HU201881B

HU201881B - Process for producing stabile retarde alpha-interferone komplex

Info

Publication number: HU201881B
Application number: HU881926A
Authority: HU
Inventors: Zachary Yim; Michael A Zupon; Imtiaz A Chaudry
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1987-02-24
Filing date: 1988-02-23
Publication date: 1991-01-28
Also published as: CA1316105C; NO173279B; OA09737A; FI93309B; DK582188D0; JPH0611712B2; KR890700359A; JPH03500286A; ES2032009T3; KR940001372B1; PT86810B; GR3005358T3; MX9203328A; IE61340B1; AU1394688A; ATE76580T1; FI893929A0; WO1988006456A1; DE3871407D1; EP0375678A1

Description

A találmány tárgya eljárás oldhatatlan cink-protamin-alfa-interferon komplex előállítására, amely alfa-interferon injektálható, elnyújtott hatású beadására alkalmas.

Injekciós gyógyszerkészítmények jól ismertek (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 16. kiadás, 1980). Ezek a készítmények általában diszperziók, igy kolloidok, emulziók és szuszpenziók. Utóbbi időben polimereket tartalmazó elnyújtott hatású injekciós készítményeket is használnak.

A jellegzetes elnyújtott hatású injekciós készítmények vizes vagy vízzel elegyedő szuszpenziók, de ezeknek a szuszpenzióknak a stabilitása gyakran kifogásolható és a készítményben a hatóanyagnak a visszatartási ideje nem elég hosszú egyrészt a diszperzió megtörése miatt, vagy azért, mert a diszperzió oldhatósága a környezeti testfolyadékokban (például a vérben és a nyirokrendszerben) túl nagy.

Egy sikeres vízalapú elnyújtott hatású szuszpenzió példája a protamin-cink-inzulin szuszpenzió. Az United States Pharmacopeia (USP) a szuszpenzióra megad egy szabványos összetételt, amely 40-100 USP inzulin egység/ml-t tartalmaz cink (0,15-0,25 mg cink/100 USP inzulinegység) és protamin (1-1,5 mg protamin/100 USP inzulinegység) vizes oldatában 7,1—

7,4 pH értéken. A pH értéket jellegzetesen 0,15-0,25 tömeg/tf% kétbázisos nátrium-foszfáttal tartják fenn és a készítmény 1,4-1,8 tömeg/tf% glicerint, 0,18— 0,22 tömeg/tf% krezolt vagy 0,22-0,28 tömeg/tf% fenolt is tartalmaz. Az inzulin koncentrációjától és a betegek állaőpotától függően egy injekció az inzulint legalább 3 napig adja le.

Az interferonok a fehérjék egy családját képezik, amelyek vírus ellenes hatásúak bizonyos vírusok ellen, továbbá bizonyos daganatokkal szemben is daganatellenes hatást mutatnak. Az interferonok természetes vagy rekombináns alfa(leukocita), béta(fibroblaszt), és gamma(iminun) interferonokat foglalnak magukba, de a találmány szerinti készítményben előnyös az alfa-interferon használata. A természetes humán alfa-interferon legalább 11 komponens elegye, amely magábafoglalja az álfái- és alfa2 interferonként jelölteket, utóbbi különösen előnyösnek tekinthető. A természetes alfa-interferonnal hasonló biológiai tulajdonságokat mutató humán alfa-interferon előállítható rekombináns módszerekkel. Az alfa2-interferon előállítási módszereit ismerteti Rubenstein, Biochem. Biophys. Acta., 695, 5-16 (1982); Nagata és munkatársai, Natúré, 284, 316-320 (1980); 32 134 számú európai szabadalmi leírás és 4 289 690 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

A találmány szerinti eljárásban felhasználhatók az ún. alfa hibrid interferonok, is amelyekben két vagy több natív alfa-interferon species fragmensei vannak összekapcsolva (lásd például az 51 873 számú európai szabadalmi leírást). Beszámoltak arról, hogy az alfa2-interferon parenterális beadása hatásosnak bizonyult a Kaposi-féle szarkóma, bazális sejt karcinóma, többszörös mielóma és vírusos szemölcs kezelésében. Az alfa-interferon hatásos adagját a szakember egyszerűen meghatározhatja.

