BR112012027740B1 - composições contendo nucleosídeos de purina e pirimidina, peptídeos e maganês e seus usos - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES CONTENDO NUCLEOSÍDEOS DE PURINA E PIRIMIDINA, PEPTÍDEOS E MANGANÊS E SEUS USOS. A invenção fornece métodos para a produção de vacinas dirigidas contra microrganismos, com os métodos compreendendo a cultura, colheita e/ou suspensão do microrganismo na presença de uma composição protetora de radiação e a irradiação das bactérias ou vírus com uma dose de radiação suficiente para tornar o microrganismo deficiente em replicação e/ou não infeccioso. As composições de proteção de radiação utilizadas nos métodos da presente invenção compreendem pelo menos um nucleosídeo, pelo menos um antioxidante e pelo menos um peptídeo pequeno. A invenção também fornece métodos de tornar as bactérias em cultura resistentes à radiação ionizante (IR), com estes métodos compreendendo a cultura das bactérias na presença de uma composição protetora de radiação.

Description

COMPOSIÇÕES CONTENDO NUCLEOSÍDEOS DE PURINA E PIRIMIDINA, PEPTÍDEOS E MAGANÊS E SEUS USOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório US 61/329.381, depositado em 29 de abril de 2010, o qual é aqui incorporado na sua totalidade.

APOIO GOVERNAMENTAL

A invenção surgiu em parte de pesquisa financiada pela permissão DE-FG02-04ER63918 do U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biology and Environmental Remediation Reserch (BER), Environmental Remediation Sciences Program e pela permissão FA9559- 07-1-0128 de Air Force Office of Science Researh. O Governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

A presente invenção se refere a métodos para a produção de vacinas dirigidas contra microrganismos, com os métodos compreendendo a cultura, colheita e/ou suspensão do microrganismo na presença de uma composição protetora de radiação e irradiação do microrganismo com uma dose de radiação suficiente para tornar o microrganismo deficiente na replicação. As composições protetoras de radiação utilizadas nos métodos da presente invenção compreendem pelo menos um decapeptídeo em uma mistura de tampão de fosfato manganoso ou de bicarbonato de manganês. A invenção também proporciona métodos de tornar uma bactéria em cultura resistente à radiação ionizante (IR), com estes métodos compreendendo a cultura das bactérias na presença de uma composição protetora de radiação.

Antecedentes da Invenção

A família extremamente resistente à radiação Deinococcaceae é composta por mais de 20 espécies distintas que podem sobreviver a uma exposição aguda à radiação ionizante (IR) (10 kGy), luz ultravioleta (UV) (1 kJ/m2) e dessecação (anos), e podem crescer sob IR crônica (60 Gy/hora). Em particular, Deinococcus radiodurans é uma bactéria extremamente resistente a radiação ionizante (IR) que pode sobreviver a exposições a radiação gama que excedem por um fator de mil as doses as quais são citotóxicas e letais para as células de mamíferos.

Para as bactérias extremamente resistentes, tais como, por exemplo, D. radiodurans, a sobrevivência após alta dose de IR tem sido atribuída a uma proteção contra a oxidação das proteínas durante a irradiação, com o resultado de que os sistemas de reparação enzimáticos sobrevivem e funcionam com uma eficiência muito maior durante a recuperação do que em bactérias sensíveis, em que as proteínas celulares são altamente suscetíveis a carbonilação. Em um relatório publicado na revista Science (Daly et al. (2004), o acúmulo de Mn(ll) em Deinococcus radiodurans facilita a resistência a radiação gama, Science 306:925-1084), manganês intracelular(ll) foi implicado na facilitação a resistência à radiação protegendo as proteínas, mas não o DNA, durante a exposição à radiação ionizante e, em um segundo relatório publicado na PLoS Biology (Daly et al. (2007) Protein oxidation implicated as the primary determinat of bacterial radioresistahce, PLoS Biology 5 (4) e92), resistência à radiação foi positivamente correlacionada com a proteção da proteína durante a irradiação, mediada por um mecanismo não enzimático.

Ao contrário de D. radiodurans, a maioria das proteínas não é resistente à radiação. Da mesma forma, a maioria das células, quer em eucariotas, procariotas ou mamíferos (por exemplo, seres humanos) também não são resistentes à radiação. Como tal, a exposição à radiação é bastante prejudicial para a estrutura e/ou função da proteína. Por exemplo, a radiação ionizante demonstrou induzir (causar) câncer em muitas espécies diferentes de animais e em quase todas as partes do corpo humano.

Em seres humanos, a superexposição significativa à radiação pode resultar em envenenamento por radiação, também chamada “doença da radiação” ou uma “dose gradual”. O termo é geralmente utilizado para se referir a problemas agudos causados por uma grande dose de radiação em um curto período de tempo, embora este também tenha ocorrido a uma exposição a longo prazo a radiação de baixo nível. O nome clínico para “doença da radiação” é a síndrome de radiação aguda, tal como descrito pelo CDC. A síndrome de radiação crônica existe, mas é muito rara, o que tem sido observada no início entre os trabalhadores nos locais de produção de fonte de rádio e nos primeiros dias do programa nuclear soviético. A exposição de curta duração pode resultar na síndrome de radiação aguda; síndrome de radiação crônica requer um nível elevado de exposição prolongada.

Os seres humanos rotineiramente encontram radiação na vida diária, incluindo a radiação de equipamentos eletrônicos e telefones celulares, bem como radiação de origem natural. Indivíduos que estão em estreita proximidade de elementos radioativos, como, por exemplo, funcionários de uma usina nuclear ou de membros das forças armadas são particularmente susceptíveis de encontrar altas doses de radiação. Além disso, a radiação é usada em testes de diagnóstico, tais como raios-X e de terapia de radiação para o tratamento de cânceres.

Existem atualmente muito poucos radioprotetores adequados para o tratamento de seres humanos, e os que existem (por exemplo, a amifostina) são citotóxicas e têm efeitos secundários graves (por exemplo, perda de consciência, respiração rápida ou irregular, prurido, náusea e vômitos).

Tendo em conta a grande exposição à radiação, existe uma necessidade significativa de radioprotetores que são não tóxicos, preservam a função da proteína e, em particular, são adequados para utilização humana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona métodos para a produção de vacinas dirigidas contra microrganismos, com os métodos compreendendo a cultura, colheita e/ou suspensão do microrganismo na presença de uma composição protetora de radiação e irradiando o microrganismo com uma dose de radiação suficiente para tornar o microrganismo deficiente na replicação. As composições de proteção de radiação usadas em métodos de preparação de vacina da presente invenção compreendem pelo menos um decapeptídeo em tampão contendo manganês.

