CN102946888B - 含有嘌呤和嘧啶核苷、肽和锰的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了生产针对微生物的疫苗的方法，所述方法包括在防辐射组合物存在下培养、收获和/或悬浮所述微生物并且用足以致使所述微生物为复制缺陷型和/或非感染性的辐射剂量照射所述细菌或病毒。本发明的方法中使用的防辐射组合物包含至少一种核苷、至少一种抗氧化剂和至少一种小肽。本发明还提供了致使培养中的细菌耐电离辐射(IR)的方法，这些方法包括在防辐射组合物存在下培养所述细菌。

Description

含有嘌呤和嘧啶核苷、肽和锰的组合物及其用途
相关申请
本申请要求整体并入本文的2010年4月29日提交的美国临时申请61/329,381的优先权。
政府支持
本发明部分从由美国能源部、科学局、生物和环境修复研究办公室(BER)、环境修复科学项目资助DE-FG02-04ER63918和由空军科学研究办公室资助FA9559-07-1-0128的研究中产生。政府具有本发明的某些权利。
发明背景
技术领域
本发明提供了生产针对微生物的疫苗的方法，所述方法包括在防辐射组合物存在下培养、收获和/或悬浮所述微生物并且用足以致使所述微生物复制缺陷的辐射剂量照射所述微生物。本发明的方法中使用的防辐射组合物包含至少一种在磷酸锰或重碳酸锰缓冲液的混合物中的十肽。本发明还提供了致使培养中的细菌耐电离辐射(IR)的方法，这些方法包括在防辐射组合物存在下培养所述细菌。
发明背景
极耐辐射的异常球菌科(Deinococcaceae)由20多种在急性暴露于电离辐射(IR)(10kGy)、紫外光(UV)(1kJ/m2)和干燥(年)时可存活的不同物种构成；并且可在慢性IR(60Gy/h)下生长。尤其，耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)是极耐电离辐射(IR)的细菌，在暴露于超过对哺乳动物细胞有毒性且致死的剂量一千倍的γ辐射时可存活。
对于极高耐受性的细菌而言，例如耐辐射奇球菌，已将高剂量IR之后的存活归因于照射期间防止蛋白质氧化，结果是酶修复系统存活并且在恢复期间以比敏感菌高得多的效率作用，其中细胞蛋白质非常易受羰基化影响。在Science杂志中公开的报道中(Daly等(2004),Accumulation of Mn(II)in Deinococcus radiodurans facilitates gamma-radiation resistance,Science 306:925-1084)，细胞内的锰(II)牵涉通过在暴露于电离辐射期间保护蛋白质(而非DNA)促进耐辐射性；并且在PLoS Biology中公开的第二个报道中(Daly等(2007)Protein oxidation implicated as the primary determinant ofbacterial radioresistance,PLoS Biology 5(4)e92)，耐辐射性与照射期间由非酶机制介导的蛋白质保护呈正相关。
与耐辐射奇球菌不同，大部分蛋白质不耐辐射。相似地，无论是真核生物、原核生物或哺乳动物(例如人)体内的大部分细胞也不耐辐射。同样地，暴露于辐射对蛋白质结构和/或功能十分有破坏性。例如，已经证实在许多不同物种的动物和在人体的几乎所有部位中电离辐射诱导(引起)癌症。
在人类中，明显过度暴露于辐射可导致辐射中毒，也称为“辐射病”或“爬行剂量(creeping dose)”。术语通常用于指由大剂量在短期内引起的急性问题，尽管这也已经在长期暴露于低水平辐射时发生。“辐射病”的临床名称为如CDC描述的急性辐射综合征。慢性辐射综合征确实存在但非常罕见；这已经在早期镭源生产基地和早期苏联核项目中的工人中观察到。短时间暴露可导致急性辐射综合征；慢性辐射综合征需要长时期的高水平暴露。
人类在日常生活中经常遇到辐射，包括来自电子设备和手机的辐射以及自然环境辐射。靠近放射性元素的个体，例如核电厂的职工或军队成员尤其可能遇到高剂量的辐射。另外，辐射用于诊断试验例如X射线和放射疗法中，以治疗癌症。