A találmány tárgya eljárás cinket, protamint és alfa-interferont tartalmazó oldhatatlan komplex, valamint glicint és humán szérumalbumint (HSA) tar2 talmazó komplex elegy előállítására. Míg az ismert cink-protamin-inzulin komplex inszolubizációja az említett három komponenstől függ, a találmány szerinti cink-protamin-alfa-interferon komplex előnyösen tartalmaz egy második proteint, a humán szérum albumint annak érdekében, hogy az oldhatatlan komplex maximálisan képződjön, továbbá meglepő módon moláris feleslegig tartalmazhat glicint, egy cink kelátképzőt. A találmány szerinti oldhatatlan komplex képzésének előnyös módszere szerint az oldathoz a protamint a cink hozzáadása előtt adjuk, hogy biztosítsuk az oldható protein legkisebb mennyiségének a felülúszóban való maradását, továbbá, hogy az oldhatatlan komplex finom kolloid részecskék alakjában legyen, amelyek hosszú ideig diszperzióban maradnak, ahelyett, hogy könnyen ülepedő, nagy kolloidaggregátumok képződnének. Az oldhatatlan komplex képzésének másik módszere a protamin és a cink egyidejű hozzáadása.

A következő 1. táblázat különböző komponensek elhagyását és a cink és protamin hozzáadáséi sorrendje a hatását mutatja olyan készítmény példáján, amely 1 mg HSA/ml, 0,1 mg alfa-interferon (IFN)/ml és 20 mg glicin (G)/ml összetételű 0,02 mólos foszfát pufferban (p). Az első oszlop a hozzáadást sorrend hatását mutatja; ha először a cinket adagoljuk, 5% oldható protein képződik, ezzel szemben, ha először a protamint adagoljuk, akkor kevesebb, mint 1% oldható protein képződik. A 3., 4. és 5. oszlop azt szemlélteti, hogy puffer nélkül, illetve puffer és glicin nékül, illetve HSA nélkül nem képződik maximális mennyiségű komplex, mivel legalább 5% oldható protein származik midegyik ilyen kombinációnál. Míg a 2. oszlop azt mutatja, hogy glicin jelenléte nem szükséges maximálisan oldhatatlan komplex képzéséhez, az 1. oszlop azt igazolja, hogy a glicin nem meghatározó a komplexre cink keletkező tulajdonságai ellenére, amennyiben a protamint a cink hozzáadása előtt adjuk.

1. táblázat

Az oldható protein talált mennyiségének függése az összetételtől és a cink/protamin hozzáadás sorrendjétől

Összetétel

Hozzáadás HSA/IFN HSA/IFN HSA/IFN HSA/IFN	IFN (H₂O)
sorrendje (p/G)	(P)	(H₂O/G)	(H₂O)
Cink/protamin 5%	<1%	10%	5%	5%
Protamin/cink <1%	<1%	10%	5%	5%

A találmány szerinti készítményben a glicin 0-50 mg/ml mennyiségben van jelen, a találmány szerinti készítmény előállítására előnyösen használt liofilizált interferonban való jelenléte eredményeképpen. Hivatkozunk a 4 496 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásra, amely szerint puffért, glicint és HSA-t adnak az interferon oldatokhoz liofilizálás előtt a biológiai stabilitás biztosítására.