A invenção também fornece métodos de tornar uma bactéria em cultura resistente à radiação ionizante (IR), com estes métodos compreendendo a cultura das bactérias na presença de uma composição protetora de radiação. As composições de proteção de radiação utilizadas nos métodos resistentes a IR da presente invenção compreendem pelo menos um nucleosídeo, fosfato, pelo menos, um antioxidante, e dimetil sulfóxido (DMSO).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra que compostos em ultrafitrados de D. radiodurans protegem proteínas, mas ultrafiltrados de compostos em Pseudonomas putida (PP), Escherichia coli (EC), e Thermus thermophilus (TT) não. Extrato de célula de D. radiodurans (DR) ultrafiltrado isento de proteína impede a oxidação da proteína induzida por radiação ionizante (IR) in vitro, mas extratos de bactérias sensíveis a radiação de Pseudomonas putida (PP), Escherichia coli (EC), e Thermus thermophilus (TT) não. Proteínas purificadas de E. coli foram incubadas em extrato ultrafiltrato de PP, EC, TT ou DR durante a irradiação, e submetidas a um ensaio de proteína de carbonila. Gel desnaturante de poliacrilamida colorido com Coomassie; Western blot de Carbonila revelando oxidação e proteção (sem sinal) de proteína.
A Figura 2 representa a composição de ultrafiltrado de Deinococcaceae radiodurans (DR) em comparação com ultrafiltrado de Pseudomonas putida (PP), Escherichia coli (EC) e de Thermus thermophilus (TT).
A Figura 3 representa as curvas de sobrevivência de E. coli exposta a IR aguda e crescida na presença de vários suplementos: TGY, meio de crescimento rico em peptídeo padrão; DMSO, dimetil sulfóxido; UMnP, 3 mM uridina/1 μΜ Mn2+/13 mM PiB (tampão fosfato).
A Figura 4 representa o papel de peptídeos na resistência à radiação ionizante. (A) distribuição citosólica e concentração de aminoácidos em D. radiodurans: “No-IR”, células de controle não irradiadas mantidas em tampão fosfato de potássio 25 mM, pH 7,4 em gelo, em seguida, lavadas e mantidas em tampão fosfato 25 mM, pH 7,4 (32°C) por 0 ou 30 minutos. “+IR” células irradiadas a 7 kGy em tampão fosfato 25 mM, pH 7,4 em gelo, em seguida, lavadas e mantidas em tampão fosfato 25 mM, pH 7,4 (32°C) por 0 ou 30 minutos. As células foram colhidas, ressuspensas em TCA a 20% e lisadas. Alíquotas de sobrenadante neutralizado foram analisadas para o aminoácido livre e teor de aminoácido derivado de peptídeo. (B) Radioproteção de BamH1 pelo decapeptídeo (H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH; 1261 Da). (C) Radioproteção de glutamina sintetase (GS) porMn2+ e leucina (Leu), uridina (U) ou decapeptídeo (DP) em tampão fosfato de potássio (PIB), pH 7,4 ou tampão de bicarbonato de sódio (HCO3), pH 7,4.
A Figura 5 representa a abordagem para preparação de vacina irradiada com o complexo de manganês. (A) DNA foi preparado a partir de bacteriófago λ irradiado tratado (à direita) ou não (esquerda) com o complexo Mn2+ (Mn-pep-Pi): 3 mM (H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH) (SEQ ID NO: I), 1 mM MnCI2) tampão ortofosfato (Pi) 25 mM (pH 7,4). Nas doses de raios-gama indicadas (0-40 kGy), DNA (48,5 kpb de genoma) foi purificado a partir do bacteriófago λ, submetido a eletroforese em gel de agarose convencional e, em seguida, Southern blotting com uma sonda de λ DNA radiomarcada. Conclusão: O complexo Mn2+ significativamente não protege DNA empacotado em vírus. (B) As mesmas preparações de bacteriófagos λ examinadas no painel A foram testadas quanto à integridade da proteína separando as proteínas de vírus utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida. Conclusão: As proteínas em vírus que foram irradiadas na ausência do complexo Mn2+ (esquerda) foram progressivamente destruídas. Em contraste, as proteínas nas amostras de vírus que continham o complexo Mn2+ (à direita) não foram afetadas por doses tão altas quanto 40 kGy. (C) a 40.000 Gy, uma dose que obliterou o DNA do vírus (painel A) e tornou o vírus completamente não infeccioso (não mostrado), as proteínas de vírus permaneceram completamente imunogênicas. Isto foi testado por análise de Western, pelo que as proteínas λ foram desafiadas com anticorpos criados em coelhos contra fago λ não irradiado. Notem, um resultado positivo idêntico para a imunogenicidade foi obtido por Westerns equivalentes sondados com anticorpos criados contra o fago λ expostos a 40.000 Gy na presença do complexo Mn2+. Em contraste, o fago λ exposto a 40.000 Gy na ausência do complexo Mn2+ não produziu anticorpos em coelhos que tinham especificidade significativa para λ bacteriófago nativo. (D) e (E): Micrografia eletrônica de transmissão (TEM) de fago λ pré-irradiação - tratado (E) ou não tratado (D) com complexo Mn2+. (F) e (G): TEM de fago λ pós-irradiação (40 kGy) tratado (G) ou não (F) com o complexo Mn2+. Na presença do complexo Mn2+, as partículas de vírus de fago λ expostas a 40 kGy não foram danificadas.
A Figura 6 representa dados de tabelas e gráficos de camundongos testados com Staphylococcus aureus (MRSA). Estes dados mostram que a presença do complexo de manganês na composição irradiada conferiu resposta imune maior nos camundongos tratados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os inventores estudaram a radiorresistência de D. radiodurans e prepararam extratos de células isentos de proteína ultrapurificados que exibem propriedades radioprotetoras. Assim, a invenção é baseada em parte na descoberta de componentes radioprotetores de extrato isento de célula de D. radiodurans e composições artificiais contendo tais componentes.

Em particular, os requerentes demonstraram que extratos de células isentos de proteína e ultrapurificados de D. radiodurans são extremamente radioprotetores de proteínas expostas à radiação gama. Uridina, adenosina e peptídeos são acumulados em ultrafiltrado de D. radiodurans em concentrações mais elevadas do que em ultrafiltrados de bactérias sensíveis a radiação. In vitro, em doses > 10.000 Gy, nucleosídeos demonstraram ser altamente protetores de proteínas, prevenindo a carbonilação de proteína induzida por radiação ionizante (IR) e preservam as enzimas funcionais na presença de Mn(ll). Uma composição radioprotetora de adenosina, manganês, peptídeos e fosfato foi desenvolvida. Surpreendentemente, extratos de D. radiodurans demonstraram ser potentes radioprotetores células T humanas cultivadas, com potência maior do que outros compostos radioprotetores bem estabelecidos.

A presente invenção fornece composições radioprotetoras ou sintéticas ou derivadas de D. radiodurans (DR) e métodos de utilização destas composições para proteger as proteínas e/ou as células de danos por radiação. Estas composições são úteis para evitar danos causados pela radiação em composições, bem como em indivíduos, tais como seres humanos, ou em culturas de células. A composição da presente invenção compreende manganês e pelo menos um peptídeo antioxidante, ou elas compreendem manganês e um conjunto de aminoácidos individuais. Em modalidades adicionais, a composição pode também compreender pelo menos um nucleosídeo. Como aqui utilizado, a “composição radioprotetora” ou “composição protetora de radiação” pode significar tanto um extrato ultrafiltrado de DR preparado de acordo com os métodos aqui descritos, ou pode significar uma composição sintética compreendendo manganês e pelo menos um peptídeo antioxidante ou um conjunto de aminoácidos individuais. Se um extrato ultrafiltrado de DR é utilizado, este extrato pode ser suplementado com qualquer um dos compostos descritos e aqui revelados. Por exemplo, o ultrafiltrado de DR pode ser preparado de acordo com os métodos revelados aqui, e Mn2+ ou peptídeos adicionais, por exemplo, podem ser adicionados ao extrato.

As composições podem ainda conter radioprotetores leucina, alanina, e/ou valina. Leucina está fortemente implicada na eliminação de peróxido de hidrogênio na presença de Mn(ll), e pode ser componente de grandes complexos intracelulares que incluem a uridina e adenosina. Forte evidência in vitro indica um efeito sinergístico entre adenosina e manganês e fosfato. A estequiometria dos tampões de adenosina e de manganês e fosfato ou bicarbonato podem ser otimizados para um ensaio de apoptose.

Os requerentes demonstraram que a adenosina sozinha e Mn(ll) sozinho são radioprotetores in vivo para uma linha celular de mamífero e para a cultura de células bacterianas.

Apesar de não estar ligada por qualquer teoria particular, acredita-se que as composições compreendendo nucleosídeos de purina (por exemplo, adenosina), nucleosídeos de pirimidina (por exemplo, uridina) e um peptídeo antioxidante (por exemplo, peptídeo de manganês) atuam como radioprotetores protegendo uma superfície e um local ativo da proteína. O nucleosídeo de purina, por exemplo, adenosina (e, opcionalmente, combinado com o nucleosídeo pirimidina uridina, e peptídeos) medeia os seus efeitos sobre a acumulação de radioproteção dentro de uma célula, o qual inibe a radiação induzida por oxidação de proteínas, e, na presença de Mn(ll) preserva a função da enzima. A adenosina é pensada para proteger proteínas e, portanto, limpando um subsistema ROS.

Por outro lado, sem estar limitado por qualquer teoria particular, acredita-se que, sob condições de irradiação aeróbias ou anaeróbias, superóxido podem acumular-se nas células durante a irradiação, porque o superóxido não atravessa facilmente as membranas. Apesar de superóxido não reagir com o DNA, o superóxido irá danificar e inativar as enzimas com aglomerados 2Fe-2S ou 4Fe-4S expostos, libertando Fe(ll), e também certos danos expostas de aminoácidos, tais como, mas não limitado a, cisteína. O problema com o ferro em uma célula, quando é desacoplado e “livre”, é que ele provoca reações Fenton, na presença de peróxido de hidrogênio, gerando radicais hidroxil. Portanto, as condições, as quais liberam a ligação Fe (II) são extremamente perigosas, não só por causa da geração de radicais hidroxil, mas, porque a perda de Fe de enzimas dependentes de Fe conduz ao fracasso das vias bioquímicas em que operam. Os métodos da presente aplicação otimamente protegem contra tais condições perigosas.