目前适合治疗人类的辐射防护剂很少，并且存在的辐射防护剂(例如，氨磷汀)有细胞毒性并且有严重副作用(例如，丧失意识、呼吸急促或不规则、瘙痒、恶心和呕吐)。
考虑到对辐射的大量暴露，对无毒、保护蛋白质功能，并且尤其适合人类使用的辐射防护剂有很大需要。
发明概要
本发明提供了生产针对微生物的疫苗的方法，所述方法包括在防辐射组合物存在下培养、收获和/或悬浮所述微生物并且用足以致使所述微生物复制缺陷的辐射剂量照射所述微生物。本发明的方法中使用的防辐射组合物包含至少一种于含锰缓冲液中的十肽。
本发明还提供了致使培养中的细菌耐电离辐射(IR)的方法，这些方法包括在防辐射组合物存在下培养所述细菌。本发明的耐IR方法中使用的防辐射组合物包含至少一种核苷、磷酸盐、至少一种抗氧化剂和二甲基亚砜(DMSO)。
附图简述
图1示出了耐辐射奇球菌超滤液中保护蛋白质的化合物，但来自恶臭假单胞菌(Pseudonomas putida)(PP)、大肠杆菌(Escherichia coli)(EC)和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(TT)不保护蛋白质。无蛋白质的超滤耐辐射奇球菌(DR)细胞提取物防止电离辐射(IR)诱导的体外蛋白质氧化，但是来自辐射敏感菌恶臭假单胞菌(PP)、大肠杆菌(EC)和嗜热栖热菌(TT)的提取物不防止电离辐射(IR)诱导的体外蛋白质氧化。照射期间，在PP-、EC-、TT-或DR-超滤提取物中培育纯化的大肠杆菌蛋白质，并进行蛋白质羰基测定。考马斯亮蓝染色的变性聚丙烯酰胺凝胶；羰基蛋白质印迹显示蛋白质氧化和保护(未显示)。
图2描绘了耐辐射奇球菌(DR)超滤液的组合物，与来自恶臭假单胞菌(PP)、大肠杆菌(EC)和嗜热栖热菌(TT)的超滤液作比较。
图3描绘了暴露于急性IR并且在各种补充物存在下生长的大肠杆菌的存活曲线：TGY、标准富肽生长培养基、DMSO、二甲基亚砜；UMnP、3mM尿苷/1μΜMn2+/13mM PiB(磷酸盐缓冲液)。
图4描绘了肽在电离辐射耐受性中的作用。(A)耐辐射奇球菌中的细胞溶质分布和氨基酸浓度：“No-IR”，未照射对照细胞保存在冰上pH 7.4的25mM磷酸钾缓冲液中，然后洗涤并保存在pH 7.4(32℃)的25mM磷酸盐缓冲液中0或30min。“+IR”，在冰上pH 7.4的25mM磷酸盐缓冲液中照射7kGy，然后洗涤并保存在pH 7.4(32℃)的25mM磷酸盐缓冲液中0或30min。收获细胞，再悬浮于20％TCA并溶解。分析中和上清液的等分试样的游离氨基酸和肽源性氨基酸含量。(B)十肽(H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH；1261Da)对BamHI的辐射防护。(C)于pH 7.4的磷酸钾缓冲液(PiB)或pH 7.4的碳酸氢钠缓冲液(HCO3)中的Mn2+和亮氨酸(Leu)、尿苷(U)或十肽(DP)对谷氨酰胺合成酶(GS)的辐射防护。
图5描绘了用锰复合物制备经照射疫苗的方法。(A)由经Mn2+复合物(Mn-pep-Pi)：3mM(H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH)(SEQ ID NO:1)、1mM MnCl2、25mM正磷酸盐(Pi)缓冲液(pH 7.4)处理(右)或未处理(左)的经照射噬菌体λ制备DNA。在指定γ射线剂量(0-40kGy)下，从噬菌体λ中纯化DNA(48.5kbp基因组)，进行传统琼脂糖凝胶电泳，然后用放射性标记的λDNA探针进行DNA印迹。结论：Mn2+复合物未显著保护包裹在病毒中的DNA。(B)通过使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离病毒蛋白测试如图A中检查的相同噬菌体λ制剂的蛋白质完整性。结论：在Mn2+复合物缺少时经照射的病毒中的蛋白质(左)逐渐被破坏。相反，含有Mn2+复合物的病毒样品中的蛋白质(右)未受高达40kGy的剂量影响。(C)在除去病毒DNA(图A)并致使病毒完全非感染性(未示出)的剂量40,000Gy下，病毒蛋白保持完全免疫原性。