Az oldhatatlan komplex képződése egyensúlyi jelenség, és amint az az 1. táblázatból megállapítható, csaknem teljes inszolubilizálás (azaz 99%-os) érhető

HU 201881 Β el, hogy az elnyújtott felszabadulást maximalizáljuk. Ha bizonyos oldható frakció kívánatos az azonnali felszívódáshoz, a komponensek aránya változtatható, vagy előnyösen a pH szabályozható. Az oldahatatlan komplex maximális képződése érhető el, ha az interferon oldatot 8,0-8,4 előnyösen 8,2 pH értékre állítjuk, de ha a pH értéket 7,5 és 8,5 közé állítjuk, akkor lehetőség van oldható rész képződésére az alfa-interferon azonnali felszívódása érdekében. A következő 2. táblázat bemutatja a komplex kéződés változatait a pH változásának függvényében.

A találmány szerinti oldahatatlan komplex előállításának előnyös módszere szerint a 4 496 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt módon előállított liofilizált alfa-interfe5 ront cink-acetátot és protamin-szulfátot tartalmazó oldattal kezeljük a kívánt pH értéken.

A következő példákban bemutatjuk a liofilizált alfa-interferon előállítását és a komplex képzését.

1, példa

Liofilizált alfa-interferon

2. táblázat

Oldhatatlan komplex képződés a pH függvényében

Eloszlás 700 nm-nél	PH
0,2	7,0
1,12	7,5
2,64	8,0
2,64	8,3
2,64	8,4
1,80	8,6

Az alfa-interferonnak a komplexből való felszabadulása nem mérhető in vitro, mivel nem szolubilizálódik hígításra, csak fizilológiás kelátképzők, valamint szérum albumin hatására. Az in vivő felszabadulási hányadot radiokatív jóddal jelezett alfa-interferonnal mérhetjük és az injekciós helyen a radioaktivitás csökkenését, valamint a szérumban és a vizeletben a radioaktivitás jelenlétét követjük. Patkányokon végzett vizsgálatok több, mint két hétig mutatták az elnyújtott hatást.

A találmány szerinti készítményekben az alfa-interferon mennyisége 2xl0⁶-200xl0⁶ nemzetközi egység (I.U.) a komplex 1 ml-ére vonatkoztatva, előnyösen 2xl0⁷ I.U7ml.

A cink mennyisége 1-20 mg cinksó/ml lehet, és cinksóként cink-acetátot, cink-kloridot, vagy cinkszulfátot, előnyösen cink-acetátot használhatunk.

A protamin mennyisége 0,25-5 mg/ml, előnyösen

2,5 mg/ml, és a protamint szabad bázisként, protaminkloridként, protamin-foszfátként vagy protamin-szulfátként alkalmazhatjuk, előnyös a szulfát használata.

A HSA 0-10 mg/ml, előnyösen 0,5-1 mg/ml koncentrációban van jelen.

Az interferon oldat előállításához bármilyen kémiailag és győgyszerészetileg összeférhető puffer használható, előnyös a foszfát puffer használata. Az interferon oldatok maximális stabilitása 6,5-8,0 pH értéknél, előnyösen 7,0-7,4 pH értéknél van (4 496 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az interferon oldatnak 7,5-8,5 pH értékre való beállításához a komplex képzés előtt előnyös a nátrium-hidroxid. A puffemek nem lehet nagy affinitása a cinkhez, mivel ez a komplexből a cink eltávolítását eredményezné. A cink iránti affinitásmentesség különösen jelentős, ha glicin van jelen, mivel a glicin cink kelátképző; glicin távollétében azonban a puffemek a cink iránti bizonyos affinitása elviselhető. A cink iránt bizonyos affinitással rendelkező puffer (például citrát vagy acetát) használható az oldható frakció növelésére az interferon azonnali felszabadulása érdekében.

