de modo a optimizar a formação do complexo insolúvel e surpreendentemente pode incluir até um excesso molar de gli cina, um quelator do zinco. Um método preferido para a formação do complexo insolúvel do presente invento compreende a adi ção da protamina à solução antes do zinco de modo a assegurar que a quantidade mínima de proteína solúvel permaneça no so brenadante e para assegurar que o complexo insolúvel exista ccmo partículas coloidais finas as quais permanecem em dispersão du rante um período de tempo prolongado, em vez de grandes agre gados cabidais que sedimentam fácilmente. Um outro método pre ferido para a formação de complexos insolúveis compreende a adição simultânea de protamina e zinco.

A Tabela 1 abaixo mostra os resultados da omissão de vários componentes e o efeito da ordem de adição de zinco e protamina para uma composição compreendendo 1 mg de HSA/ml, 0,1 mg de interferão alfa (IFN)/ml e 20 mg de glicina (G)/ml em tampão fosfato 0,02M (p). A coluna 1 mostra o efeito da ordem de adição; a adição de zinco em primeiro lugar resulta em 5% de proteína solúvel enquanto que a adição de protamina em primeiro lugar resulta em menos de 1 % de proteína solúvel. As colunas 3, 4 e 5 mostram que na ausência de tampão, na ausência de tampão e glicina e na ausência de HSA, respectivamente, não se forma uma quantidade máxima do complexo, uma vez que pelo menos 5% da proteína solúvel resulta em cada uma daquelas combinações. Enquanto a Coluna 2 mostra que a presença de glicina não é necessária para formar um complexo com insolubilidade máxima, a Coluna 1 mostra que a glicina não é prejudicial para o complexo apesar das suas propriedades quelantes do zinco, desde que a protamina seja adicionada antes do zinco.

Dependência da quantidade de proteína solúvel encontrada na composição e ordem da adição de Zinco/Protamina

^\Comp. Ordem cfeadição	HSA/IFN (P/G)	HSA/IFN (p)	HSA/IFN (h₂o/g)	HSA/IFN (h₂o)	IFN (H₂O)
Zn/Protamina	5%	<1%	10%	5%	5%
Protamina/Zn	<1%	<1%	>10%	5%	5%

A glicina está presente neste in vento entre 0 e 50 mg/ml como resultado da sua presença no interferão liofilizado de preferência usado para preparar as com posições deste invento. Ver Patente U.S. 4 496 537, em que um tampão glicina e HSA são adicionados às soluções de interferão antes da liofilização para assegurar a estabilidade biológica.

A formação do complexo insolúvel é um fenómeno de equilíbrio e, como se vê na Tabela 1, pode ser conseguida quase insolubilização completa (i.e., 99%) para tor nar máxima a libertação retardada. No entanto, se se pretender uma fracção solúvel para libertação imediata, pode-se mudar a proporção dos componentes ou, de preferência, o pH pode ser ajustado. A formação máxima de complexo insolúvel é consegui-

-6da quando a solução de interferão é ajustada a pH entre 8,0 e 8,4, preferivelmente pH 8,2, mas o ajustamento do pH entre pH 7,5 e 8,5 permitirá a formação de espécies solúveis para libertação imediata de interferão alfa.

TABELA 2

Formação de complexos insolúveis vs pH

Dispersão a

700 nm

0,2

1,12

2,64

2,44

1,80 pH

7,0

7.5

8,0

8.3

8.4

8.6

A libertação do interferão alfa a partir do complexo não é mensurável in vitro uma vez que não é solubilizada por diluição, mas antes por deslocamento de quelantes fisiológicos assim como albumina do soro. A velocidade de li bertação in vivo pode ser medida usando interferão alfa radio-iodinado e controlando o desaparecimento da radioactividade no sítio da injecção e a presença de radioactividade no soro e urina. Tais testes em ratos mostraram libertação retardada durante mais de duas semanas.

A quantidade de interferão alfa nas formulações do invento e 2x10 a 200x10 Unidades Internacionais 7 (U.I.) por ml de complexo, de preferencia 2x10 U.I./ml.

-Ί-

Ο zinco pode ser fornecido por 1 a 20 mg de um sal de zinco/ml, em que o sal de zinco póde ser escolhido entre acetato de zinco, cloreto de zinco ou sulfato de zinco, sendo o acetato de zinco o preferido.

A protamina pode ser fornecida por 0,25 a 5 mg, de preferência 2,5 mg de protamina/ml, em que a protamina é escolhida entre protamina base livre, cloreto de protamina, fosfato de protamina ou sulfato de protamina, sendo o sul fato o preferido.

HSA está presente numa gama de concentra_ ções de 0 a 10 mg/ml, de preferência 0,5 a 1 mg/ml.

Para preparar a solução de interferão po de ser usado qualquer tampão químico e farmacêuticamente compatível, sendo o tampão fosfato o preferido. As soluções de in terferão apresentam estabilidade máxima entre pH 6,5 e 8,0, de preferência 7,0 a 7,4 (Ver Patente U.S. 4 496 537). De preferência usa-se hidróxido de sódio para ajustar o pH da solução de interferão entre pH 7,5 e 8,5 antes da formação do complexo . O agente tamponante não deve ter uma afinidade forte para o zin_ co, uma vez que isto tenderia a remover zinco do complexo. Esta falta de afinidade para o zinco é especialmente importante na presença de glicina, uma vez que a glicina é um quelante do zin co; na ausência de glicina, pode ser tolerada alguma afinidade do tampão para o zinco. Um tampão com alguma afinidade para o zinco (e.g. citrato ou acetato) pode ser usado para aumentar a fracção solúvel para libertação imediata de interferão.