A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que comumente compreendidos por um técnico versado no assunto à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos preferidos e os materiais são descritos.

Tal como aqui utilizado, “um” ou “uns” significa que pelo menos um, a menos que claramente indicado de outro modo. O termo “cerca de”, a menos que indicado em contrário, refere-se a um valor que não é mais do que 10% acima ou abaixo do valor a ser modificado pelo termo. Por exemplo, o termo “cerca de 5% (p / p)” entende-se um intervalo de 4,5% (p / p) a 5,5% (p / p).

A presente invenção proporciona métodos de preservação da função das proteínas ou imunogenicidade de proteínas compreendendo o contato de uma proteína com uma composição da presente invenção. Uma modalidade da invenção é um método de preservação da função da proteína quando a proteína está exposta às condições extremas de radiação, como, por exemplo, radiação gama. Em outra modalidade da invenção, o método preserva a função da proteína durante a dessecação.

Os métodos de preservação da função da proteína fornece radioproteção quando a proteína está exposta à dose elevada de radiação, tais como doses superiores a 10 kGy, por exemplo, 17,5 kGy.

Em outra modalidade, a invenção proporciona métodos de proteção da função das proteínas ou imunogenicidade de proteínas em uma cultura de células ou preparação de vírus compreendendo a colheita de cultura e/ou a suspensão das células com qualquer uma das composições radioprotetoras descritas aqui. A preparação de vírus pode ser, por DNA ou RNA, genomas de cadeia simples ou de cadeia dupla. A cultura de células pode ser procariótica ou eucariótica. Em uma modalidade, a cultura de células é bacteriana. Em outra modalidade, a cultura de células é de mamífero. Ainda em outra modalidade, a cultura de células é uma cultura com a finalidade de propagação de vírus.

Qualquer nucleosídeo, se presente, pode ser utilizado nas composições de proteção da radiação. Nucleosídeos apropriados incluem, mas não estão limitados a, adenosina, uridina, β-pseudouridina, inosina e misturas dos mesmos. Além disso, os análogos de nucleosídeos que contêm dois grupos oxigênio carbonil (C=0), separados por um grupo (N3)H também pode ser usado. Em uma modalidade, o nucleosídeo é adenosina ou uridina. Em uma modalidade, a composição contém adenosina. Em outra modalidade da invenção, a composição contém uridina. A quantidade de nucleosídeo na composição varia de acordo com o seu uso. Os técnicos versados no assunto serão capazes de determinar a quantidade adequada. Em algumas modalidades da invenção, a quantidade de nucleosídeos varia a partir de cerca de 0,01 mM a cerca de 15 mM, desde cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, desde cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, desde cerca de 1 mM a cerca de 15 mM. Em uma modalidade, a concentração de um ou mais nucleosídeo compreende cerca de 1 mM a cerca de 15 m M de adenosina e/ou uridina.

Uma variedade de antioxidantes pode ser usada ou estar presente na composição. Antioxidantes apropriados incluem manganês, vitamina E e fosfato manganoso, peptídeos de Mn, aminoácidos de Mn (por exemplo, Leucina), Mn-TRIS, Mn-melanina, Mn-cafeína, Mn-ribose, Mn-trealose, Μη-ácido dipicolínico, Mn-fosfato e Mn-bicarbonato. Em uma modalidade da invenção, o antioxidante é manganês. Em uma outra modalidade, o antioxidante é MnCI2. Ainda um outra modalidade, o antioxidante é Vitamina E e/ou aspirina. A quantidade de antioxidantes na composição varia com sua utilização. Os técnicos versados no assunto serão capazes para determinar a quantidade apropriada. Em uma modalidade, a composição contém cerda de 0,01 mM a cerca de 15 mM de antioxidante. Em outro modalidade, a composição contém cerca de 0,01 mM a cerca de 12,5 mM.

Em uma modalidade da invenção, um antioxidante é o fosfato manganoso que pode ser proporcionado como uma mistura. Em uma modalidade, a mistura é produzida através da mistura de uma solução de manganês e uma solução de fosfato. A quantidade de antioxidante presente na composição varia de acordo com o seu uso. Os técnicos versados no assunto serão capazes para determinar a quantidade adequada. Em uma modalidade, as composições contêm de cerca de 0,01 M a cerca de 15 mM dos íons manganosos (Mn(ll)). Em uma modalidade mais específica, as composições compreendem cerca de 0,01 mM a cerca de 15 mM de manganês (Mn(ll)) em amostras de um tampão de fosfato. Em uma modalidade ainda mais específica, as composições compreendem tampão de fosfato a uma concentração de entre cerca de 1 mM a cerca de 25 mM. Em uma modalidade específica, a mistura é uma solução de 1 mM de Mn(ll), e uma solução de tampão fosfato 25 mM (pH 7,4).

As composições contêm um ou mais aminoácidos que exibem propriedades citoprotetoras. Em uma modalidade da invenção, a composição contém ainda pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em asparagina, glutamina, serina, histidina, glicina, treonina, arginina, tirosina, metionina, fenilalanina, isoleucina, lisina, ornitina, leucina, valina e alanina. Em uma outra modalidade, o aminoácido é a leucina. Em uma modalidade alternativa, o aminoácido é glicina. Em outra modalidade, as composições incluem pelo menos a leucina e alanina. Em outra modalidade, a composição não contém prolina. Em ainda uma outra modalidade, a composição contem 10% ou menos de prolina como medida contra a presença de outros aminoácidos. Por exemplo, uma mistura igual de 12 aminoácidos distintos iria conter um resíduo de prolina ou menos nesta modalidade.

Como uma alternativa, ou em complemento, a presença de aminoácidos individuais, as composições e os métodos que utilizam estas composições podem compreender pelo menos um peptídeo pequeno, tal como, mas não se limitando a, um decapeptídeo. Como usado aqui, “peptídeo pequeno” significa uma cadeia pequena, linear de aminoácidos de não mais do que cerca de 25 resíduos de comprimento. Em uma modalidade, os peptídeos pequenos utilizados nas composições e métodos da presente invenção são cerca de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 , 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 aminoácidos de comprimento. A sequência atual do peptídeo não é crítica para as composições e métodos da presente invenção, deste modo, qualquer cadeia peptídica aleatória será suficiente. Por exemplo, em uma modalidade, as composições e os métodos que utilizam estas composições podem compreender pelo menos um peptídeo pequeno, em que o peptídeo compreende uma pequena sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: I: Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys (SEQ ID NO: I). Em uma modalidade, o peptídeo pequeno não contém resíduos de prolina. Em uma outra modalidade, o peptídeo contém menos que 10% de resíduos de prolina, em comparação com outros aminoácidos. Por exemplo, nesta modalidade específica, um 12-mer poderia conter um resíduo prolina ou menos.

Ainda em outras modalidades, cada um dos pequenos peptídeos, independentemente, compreendem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: I. Peptídeos pequenos que são menos do que 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: I são considerados variantes da mesma.