Liofilizálási oldat	mg/ml
Alfa2-interferon	2xl0⁷ I.Ü’
Vízmentes kétbázisos nátrium	-
foszfát (reagens minőség) Egybázisú nátrium-foszfát	2,27
(USP)	0,55
Glicin, USP	20,00
Humán albumin, USP	1,0
Injekciós víz, USP	1,0 ml-re kiegészítve

Az injekció víz (USP) egy részét keverővei felszerelt megfelelő edénybe töltjük. Ezután sorban hozzáadjuk és keverés közben feloldjuk a vízmentes kétbázisos nátrium-foszfátot, egybázisú nátrium-foszfátot, humán albumint és alfa2-interferont. Ezt követően az oldatot injekciós vízzel feltöltjük a végső térfogatra.

Az oldatot környezetben aszeptikusán steril tartályba töltjük, steril 0,2 mikronos szűrőn keresztül, amelyet előzőleg mostunk és hibátlanságát ellenőriztük. A szűrő hibátlanságát a szűrés után is ellenőrizzük.

Az oldatot aszeptikusán steril üvegcsékbe töltjük, ezeket steril liofilizáló berendezésbe helyezzük és az oldatot liofilizáljuk. Az üvegcséket aszeptikusán dugaszoljuk, lezárjuk és csomagoljuk.

2. példa

Alfa-interferon komplex

Alkotórészek	mg/ml
Liofilizált alfa2-interferon
üvegcsébe	(lásd az 1. példát)
Cink-acetát	4,0
Protamin-szulfát	2,5
Nátrium-hidroxid	0,6
Injekciós víz	1,0 ml.

A liofilizált alfa2-interferont az injekciós víz egy részében oldjuk. Nátrium-hidroxiddal a pH-t 8,2-re állítjuk be. Ezután hozzáadjuk a protamin-szulfátot és keverjük, majd hozzáadjuk a cink-acetátot és keverjük. Az oldatot a maradék vízzel a kívánt végtérfogatra egészítjük ki. A nátrium-hidroxidot, protamin-szulfátot és cink-acetátot előnyösen tömény vizes oldat alakjában alkalmazzuk (például protamin esetében 100 ml 25 mg/ml-es vizes oldatból).

Nyers alfa-interferon oldatok (azaz liofilizálatlanok) vagy más alkalmas alfa-interferon minták is

HU 201881 Β használhatók a találmány szerinti komplex előállítására, célszerűen az alkotórészeket a fenti sorrendben adagolva, azaz a foszfát puffért, HSA-t és glicint adjuk a vizes alfa-interferonhoz, a pH-t beállítjuk, protamint adunk az oldathoz, ezt követi a cink hozzáadása és végül az oldatot a végtérfogatra kiegészítjük.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás stabil, nyújtott hatású cink, protamin és alfa-interferon komplex előállítására, azzal jellemezve, hogy milliliterenként 2xl0⁶-200xl0⁶ nemzetközi egység alfa-interferonból, legfeljebb 10 mg humán szérum albuminból és 0-50 mg glicinből acetát, citrát vagy foszfát puffer jelenlétében 7,58,5 pH-értékű, előnyösen 8,2 pH-értékű pufferolt oldatot készítünk, és az alfa-interferon pufferolt oldatát 0,25-5 mg/ml protaminnal vagy gyógyszerészetileg elfogadható sójával és 1-20 mg/ml cinksóval reagáltatjuk oly módon, hogy a cinksót a protaminnal vagy gyógyszerészetileg elfogadható sójával egyidejűleg vagy utóbbiak hozzáadása után adjuk az oldathoz.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cinksóként cink-acetátot alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protamin gyógyszerészetileg elfogadható sójaként protamin-szulfátot alkalmazunk.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 8,0-8,4 pH-értékű puffért alkalmazunk.

5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy milliliterenként 4,0 mg cink-acetátot, 2,5 mg protamin-szulfátot, 0,6 mg nátrium-hidroxidot, 1 mg humán szérum albumint és 20 mg glicint alkalmazunk foszfát puffer jelenlétében.

6. A 2-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2x10' nemzetközi egység alfa2-interferont alkalmazunk.

7. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 8,2 pH-értékű puffért alkalmazunk.