Um método preferido para a preparação de um complexo insolúvel do presente invento é reconstituir uma amostra de interferão alfa liofilizado preparado como descrito na Patente U.S. 4 496 537 com uma solução compreendendo acetato de zinco e sulfato de protamina no pH pretendido. Seguem-se

-8exemplos de preparação de interferão alfa liofilizado e do com plexo reconstituído.

EXEMPLO 1
INTERFERÃO ALFA LIOFILIZADO
Solução de liofilização	Mg/ml 2 χ 10⁷ I.U.
Interferão alfa
Fosfato de sódio, dibásico, reagente anidro	2,27
Fosfato de sódio, monobásico, USP	0,55
Glicina, USP	20,0
Albumina, humana, USP	1,0
Água para injecção, USP, q.s.ad.	1 ,0 ml

Introduzir uma porção de água para in jecção, USP num vaso adequado equipado com um agitador. Consecutivamente adicionar e dissolver com agitação Fosfato de Sódio Dibásico, Reagente Anidro; Fosfato de Sódio Monobásico, USP; Albumina Humana, USP; e Interferão Alfa 2. Levar a mistura até ao volume final com Água para injecção, USP.

Numa área estéril, filtrar assépticamente a solução para um vaso esterilizado através de um filtro esterilizado de 0,2 microns o qual foi lavado e testada a sua integridade. Testar a integridade do filtro após filtração.

-9Assépticamente introduzir a solução em frascos esterilizados, colocar os frascos cheios num liofilizador esterilizado e liofilizar a solução. Assépticamente fechar e selar os frascos

EXEMPLO 2

COMPLEXO DE INTERFERÃO ALFA

Ingredientes

Frasco com interferão alfag liofilizado

Acetato de zinco

Sulfato de protamina

Hidróxido de sódio

Água para injecção q.s.

mg/ml (Ver exemplo

4,0

2,5

0,6 ml

Dissolver o interferão alfag liofilizado numa porção de Água para Injecção. Ajustar a pH 8,2 com hidróxido de sódio. Adicionar sulfato de protamina e agitar; adicionar acetato de zinco e agitar. Levar a mistura ao volume final com a restante Água para Injecção. De preferência, o hidróxido de sódio, sulfato de protamina e acetato de zinco são adicionados como soluções aquosas concentradas (e.g. para protamina, 100 microlitros de uma solução aquosa a 25 mg/ml).

As soluções de interferão alfa globais (i.e. não liofilizado) ou outras amostras de interferão alfa

adequadas podem ser usadas para formar o complexo deste invento, de preferência usando a mesma ordem de adição dos componen tes descrita atrás, ou seja tampão fosfato, HSA e glicina adicionados ao interferão alfa aquoso, ajustado o pH, adicionada a protamina, adicionado o zinco e a solução ajustada ao volume final.

Claims

REIVINDICÃÇÕES

13. - Processo para a preparação de um complexo insolúvel de zinco-protamina-interferao alfa, carac terizado por compreender a reacção de interferão alfa com uma fonte de zinco e como uma fonte de protamina.

23. - Processo para a preparação de um complexo de zinco-protamina-interferão alfa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a reacção de uma solução de interferão alfa num tampão compatível a pH entre 7,5 e 8,5, em que o referido tampão contém facultativamente albumina do soro humano e/ou glicina, com protamina base livre ou um seu sal farmacêuticamente aceitável e com um sal de zinco.

33. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida protamina base livre ou sal de protamina ser feita reagir com a referida solução tamponada de interferão alfa antes ou ao mesmo tempo que o sal de zinco.

43. - Processo para a preparação de um complexo zinco-protamina-interferão alfa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender os seguintes passos :

(a) preparação de uma solução tamponada de interferão alfa tendo um pH entre 7,5 e 8,5, de preferência pH 8,2, compreendendo facultativamente albumina do soro humano e/ou glicina.

(b) reacção da referida solução tamponada de interferão alfa com protamina base livre ou um seu sal farmacêuticamente aceitavel e um sal de zinco, sendo o referido sal de zinco adicionado simultâneamente ou após a adição da referida protamina base livre ou um seu sal farmacêuticamente aceitável.

-125a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de libertação controlada, caracterizado por se incluir na referida composição um complexo insolúvel parenteralmente aceitável de zinco-protamina-interferão alfa obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6a. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se obter uma composição compreenden do 2 x 10 a 200 x 10 Unidades Internacionais de interferão alfa/ml de um tampão compatível a pH entre 7,5 e 8,5; 1 a 20 mg de um sal de zinco/ml; 0,25 a 5 mg da protamina base livre ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável/ml; 0 a 50 mg de glicina/ml; e 0 a 10 mg de albumina do soro humano/ml.
7a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6 caracterizado por o sal de zinco ser acetato de zinco.
8a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado por o componente protamina ser sulfato de protamina.
9§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado por o pH do tam pão ser 8,0 a 8,4.
10~. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado por se obter uma composição compreendendo 4,0 mg de acetato de zinco, 2,5 mg de sulfato de protamina, 0,6 mg de hidróxido de sódio, 1 mg de albumina do soro humano e 20 mg de glicina por ml de solução, em que o tampão é um tampão fosfato.
11 a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5a 10, caracterizado por se obter uma

-137 . .

composição compreendendo 2x10 Unidades Internacionais de interferão alfa212§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado por o pH do tampão ser 8,2.