A quantidade de peptídeo pequeno variará. Os técnicos versados no assunto serão capazes de determinar a quantidade adequada, de acordo com uma variedade de fatores, tais como o sujeito, a duração da exposição à radiação, o valor da exposição à radiação, etc. Em algumas modalidades da invenção, a quantidade de peptídeos pequenos varia de cerca de 0,01 mM a cerca de 15 mM, desde cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, desde cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, desde cerca de 1 mM a cerca de 15 mM. Em uma modalidade, a concentração de um ou mais pequeno peptídeo compreende cerca de 1 mM a cerca de 15 mM de peptídeo da SEQ ID NO: I, ou variantes das mesmas. Em outras modalidades, a concentração de um ou mais peptídeos pequenos compreende cerca de 15 mM ou menos, cerca de 14 mM ou menos, cerca de 13 mM ou menos, cerca de 12 mM ou menos, cerca de 11 mM ou menos, cerca de 10 mM ou menos , cerca de 9 mM ou menos, cerca de 8 mM ou menos, cerca de 7 mM ou menos, cerca de 6 mM ou menos, cerca de 5 mM ou menos, cerca de 4 mm ou menos, cerca de 3 mM ou menos, cerca de 2 mM ou menos, cerca de 1 mM ou menos ou cerca de 0,5 mM ou menos do peptídeo da SEQ ID NO: I. É claro, a concentração de um ou mais peptídeos pequenos podem ser entre qualquer uma das concentrações listadas, por exemplo, entre cerca de 15 mM e cerca de 14 mM, entre cerca de 14 mM e cerca de 13 mM, entre cerca de 13 mM e cerca de 12 mM, entre cerca de 12 mM e cerca de 11 mM , entre cerca de 11 mM e cerca de 10 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 9mm, entre cerca de9 mM e 8mM e, entre cerca de 8 mM e cerca de 7 mm, entre cerca de 7 mm e cerca de 6 mM, entre cerca de 6 mM e cerca de 5 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 4 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 3 mM, entre cerca de 3 mM e cerca de 2 mM, entre cerca de 2 mM e sobre 1 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 0,5 mM, etc. do peptídeo da SEQ ID NO: I, ou variantes das mesmas.

Um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, cerca de 95% “idêntica” a uma sequência de aminoácidos de referência, por exemplo, SEQ ID NO: I, é entendida como significando que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência de aminoácidos pode incluir até cerca de cinco modificações por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência. Em outras palavras, para se obter um peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, até cerca de 10% dos resíduos de aminoácidos da sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro aminoácido ou um número de aminoácidos até cerca de 10% do total de ácidos aminados na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas modificações da sequência de referência podem ocorrer nas posições N-terminal ou C-terminal da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os aminoácidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Tal como aqui utilizado, “identidade” é uma medida da identidade de sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos em comparação com um nucleotídeo de referência ou sequência de aminoácidos. Em geral, as sequências são alinhadas de modo que a compatibilidade de ordem mais elevada seja obtida. “Identidade” per se tem um significado reconhecido no estado da técnica e pode ser calculada utilizando técnicas publicadas. (Ver, por exemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York (1991))). Embora existam vários métodos para medir a identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, a “identidade” é bem conhecido por técnicos versado no assunto (Cârillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)). Métodos normalmente empregados para determinar a identidade ou semelhança entre duas sequências incluem, mas não estão limitados a, os descritos em Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994) e Carillo, H. e Lipton , D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988). Programas de computador também podem conter métodos e algoritmos que calculam identidade e similaridade. Exemplos de métodos de programas de computador para determinar a identidade e semelhança entre duas sequências incluem, mas não estão limitados a, pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (i):. 387 (1984)), BLASTP, ExPASy, BLASTN, FASTA (Atschul, SF, et al., J Molec Biol 215:403 (1990)) e FASTDB. Exemplos de métodos para determinar a identidade e semelhança são discutidos em Michaels, G. e Garian, R., Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc. (2000), o qual é incorporado por referência.

Em uma modalidade da presente invenção, o algoritmo utilizado para determinar a identidade entre dois ou mais polipeptídeos é BLASTP. Em outra modalidade da presente invenção, o algoritmo utilizado para determinar a identidade entre dois ou mais polipeptídeos é FASTDB, que se baseia no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990), incorporado por referência). Em um alinhamento de sequências FASTDB, a consulta e sequências de referência são sequências de aminoácidos. O resultado do alinhamento da sequência é a percentagem de identidade. Os parâmetros que podem ser utilizados num alinhamento FASTDB de sequências de aminoácidos para calcular a percentagem de identidade incluem, mas não estão limitados a: Matriz = PAM, k-tupla = 2, Penalidade Mismatch = I Penalidade de junção = 20, Comprimento de Grupo de Aleatoriedade = 0, Escore de corte = I, Penalidade de lacuna = 5, Penalidade de tamanho de lacuna = 0,05, Tamanho da janela = 500 ou o comprimento da sequência de aminoácidos do sujeito, o que for menor.

Se a sequência de referência é menor ou maior do que a sequência de consulta devido à extremidade de adições ou deleções N-terminal ou C-terminal, mas não por causa de adições ou deleções internas, uma correção manual pode ser feita, porque o programa FASTDB não conta para truncamentos ou adições N-terminal e C-terminal da sequência de referência para calcular a percentagem de identidade. Para as sequências de consulta truncadas na extremidade N- ou C-terminais, em relação à sequência de referência, a percentagem de identidade é corrigida por meio do cálculo do número de resíduos da sequência de consulta que são N- e C-terminal da sequência de referência, que não são acompanhadas / alinhadas, como uma percentagem das bases totais da sequência de consulta. Os resultados do alinhamento da sequência de FASTDB determina a compatibilidade / alinhamento. A percentagem de alinhamento é então subtraída a percentagem de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar a um resultado final da percentagem de identidade. Esta pontuação corrigida pode ser utilizada para fins de determinação de como alinhamentos “correspondem” um ao outro, assim como a identidade percentual. Resíduos da sequência de referência que se estendem ultrapassando a N-ou C-terminais da sequência de consulta podem ser considerados para os fins de ajuste manual da pontuação da percentagem de identidade. Isto é, os resíduos que não são compatíveis/ alinhados com a N- ou C-terminal da sequência de comparação podem ser contados quando se ajustar manualmente a pontuação de percentagem de identidade ou de alinhamento de numeração.

Por exemplo, uma sequencia de consulta de resíduo de 90 aminoácidos é alinhada com uma sequência de referência de 100 resíduos para determinar a percentagem de identidade. A deleção ocorre no terminal N da sequência de consulta e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra uma compatibilidade/ alinhamento dos primeiros 10 resíduos no N-terminal. Os 10 resíduos desemparelhados representam 10% da sequência de referência (número de resíduos no N- e C-terminais não compatíveis / número total de resíduos na sequência de referência) para 10% é subtraído da contagem de percentagem de identidade calculado pelo programa FASTDB. Se os restantes 90 resíduos forem perfeitamente compatíveis (100 % de alinhamento) a percentagem de identidade final seria de 90% (100 % de alinhamento - 10% de saliência ímpar). Em outro exemplo, uma sequência de consulta de 90 resíduos é comparada com uma sequência de referência 100, com exceção de que as deleções são as deleções internas. Neste caso, a percentagem de identidade calculada por FASTDB não for corrigida manualmente, uma vez que não existem resíduos no N- ou C-terminal da sequência sujeitada que não é compatível / alinhada com a consulta. Ainda em outro exemplo, uma sequência de consulta de 110 aminoácidos está alinhada com uma sequência de referência de 100 resíduos para determinar a percentagem de identidade. A adição na consulta ocorre no N-terminal da sequência da consulta e, por conseguinte, o alinhamento FASTDB pode não apresentar uma compatibilidade/ alinhamento dos primeiros 10 resíduos no N-terminal. Se os restantes 100 resíduos de aminoácidos da sequência de consulta têm de identidade de 95% ao longo de toda a sequência de referência, a adição N-terminal da consulta seria ignorada e a percentagem de identidade da consulta para a sequência de referência seria de 95% .

Em uma modalidade, as composições compreendem adenosina, uridina, leucina, adenina, e manganês. Em uma outra modalidade, a composição compreende cerca de 1 a cerca de 15 mM de adenosina e cerca de 1 a cerca de 12,5 mM de MnCI2 . Em uma outra modalidade, a composição compreende um extrato de D. radiodurans contendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes.

Qualquer função de proteína pode ser mantida através da utilização dos métodos da presente invenção. Em uma modalidade preferida da invenção, a proteína é uma enzima. Os métodos da presente revelação são particularmente úteis na prevenção da oxidação de proteínas associadas com a radiação ultravioleta e ao envelhecimento. Além disso, os métodos também preservam a funcionalidade da proteína durante a secagem e, assim, ajudam a aumentar a vida útil de produtos derivados do sangue dessecado e fármacos à base de enzimas, que são armazenadas a seco.

Os métodos da invenção de forma otimizada preservam a função da proteína (por exemplo, atividade enzimática), durante a exposição à radiação. Uma modalidade da invenção é um método de conservação compreendendo o contato de uma proteína (como, por exemplo, uma enzima) com uma composição compreendendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes.

Uma outra modalidade da invenção é um método para aumentar a durabilidade e longevidade de células combustível microbianas e enzima dirigidas compreendendo o contato dos componentes da célula combustível com uma composição compreendendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes.