这通过蛋白质分析试验，从而λ蛋白受兔子体内出现的抗非照射λ噬菌体的抗体激发。注意，对于用出现的在Mn2+复合物存在下暴露于40,000Gy的λ噬菌体的抗体探测的等量蛋白质而言，获得同样积极的免疫原性结果。相反，在没有Mn2+复合物时暴露于40,000Gy的λ噬菌体并未在兔子体内产生对首次接受试验的噬菌体λ有显著特异性的抗体。(D)和(E)：用Mn2+复合物照射前处理(E)或未处理(D)的λ噬菌体的透射电子显微图(TEM)。(F)和(G)：用Mn2+复合物照射后处理(G)或未处理(F)的λ噬菌体的TEM。在Mn2+复合物存在下，暴露于40kGy的λ噬菌体病毒颗粒未受损。
图6描绘了来自用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)试验的小鼠的表格和图形数据。这些数据显示，照射组合物中锰复合物的存在赋予处理小鼠更强的免疫反应。
发明详述
本发明研究了耐辐射奇球菌的耐辐射性并制备了表现出防辐射性的超纯无蛋白细胞提取物。因此，本发明部分基于发现耐辐射奇球菌无细胞提取物的防辐射组分和含有此类组分的人造组合物。
特别地，申请人已经证实耐辐射奇球菌超纯无蛋白细胞提取物对暴露于γ辐射的蛋白质极具防辐射性。腺苷、尿苷和肽在耐辐射奇球菌超滤液中积聚的浓度比在辐射敏感菌的超滤液中高。在体外，在剂量>10,000Gy时，证实核苷高度保护蛋白质，防止电离辐射(IR)诱导的羰基化并在Mn(II)的存在下保护功能酶。已经研发了腺苷、锰、肽和磷酸盐的防辐射组合物。令人惊讶的是，已经证实耐辐射奇球菌提取物是培养的人T细胞的有效辐射防护剂，效力比其它得到确认的防辐射化合物更高。
本发明提供了合成的或源自耐辐射奇球菌(DR)的防辐射组合物和使用这些组合物保护蛋白质和/或细胞免受辐射损伤的方法。这些组合物用于防止组合物以及诸如人的受试者或细胞培养物中的辐射损伤。本发明的组合物包含锰和至少一种抗氧化肽，或它们包含锰和一些个别氨基酸。在另外的实施方案中，组合物也可能包含至少一种核苷。如本文所使用，术语“防辐射组合物”或“防辐射的组合物”可指根据本文所述方法制备的DR超滤液提取物，或可指包含锰和至少一种抗氧化肽或一些个别氨基酸的合成组合物。若使用DR超滤液提取物，可为该提取物补充本文描述和公开的任一化合物。例如，可根据本文公开的方法制备DR超滤液，并且可向提取物中添加(例如)另外的Mn2+或肽。
防辐射组合物可进一步含有亮氨酸、丙氨酸和/或缬氨酸。在Mn(II)的存在下亮氨酸与清除过氧化氢密切相关，并且可能是包括尿苷和腺苷的较大胞内复合物的组分。有力的体外证据表明腺苷与锰和磷酸盐之间的协同效应。可最优化腺苷与锰和磷酸盐或重碳酸盐缓冲液的化学计量以进行细胞凋亡测定。
申请人已经证实单独的腺苷和单独的Mn(II)在体内对哺乳动物细胞系和细菌细胞培养物有防辐射性。
虽然不受任何特殊理论约束，但是据信包含嘌呤核苷(例如腺苷)、嘧啶核苷(例如，尿苷)和肽抗氧化剂(例如锰-肽)的组合物通过遮蔽蛋白质的活性位点和表面作为辐射防护剂。嘌呤核苷例如腺苷(并且任选与嘧啶核苷尿苷和肽组合)一旦在细胞内积聚就介导其防辐射作用，从而抑制辐射诱导的蛋白质氧化，并且在Mn(II)的存在下保护酶功能。认为腺苷保护蛋白质，并因此清除一亚组ROS。
此外，不受任何特殊理论约束，据信在需氧或厌氧照射条件下，照射期间可在细胞内产生过氧化物，因为过氧化物不易跨膜。虽然过氧化物不与DNA反应，但是过氧化物会损害并钝化暴露2Fe-2S或4Fe-4S簇的酶，释放出Fe(II)并且还损害某些暴露氨基酸，例如但不限于半胱氨酸。细胞内铁的问题是，当“未结合”而游离时，在过氧化氢存在下引起Fenton反应，生成羟基自由基。因此，释放结合Fe(II)的条件极其危险，不仅因为生成羟基自由基，而且因为Fe从Fe依赖性酶丢失导致酶起作用的生化途径故障。本申请的方法最佳防护这些危险条件。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含意。虽然与本文所述相似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实践或试验中，但是描述了优选方法和材料。