Este método pode ser adequado para preservar a função de muitas proteínas, incluindo, mas não se limitam a, proteínas com complexos Fe-S (tais como enzimas metabólicas) e as funções de reparação enzimáticas que são dependentes de aglomerados redox-ativos (4Fe-4S). Proteínas exemplificativas incluem grupos de proteínas associadas com a produção de espécies de oxigênio reativo (OS), precursores de proteínas de transporte que pode reduzir as exigências de biossíntese e suprimir a produção de ROS, proteínas de defesa contra ROS, proteínas que participam na reparação de moléculas danificadas (não DNA) e regulação redox, bem como sistemas dependentes de Mn e Fe. Outras proteínas exemplificativas são listados na Ghosal et al. (2005), FEMS Microbiology Reviews 29: 361-375, cuja divulgação é aqui incorporada na sua totalidade.

A invenção também proporciona métodos de produção de vacinas dirigidas contra microrganismos, com os métodos compreendendo a cultura, colheita e/ou suspensão do microrganismo na presença de uma composição protetora de radiação da presente invenção, e irradiando as bactérias com uma dose de radiação suficiente para tornar o microrganismo deficiente na replicação. Em uma modalidade, a composição de proteção de radiação é sintética, em outra modalidade, a composição de proteção de radiação é um extrato ultrafiltrado DR.

Os métodos de preparação de vacinas são bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos aqui fornecidos podem ser aplicados a estes métodos bem conhecidos de preparação de vacinas, ou podem ser usados separadamente e à parte dos métodos tradicionais de preparação de vacinas. Por exemplo, uma modalidade da presente invenção fornece métodos de preparação de vacina sem engenharia genética do microrganismo contra o qual a vacina está a ser preparada. Os métodos aqui descritos permitem que microrganismos normais, tipo selvagem, sejam cultivados, colhidos e/ou suspensos, na presença de composições de proteção de radiação, de tal forma que a estrutura tridimensional das proteínas dentro e os marcadores da superfície celular sobre a microrganismos é preservada durante a uma dose de radiação extrema. A dose de radiação foi concebida para eliminar o genoma do microrganismo, de tal modo que o microrganismo seja incapaz de replicação. Após o tratamento com radiação, as células deficientes na replicação podem ser recolhidas e preparação de vacina pode ser realizada utilizando técnicas de preparação de vacina normais. As composições de proteção da presente invenção preserva pelo menos uma fração das proteínas imunogênicas do microrganismo, tal que a administração de uma vacina compreendendo o microrganismo irradiado a um animal irá produzir uma resposta imunogênica. Assim, os métodos atuais de preparação de vacina podem ser praticados utilizando técnicas de cultura de células de rotina. Os microrganismos contra os quais a vacina pode ser preparada usando os métodos da presente invenção incluem as bactérias e os vírus. Técnicas padrão de cultura de células de bactérias e vírus são bem conhecidos no estado da técnica.

É claro que os métodos de preparação de vacina da presente invenção não estão limitados a um determinado tipo de radiação, desde que o tipo e a dose utilizada seja capaz de tornar a replicação do microrganismo defeituosa. Exemplos de radiação incluem, mas não estão limitados a, luz UV, radiação alfa, radiação beta, raios gama, radiação de raios-X e radiação de nêutrons. Em uma modalidade, a dose de radiação é de pelo menos cerca de 20 kGy. A dose de radiação pode ser mais de 25.000 Gy (25kGy) para as misturas de bactérias e a dose de radiação pode ser de mais de 40.000 Gy (40 kGy) para as misturas virais.

A invenção também proporciona métodos para tornar as bactérias em cultura resistentes à radiação ionizante (IR), com estes métodos compreendendo a cultura das bactérias na presença de uma composição protetora de radiação da presente invenção. As composições protetoras de radiação utilizadas para métodos resistentes a IR da presente invenção compreendem pelo menos um nucleosídeo, fosfato, pelo menos, um antioxidante e quaisquer limpador de radical hidroxila não-metabolizáveis, tais como, mas não limitados a, dimetil sulfóxido (DMSO).

A invenção também proporciona métodos de tratamento ou prevenção dos efeitos da exposição à radiação. Os métodos compreendem o tratamento ou a prevenção dos efeitos da exposição à radiação com um agente terapêutico compreendendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes.

Em uma modalidade da invenção, a exposição à radiação é devido à exposição aos raios UV. Em outra modalidade da invenção, a exposição à radiação é devido à radiação ionizante. Em outra modalidade da invenção, a exposição à radiação é crônica.

Tal como utilizado aqui, o “agente terapêutico” deve abranger composições compreendendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes, bem como as formulações que contêm outros componentes farmaceuticamente aceitáveis, tais como por exemplo, veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Tal como aqui utilizado, “exposição a radiação” entende-se a exposição a qualquer radiação em uma dose e por um período suficiente para causar danos. Exposição à radiação inclui, mas, não está limitada a, exposição a luz UV, a radiação alfa, radiação beta, radiação por raios gama, radiação de raios-X e radiação de nêutrons.

Em uma modalidade, a invenção proporciona métodos de tratamento ou prevenção de efeitos colaterais da radioterapia. Como usado aqui, o termo “radioterapia” refere-se à utilização de determinados tipos de energia (tais como, por exemplo, radiação ionizante) para matar as células cancerosas e encolher os tumores. A “radioterapia” abrange todos os tipos de radioterapia, incluindo, mas não se limitando a terapia de radiação externa (tal como, por exemplo, radioterapia intraoperatória e irradiação craniana profilática (PC)), terapia de radiação interna (como por exemplo, a terapia de radiação intersticial, radiação intracavitária ou terapia intraluminal), radioterapia sistêmica, radiocirurgia estereotática (ou estereotáxica), terapia de radiação conformai tridimensional (3-D), terapia de radioterapia de intensidade modulada (IM RT). Além disso, o termo “radioterapia” também engloba radioterapia utilizando uma variedade de fontes de radiação, incluindo, mas não se limitando aos raios-X, raios gama, feixes de partículas, terapia de feixe de prótons, e de radiação de fótons de alta energia. A radioterapia é utilizada para tratar uma variedade de cânceres incluindo tumores sólidos (tais como, por exemplo, cânceres da mama, cérebro, colo do útero, da laringe, do pulmão, pâncreas, próstata, pele, coluna, estômago, útero, ou sarcomas de tecidos moles). A radioterapia também é usada para tratar leucemia e linfoma (por exemplo, cânceres das células formadoras de sangue e do sistema linfático, respectivamente), bem como cânceres da pele, colo do útero e tireoide.

Tal como aqui utilizado, o termo “efeitos colaterais da radioterapia” irá referir a qualquer efeito secundário experimentado por um sujeito submetido a radioterapia. Estes efeitos secundários incluem, mas não estão limitados a, cansaço e reações cutâneas, anemia, aumento do risco de hematomas e hemorragias, diminuição da fertilidade, boca seca, perda de apetite e de peso, perda de cabelo, etc.

Um “sujeito em necessidade desse tratamento” é um animal com uma infecção bacteriana que está potencialmente com risco de vida ou que dificulta a saúde ou encurta o tempo de vida do animal. O animal pode ser um peixe, ave ou mamíferos. Mamíferos exemplificativos incluem seres humanos, animais domésticos (por exemplo, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, cães e gatos), e animais de exposição, por exemplo, em um jardim zoológico. Em uma modalidade preferida, o sujeito é humano.

Os termos “tratando”, “tratamento” e “terapia” tal como aqui utilizado referem-se à terapia curativa, terapia profilática e terapia preventiva.

Tal como aqui utilizado, a menos que indicado o contrário, o termo composição destina-se a englobar, e não se limitando a, as composições farmacêuticas e composições de nutracêuticas, contendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes. A composição pode também conter um ou mais “excipientes”, que são “ingredientes inativos” ou “compostos" desprovidos de atividade farmacológica ou outro efeito direto no diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doenças ou para afetar a estrutura ou qualquer função do corpo humano.

O termo “farmaceuticamente aceitável” é um componente que é adequado para uso com seres humanos, animais e/ou plantas, sem indevidos efeitos secundários adversos (tais como, por exemplo, toxicidade, irritação e resposta alérgica) proporcionais a uma razão benefício / risco razoável.

O agente terapêutico pode conter qualquer nucleosídeo. Nucleosídeos apropriados incluem, mas não estão limitados a, adenosina, uridina, β-pseudouridina, inosina e suas misturas. Em uma modalidade, o nucleosídeo é a adenosina e/ou uridina. Em uma modalidade, o agente terapêutico contém adenosina. Em outra modalidade da invenção, o agente terapêutico inclui uridina.

O agente terapêutico pode conter uma variedade de antioxidantes adequados, que foram aqui descritos. Por exemplo, antioxidantes adequados incluem, mas não estão limitados ao, manganês, vitamina E, e manganês-fosfato, peptídeos de Mn, aminoácidos de Mn [por exemplo, leucina), Mn-TRIS, Mn-melanina, Mn-cafeína, Mn- ribose, Mn-trealose, Μη-ácido dipicolínico, Μη-fosfato e Mn-bicarbonato. Em uma modalidade da invenção, o antioxidante do agente terapêutico é manganês. Em uma outra modalidade, o antioxidante é MnCI2. Ainda em outra modalidade, o antioxidante é um ou mais peptídeos.

Em uma modalidade da invenção, um antioxidante crítico é o fosfato manganoso, o que pode ser fornecido em concentrações quase milimolares. Em uma outra modalidade, o antioxidante é MnCI2, com fosfato adicionado separadamente. O fosfato pode ou não ser o ortofosfato. A quantidade de antioxidante presente na composição varia de acordo com o seu uso. Os técnicos versados no assunto serão capazes de determinar a quantidade adequada. Em uma modalidade, a composição contém cerca de 0,01 mM até cerca de 15 mM de íons de manganês (Mn(ll)) e 1 mM a de cerca de 25 mM de tampão de fosfato.

A quantidade de nucleosídeo e um antioxidante no agente terapêutico variam. Os técnicos versados no assunto serão capazes de determinar a quantidade adequada de acordo com uma variedade de fatores, tais como o sujeito, a duração da exposição à radiação, o valor da exposição à radiação, etc. Em algumas modalidades da invenção, a quantidade de nucleosídeos varia a partir de cerca de 0,01 mM a cerca de 15 mM, desde cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, desde cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, desde cerca de 1 mM a cerca de 15 mM. Em uma modalidade, a concentração de um ou mais nucleosídeos compreende cerca de 1 mM a cerca de 15 mM de adenosina e/ou uridina. Em outra modalidade, a quantidade de gamas de antioxidantes a partir de cerca de 0,01 mm a cerca de 15 mM. Em uma outra modalidade, o agente terapêutico contém cerca de 0,01 mm a cerca de 12,5 mM.

O agente terapêutico pode ainda conter um ou mais aminoácidos que exibem propriedades citoprotetoras. Em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico adicional, pelo menos, contém um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em leucina, valina e alanina. Em uma outra modalidade, o aminoácido é a leucina. Em uma outra modalidade, o aminoácido é glicina.

Em uma modalidade, o agente terapêutico compreende adenosina, uridina, leucina, adenina, e manganês. Em uma modalidade alternativa, o agente terapêutico compreende cerca de 1 mM a cerca de 15 mM de adenosina e cerca de 1 mM a cerca de 12,5 mM MnCI2. Em uma outra modalidade, o agente terapêutico compreende um extrato de D. radiodurans, contendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes.

Ainda em outra modalidade da invenção, o agente terapêutico é uma composição adequada para uso humano, compreendendo um ou mais dos nucleosídeos (tais como, por exemplo, adenosina, uridina, β-pseudouridína, inosina, e misturas destes), um ou mais antioxidantes (como, por exemplo, manganês, peptídeos e vitamina E) e, opcionalmente, um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em leucina, valina e alanina. Em uma modalidade, a composição adequada para utilização humana inclui a adenosina e manganês.

Em uma modalidade alternativa da invenção, o agente terapêutico é um extrato de D. radiodurans, contendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes.

Os métodos para tratar ou prevenir os efeitos da exposição à radiação compreendem a administração de um agente terapêutico compreendendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes para um sujeito em necessidade do mesmo.

Uma modalidade é um método de prevenção de um efeito colateral da radioterapia, compreendendo a administração de um extrato de D. radiodurans compreendendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes para um sujeito em necessidade do mesmo.

Uma outra modalidade da invenção é um método de prevenção de um efeito secundário da administração de radioterapia compreendendo uma composição compreendendo um ou mais nucleosídeos, um antioxidante e, opcionalmente, um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, valina e leucina a um sujeito que dele necessite. De preferência, um ou mais dos nucleosídeos é adenosina e/ou uridina, que pode estar presente em quantidades de cerca de 1 mM a cerca de 15 mM de adenosina e/ou uridina. Um ou mais nucleosídeos podem também ser selecionados a partir do grupo que consiste em adenosina, uridina, β-pseudouridina, inosina, e suas misturas. O antioxidante pode ser manganês (por exemplo, de cerca de 1 mM a cerca de 12,5 mM). Em uma modalidade, o antioxidante é MnCI2 . Em uma outra modalidade, o antioxidante é um ou mais peptídeos. Em uma outra modalidade, a composição compreende adenosina, uridina, leucina, adenina e manganês.

Os métodos do presente pedido de patente são particularmente vantajosos. Comparado aos radioprotetores bem estabelecidas (tal como, por exemplo, amifostina), composições compreendendo um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes (por exemplo, adenosina, uridina, peptídeos e Mn), são relativamente não tóxicos.

Os métodos da presente invenção são particularmente adequados para tratamentos pré-e pós-exposição de pessoal militar ou civis acidentalmente ou deliberadamente expostos à radiação ionizante.

Os métodos podem também ser usados profilaticamente para indivíduos expostos a níveis significativos de radiação crônica, como em usinas nucleares, durante a longa duração do voo espacial, ou na estação espacial internacional.

A “quantidade segura e eficaz” refere-se a uma quantidade de um componente que é suficiente para obter uma resposta terapêutica desejada sem efeitos colaterais adversos indevidos (tais como toxicidade, irritação ou resposta alérgica) proporcionais a uma razão benefício / risco razoável quando usado na forma da presente invenção. Por “quantidade terapeuticamente eficaz” entende-se uma quantidade de um componente eficaz para se obter uma resposta terapêutica desejada, por exemplo, em uma quantidade eficaz para retardar a taxa de divisão celular bacteriana, ou para causar a cessação da divisão celular bacteriana, ou para causar a morte ou a diminuição da taxa de crescimento da população das bactérias.
A quantidade segura e eficaz específica ou a quantidade terapeuticamente eficaz irá variar de acordo com fatores, tais como a condição particular a ser tratada, a condição física do sujeito, o tipo de indivíduo a ser tratada, a duração do tratamento, a natureza da terapia concorrente (se existir), e as formulações específicas empregadas, da estrutura dos compostos ou seus derivados.

Os meios de aplicação incluem, mas não estão limitados a direto, indireto, veículos e meios especiais, ou qualquer combinação de meios. Aplicação direta do fago pode ser por sprays nasais, gotas nasais, pomadas nasais, lavagens nasais, injeções nasais, adesivos nasais, sprays bronquiais e inaladores, ou indiretamente através do uso de pastilhas para a garganta, ou através do uso de antissépticos bucais ou gargarejos, ou através do uso de pomadas aplicadas nas narinas nasais, a ponte do nariz ou da face, ou qualquer combinação destes métodos e outras de aplicação. As formas em que os fagos podem ser administrados incluem, mas não se limitam a pastilhas, pílulas, balas, injetantes, gomas de mascar, comprimidos, pós, sprays, líquidos, pomadas, e aerossóis.

O agente terapêutico pode também ser colocado em um spray nasal, em que o pulverizador nasal é o veículo. O spray nasal pode ser uma ação prolongada ou de liberação temporizada de pulverização, e podem ser fabricados através de meios bem conhecidos no estado da técnica. Um inalante pode também ser utilizado, de modo a que o agente terapêutico possa ainda atingir abaixo do trato brônquico, incluindo os pulmões.

O agente terapêutico pode ser adicionado a estas substâncias em uma forma líquida ou num estado liofilizado, após o que será solubilizado quando encontra os fluidos corporais, tais como saliva. A enzima pode também ser de uma micela ou lipossoma.

Embora estes métodos possam ser utilizados em qualquer das espécies de mamíferos, tais como animais de fazenda, incluindo, mas não limitado a, cavalos, ovelhas, porcos, galinhas e vacas, a utilização preferida das composições é para um ser humano.