如本文所使用，“一个”或“一种”，除非另外明确指出，指至少一种。术语“约”，除非另外指出，指比术语所修饰的值大或小不超过10％的值。例如，术语“约5％(w/w)”指从4.5％(w/w)至5.5％(w/w)的范围。
本发明提供了保护蛋白质功能或蛋白质免疫原性的方法，所述方法包括使蛋白质与本发明的组合物接触。本发明的一个实施方案为当蛋白质暴露于极端辐射条件(例如γ辐射)时保护蛋白质功能的方法。在本发明的另一实施方案中，所述方法在干燥期间保护蛋白质功能。
保护蛋白质功能的方法在蛋白质暴露于高剂量的辐射，例如超过10kGy(例如，17.5kGy)的剂量时提供了辐射防护。
在另一实施方案中，本发明提供了保护细胞培养物或病毒制剂中的蛋白质功能或蛋白质免疫原性的方法，所述方法包括用本文所述的任一防辐射组合物培养、收获和/或悬浮细胞。病毒制剂可用于单链或双链的DNA或RNA基因组。细胞培养物可为原核或真核细胞培养物。在一个实施方案中，细胞培养物为细菌。在另一实施方案中细胞培养物为哺乳动物。又一实施方案中，细胞培养物是为了繁殖病毒的培养物。
若存在，任何核苷均可用于防辐射的组合物中。适合的核苷包括但不限于腺苷、尿苷、β-假尿苷、肌苷及其混合物。另外，也可使用含有2个被1个(N3)H基团隔开的羰基氧基团(C＝O)的核苷类似物。在一个实施方案中，核苷为腺苷或尿苷。在一个实施方案中，组合物含有腺苷。在本发明的其它实施方案中，组合物含有尿苷。组合物中核苷的量随其用途而改变。本领域的技术人员将能够确定适合的量。在本发明的一些实施方案中，核苷的量范围从约0.01mM至约15mM，从约0.1mM至约1mM，从约1mM至约10mM，从约1mM至约15mM。在一个实施方案中，一种或多种核苷的浓度包含约1mM至约15mM的腺苷和/或尿苷。
各种抗氧化剂也可使用或存在于组合物中。适合的抗氧化剂包括锰、维生素E和磷酸亚锰、Mn-肽、Mn-氨基酸(例如，亮氨酸)、Mn-TRIS、Mn-黑色素、Mn-咖啡因、Mn-核糖、Mn-海藻糖、Mn-吡啶二羧酸、Mn-磷酸盐和Mn-重碳酸盐。在本发明的一个实施方案中，抗氧化剂为锰。在另一实施方案中，抗氧化剂为MnCl2。又一实施方案中，抗氧化剂为维生素E和/或阿斯匹林。组合物中抗氧化剂的量随其用途而改变。本领域的技术人员将能够确定适合的量。在一个实施方案中，组合物含有约0.01mM至约15mM的抗氧化剂。在另一实施方案中，组合物含有约0.01mM至约12.5mM。
在本发明的一个实施方案中，一种抗氧化剂为可作为混合物提供的磷酸亚锰。在一个实施方案中，通过混合锰溶液和磷酸盐溶液产生混合物。组合物中抗氧化剂的量随其用途而改变。本领域的技术人员将能够确定适合的量。在一个实施方案中，组合物含有约0.01mM至约15mM的二价锰(Mn(II))离子。在一个更特定的实施方案中，组合物包含约0.01mM至约15mM于磷酸盐缓冲液中的二价锰(Mn(II))离子。在还更特定的实施方案中，组合物包含浓度为约1mM至约25mM的磷酸盐缓冲液。在一个特定实施方案中，混合物为1mM的Mn(II)溶液和25mM磷酸盐缓冲溶液(ph 7.4)。
组合物含有一种或多种表现出细胞保护性质的氨基酸。在本发明的一个实施方案中，组合物进一步含有至少一种或多种选自天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸。在另一实施方案中，氨基酸为亮氨酸。在一个替代性实施方案中，氨基酸为甘氨酸。在另一实施方案中，组合物至少包括亮氨酸和丙氨酸。在另一实施方案中，组合物不含脯氨酸。在又一实施方案中，按另外的氨基酸的存在测量，组合物含有10％或更少的脯氨酸。例如，在该实施方案中12个不同氨基酸的等量混合物将包含1个脯氨酸残基或更少。