As taxas de dosagem ou quantidade eficaz das composições irão depender, em parte, do fato de a composição ser utilizada terapeuticamente ou profilaticamente, a duração da exposição do receptor à radiação, o tipo de radiação, o tamanho, peso do indivíduo, etc. A duração para o uso da composição também depende de se a utilização é para fins profiláticos, em que a sua utilização pode ser por hora, diariamente ou semanalmente, por um curto período de tempo, ou se a sua utilização irá ser para fins terapêuticos, em que um regime mais intenso da utilização da composição pode ser necessária, por exemplo o uso que pode durar horas, dias ou semanas, e/ou em uma base diária, ou em intervalos de tempo durante o dia. Qualquer forma de dosagem utilizada deve prever um número mínimo de unidades para uma quantidade mínima de tempo. A concentração das unidades ativas de fago acreditado para proporcionar uma quantidade eficaz ou dosagem de fago pode estar no intervalo de cerca de 100 unidades / ml a cerca de 100.000 unidades / ml de fluido no ambiente úmido ou molhado e de passagens nasais orais e, possivelmente, no intervalo de cerca de 100 unidades / ml a cerca de 10.000 unidades / ml. Mais especificamente, o tempo de exposição à radiação pode influenciar a concentração desejada de unidades ativas da composição radioprotetora por ml. Deve notar-se que os veículos que são classificados como “longa” ou “veículos de liberação lenta” (tais como, por exemplo, certos sprays nasais ou pastilhas) podem possuir ou fornecer uma concentração mais baixa da composição por mililitro, mas ao longo de um período mais longo de tempo, ao passo que um veículo de liberação “curta” ou “rápida" (tal como, por exemplo, um gargarejo) pode possuir ou proporcionar uma elevada concentração de composição por ml, mas durante um curto período de tempo. Além disso, será apreciado que uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição, em particular, pode ser determinada por aqueles técnicos versados no assunto tendo em devida consideração os fatores pertinentes sujeito.

Seleção da dose eficaz preferida pode ser determinada (por exemplo, através de ensaios clínicos), por um técnico versado no assunto com base na consideração de vários fatores, que serão conhecidos dos técnicos versados no assunto. Tais fatores incluem a doença a ser tratada ou evitada, dos sintomas envolvidos, a massa corporal do paciente, o estado imunitário do doente e outros fatores conhecidos por um especialista na matéria de modo a refletir a exatidão das composições farmacêuticas administradas.

A dose exata a ser utilizada na formulação dependerá também da via de administração e deve ser decidida de acordo com a opinião do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas in vitro ou animal de teste do modelo.

Para o tratamento profilático e terapêutico e/ou prevenção dos efeitos da exposição à radiação, as composições compreendendo os nucleosídeos e antioxidantes podem também ser aplicadas diretamente, indireta, veículos e meios especiais ou qualquer combinação de meios. Aplicação direta do fago pode ser por sprays nasais, gotas nasais, pomadas nasais, lavagens nasais, injeções nasais, adesivos nasais, sprays bronquias e inaladores, ou indiretamente através do uso de pastilhas para a garganta, ou através do uso de antissépticos bucais ou gargarejos, ou através do uso de pomadas aplicadas as narinas nasais, a ponte do nariz ou da face, ou qualquer combinação destes métodos e outras de aplicação. As formas em que os fagos podem ser administrados incluem, mas não se limitam a pastilhas, pílulas, balas, injetantes, gomas de mascar, comprimidos, pós, sprays, líquidos, pomadas, e aerossóis. Para o tratamento terapêutico de antraz, os sprays e aerossóis brônquios são os mais benéficos, como esses veículos, ou dos meios de distribuição da composição, permitem que o fago atinja os brônquios e os pulmões.

As composições da presente invenção podem ser administradas por via parentérica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica ou bucal. Por exemplo, um agente pode ser administrado localmente a um local da lesão, através de microinfusão. Alternativamente, ou concorrentemente, a administração pode ser por via oral. A dosagem administrada será dependente da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento simultâneo, se houver, frequência do tratamento, e da natureza do efeito desejado.

Em uma modalidade da invenção, o método compreende a administração do agente terapêutico num veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados e suas formulações estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 2005, Mack Publishing Co. Tipicamente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é utilizada na formulação para tornar a formulação isotônica. Os exemplos de veículo farmaceuticamente aceitável incluem líquidos, tais como solução salina, solução de Ringer, e solução de dextrose. O pH da solução é, de preferência, de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferivelmente, de cerca de 7 a cerca de 7,5. A formulação pode também compreender um pó liofilizado. Outros veículos incluem preparações de liberação controlada, como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos, em que as matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, lipossomas ou micropartículas. Será evidente para um técnico versado no assunto que certos veículos podem ser mais preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração de inibidor de citocina pró-inflamatória sendo administrada.

Os métodos otimamente fornecem terapêutica contra diversas formas relacionadas redox de lesão celular mediada por danos de proteína, e facilitam a cicatrização de feridas.

Uma modalidade da invenção é um método de preparação de extratos de ultrafiltrado livres de células D. radiodurans que exibem propriedades de rádio-proteção. Em uma modalidade, os métodos compreendem a colheita D. radiodurans, por exemplo, centrifugação, lise da cultura D. radiodurans para criar um lisado, lavar o lisado de D. radiodurans seguido por centrifugação do ligado durante um tempo e sob condições suficientes para criar um sobrenadante . Após a centrifugação, o sobrenadante é passado através de um microfiltro, de preferência, um microfiltro 3 quilodaltons, e fervido durante um período de uma quantidade adequada de tempo. Em uma modalidade, o sobrenadante é fervido durante cerca de 15 a cerca de 45 minutos após a filtração. O extrato resultante D. radiodurans contém um ou mais nucleosídeos e um ou mais antioxidantes, é solúvel em butanol, resistente à fervura, e livre de células.

Em uma modalidade, o extrato contém adenosina e manganês. Em outra modalidade, o extrato contém manganês, adenosina e/ou uridina. Os extratos de células podem também conter adicionalmente leucina, alanina e/ou valina. Em uma modalidade, o extrato de D. radiodurans contém, pelo menos, adenosina, uridina, leucina, adenina e manganês.

Sem descrição adicional, acredita-se que um técnico versado no assunto possa, utilizando a descrição precedente e os exemplos ilustrativos que se seguem, fazer e utilizar a presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Os seguintes exemplos de trabalho, portanto, apontam especificamente as modalidades preferidas da presente invenção, e não são para ser interpretados como limitando de qualquer forma o restante da divulgação.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Preparação de extrato livre de proteína de D. radiodurans

D. radiodurans (ATTC BAA-816) foi cultivada para OD600 de 0,9 em TGY, colhida por centrifugação e lisada por tratamento de pressão francesa. As células foram lavada e em seguida lisadas em água desionizada estéril bidestilada, (dH20). Antes da lise, a densidade celular foi ajustada com dH20, para se obter os lisados representando cerca de 50% da concentração intracelular. Extratos celulares brutos foram centrifugadas durante 20 horas a 175.000 x g. O sobrenadante foi passado através de uma filtro de centrífuga Microcon 3 quilodalton (Millipore, EUA) e fervida durante 30 min. O ensaio de proteína Coomassie (Bradford) foi utilizada para confirmar a ausência virtual de proteínas em extratos ultrapurifiçado, os quais foram divididos em alíquotas e armazenado a -80° C.

Exemplo 2 - Análise do extrato livre de proteína de D. radiodurans

Os extratos celulares ultrafiltrados foram preparados a partir de D. radiodurans (ATCC BAA-816), P. putida (ATCC 47054), E. coli (MG1655), e T. thermophilus (ATCC BAA-163). M.E. Maguire fornecida de E. coli tipo selvagem (M M1925, cepa K12.) e sua mnfHmutant isogênica (MM2115). D. radiodurans recA-(rec30) e E. coli recA-(DHIOB) são conhecidos no estado da técnica. A linhagem de células T Jurkat foi ATCC TIB-152. Os ultrafiltrados DR-, PP, e EC e TT foram preparados a partir de bactérias cultivadas como culturas em batelada, em meio de TGY para a mesma densidade óptica a 600 nm (0,9; fase log). Para produção em larga escala de ultrafiltrado DR- utilizado em E. coli e estudos de radioproteção de células T Jurkat, o crescimento de células de alta densidade de D. radiodurans foi em um fermentador de 20 L. As células foram quebradas por passagem aberta através de uma French Press. Na seguinte ordem, lisados bacterianos foram centrifugados a 12.000 x g (1 h, 4°C), os sobrenadantes foram normalizados para a concentração de uma proteína de base e ultracentrifugado 190.000 x g (48h, 4°C), e sobrenadantes ultracentrifugados foram submetidos a filtração através de filtros de 3 kDa. Os ultrafiltrados foram fervidos durante 40 min, concentrado 5 vezes, e armazenadas a -80° C. A composição química de ultrafiltrados do DR-, PP, e CE e TT foram determinados da seguinte maneira: Mn e Fe em um modelo de espectrômetro de absorção atômica Perkin Elmer 4100ZL; fosfato inorgânico através do ensaio de verde de malaquite, bases, nucleosídeos e nucleotídeos por HPLC; atividade de protease com azocaseína como substrato, e aminoácidos por pré-coluna de derivação, tal como aplicadas pela Agilent Technologies.

Exemplo 3 - Efeitos radioprotetores em E. Coli

Individualmente e em combinação, as propriedades de radioproteção de Mn2+, fosfato de uridina e DMSO foram determinados utilizando E. coli cultivadas num meio TGY; TGY é um peptídeo rico em meio à base de extrato de levedura, e contém cerca de 200 nM de Mn. A 3 kGy, a suplementação de TGY com 1 μΜ de Mn2+ não aumentou a resistência de E. coli; suplementação de TGY com 13 mM de fosfato aumentou a resistência de E. coli por 800 vezes, e a suplementação de TGY quer com uridina 3 mM ou 384 mM (3%) DMSO aumentou a resistência de E. coli em 50 vezes. Quando estes agentes foram combinados com concentrações aplicadas individualmente, a sobrevivência de E. coli exposta a 3 kGy foi aumentada em 10.000 vezes.

Exemplo 4 - Complexo peptídeo Mn2+ reconstituído:

O complexo fosfato-decapeptídeo-Mn2+ extremamente radioprotetor com base em uma sequência consenso de aminoácido (H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH) (SEQ ID NO: I) de centenas de peptídeos purificados a partir de D. radiodurans. A composição da mistura, a qual espontaneamente forma o complexo Mn2+ compreende 3 mM (H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH) (SEQ ID NO: I), 1 mM de MnCI2, 25 mM de tampão de ortofosfato (Pi) (pH 7,4). Quando reconstituído in vitro, o complexo Mn2+ preservou a atividade das enzimas expostas a 50.000 Gy. Os estudos com os decapeptídeos demonstraram que é a composição de aminoácidos do decapeptídeo, não a sequência específica de aminoácidos, que é crítica para as suas propriedades de radioproteção quando combinado com Mn2+ e tampão ortofosfato. Os peptídeos não necessitam de ser limitados a 10 aminoácidos, mas em vez disso podem ser compostos pelos aminoácidos específicos presentes no decapeptídeo acima.

Exemplo 5 - Aplicação do complexo Mn2+ de D. radiodurans reconstituído para a produção de vacinas irradiadas.

Bactérias de irradiação utilizando os métodos aqui descritos foram testadas e validadas em 40.000 Gy utilizando o modelo do vírus bacteriófago Lambda (Figura 5). O DNA foi preparado a partir de bacteriófago λ irradiado tratado ou não com o complexo Mn2+ (Mn-pep-Pi): 3 mM (H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH) (SEQ ID NO : 1), 1 mM de MnCI2 , 25 mM de tampão ortofosfato (Pi) (pH 7,4). Nas doses de raios-gama indicadas (0-40 kGy), DNA (48,5 kpb de genoma) foi purificado a partir do bacteriófago λ, submetido a eletroforese em gel de agarose convencional, e em seguida, transferência de Southern com uma sonda λ DNA radiomarcada. Como mostrado na Figura 5A, o complexo de Mn2+ não significativamente protege o DNA empacotado no vírus.

As preparações do mesmo bacteriófago λ examinado como na Figura 5A foram testados quanto à integridade da proteína, separando as proteínas do vírus, utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida. Como mostrado na Figura 5B, às proteínas de vírus que foram irradiadas na ausência do complexo de Mn2+ foram progressivamente destruídas. Em contraste, as proteínas nas amostras que continham o vírus do complexo de Mn2+ não foram afetados por doses tão elevadas quanto 40 kGy.

Em 40.000 Gy, uma dose que obliterou o DNA do vírus (ver Figura 5A) e tornado completamente o vírus não infeccioso, as proteínas do vírus permaneceram completamente imunogênicas. Isto foi testado por análise de Western, em que as proteínas λ foram desafiadas com anticorpos criados em coelhos contra fago λ não irradiado. Um resultado positivo para a imunogenicidade semelhante foi obtido para Westerns equivalentes sondadas com anticorpos criados contra o fago λ expostos a 40.000 Gy na presença do complexo de Mn2+. Em contraste, o fago λ exposto a 40.000 Gy na ausência do complexo Mn2+ não produziu anticorpos em coelhos que tinham especificidade significativa para bacteriófago λ nativo.

A abordagem foi também testada com sucesso em uma cepa de Staphylococcus aureus patogênica (Figura 6). Em contraste, os vírus e as bactérias expostas a doses supraletais de IR sem o complexo Mn2+ resultaram em uma perda substancial de integridade do epítopo virai e perda de imunogenicidade.

Embora a invenção tenha sido descrita e ilustrada aqui por referências a vários materiais, procedimentos específicos e exemplos, entende-se que a invenção não está limitada às combinações particulares de materiais e procedimentos selecionados para esse fim. Numerosas variações de tais detalhes podem estar implicadas como será apreciado pelos técnicos versados no assunto. Pretende-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas como exemplos, com o verdadeiro escopo e espírito da invenção indicado pelas reivindicações que se seguem. Todas as referências, patentes e pedidos de patente mencionados no presente pedido são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Claims (21)

1. Método de produção de uma vacina direcionada contra um microorganismo ou vírus, caracterizado pelo fato de que, compreende

   • (a) cultivar, colher e/ou suspender o microrganismo na presença de uma composição protetora de radiação, a composição compreendendo manganês divalente, ortofosfato e pelo menos um peptídeo de 25 aminoácidos ou menos, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:I,
   • (b) irradiar o microrganismo com uma dose de radiação suficiente para tornar o microrganismo deficiente na replicação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a radiação é selecionada do grupo que consiste em luz UV, radiação alfa, radiação beta, radiação gama, radiação de raiosX e radiação de nêutrons.
3. Método, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda pelo menos um nucleosídeo selecionado do grupo que consiste em adenosina, uridina, -pseudouridina, inosina e suas misturas.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleosídeo é adenosina e uridina.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração de pelo menos um nucleosídeo é de cerca de 1mM a cerca de 15mM.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um antioxidante é de cerca de 1 mM a cerca de 12,5 mM de manganês.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos um antioxidante é selecionado do grupo consistindo em MnCb e fosfato manganoso.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda pelo menos um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, valina e leucina.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um ultrafiltrado de D. radiodurans.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a dose de radiação é de pelo menos cerca de 20 kGy.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é uma bactéria.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a vacina é diretamente contra um virus.
13. Método de tornar bactérias em cultura resistentes à radiação ionizante (IR), o método caracterizado pelo fato de que compreende cultivar bactérias na presença de uma composição protetora de radiação, a composição compreendendo pelo menos um nucleosldeo, manganês divalente e ortofosfato, fosfato, dimetil sulfóxido (DMSO) e pelo menos um peptídeo de 25 aminoácidos ou menos, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: I.
14. Método, e acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleosídeo é selecionado do grupo consistindo em adenosina, uridina, β-pseudouridina, inosina, e suas misturas.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleosfdeo é adenosina e uridina.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a concentração de pelo menos um nucleosídeo é de cerca de 1 mM a cerca de 15 mM.
17. Método, de acordo com qualque uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um antioxidante é de cerca de 1 mM a cerca de 12,5 mM de manganês.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um antioxidante é selecionado do grupo consistindo em MnCb e fosfato manganoso.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda pelo menos um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, valina e leucina.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um ultrafiltrado de D. radiodurans.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado pelo fato de que as bactérias são E. coli.

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