作为备选方案，或除存在个别氨基酸外，组合物和使用这些组合物的方法可包含至少一种小肽，例如但不限于十肽。如本文所使用，“小肽”指长度不超过约25个残基的小直链氨基酸。在一个实施方案中，本发明的组合物或方法中使用的小肽长度为约25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸。肽的实际序列对于本发明的组合物和方法并不关键，因此任何随机肽链就足够。例如，在一个实施方案中，组合物和使用这些组合物的方法可包含至少一种小肽，其中所述小肽包含与SEQ IDNO:1：Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，小肽不含脯氨酸残基。在另一实施方案中，与其它氨基酸相比，肽含有少于10％的脯氨酸残基。例如，在该特定实施方案中，12-mer将含有一个脯氨酸残基或更少。
在另外更多实施方案中，每个小肽独立包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有100％同一性的小肽视为其变异体。
小肽的量会变化。本领域的技术人员将能够根据各种因素确定适合的量，例如受试者、辐射暴露的持续时间、辐射暴露的量等。在本发明的一些实施方案中，小肽的量范围从约0.01mM至约15mM，从约0.1mM至约1mM，从约1mM至约10mM，从约1mM至约15mM。在一个实施方案中，一种或多种小肽的浓度包含约1mM至约15mM的SEQ ID NO:1的肽或其变异体。在其它实施方案中，一种或多种小肽的浓度包含约15mM或更少，约14mM或更少，约13mM或更少，约12mM或更少，约11mM或更少，约10mM或更少，约9mM或更少，约8mM或更少，约7mM或更少，约6mM或更少，约5mM或更少，约4mM或更少，约3mM或更少，约2mM或更少，约1mM或更少或约0.5mM或更少的SEQ ID NO:1的肽。当然，一种或多种小肽的浓度可在所列任何浓度之间，例如约15mM和约14mM之间，约14mM和约13mM之间，约13mM和约12mM之间，约12mM和约11mM之间，约11mM和约10mM之间，约10mM和约9mM之间，约9mM和约8mM之间，约8mM和约7mM之间，约7mM和约6mM之间，约6mM和约5mM之间，约5mM和约4mM之间，约5mM和约3mM之间，约3mM和约2mM之间，约2mM和约1mM之间，约1mM和约0.5mM之间等的SEQ ID NO:1的肽或其变异体。
将具有与参考氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1)具有至少(例如)约95％“同一性(identical)”的氨基酸序列的多肽理解为指多肽的氨基酸序列与参考序列具有同一性，除参考氨基酸的每100个氨基酸中，氨基酸序列可能包括多达约5个修饰外。换言之，为获得具有与参考氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽，可除去或用另一氨基酸取代参考序列的多达约10％的氨基酸残基或向参考序列中插入占参考序列总氨基酸多达约10％的若干氨基酸。参考序列的这些修饰可在参考氨基酸序列的N端或C端位置出现或那些末端位置之间的任何地方，单独散布于参考序列中的氨基酸之间或参考序列中的一个或多个连续基团中。
如本文所使用，“同一性(identity)”是对核苷酸序列或氨基酸序列与参考核苷酸或氨基酸相比的同一性的量度标准。一般而言，比对序列以便获得最高位匹配。“同一性”本身具有领域公认的含意并且可使用公开技术计算(见，例如，Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.编，Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics And Genome Projects,Smith,D.W.编，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第1部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编，Humana Press,New Jersey(1994)；von Heinje,G.，Sequence Analysis In MolecularBiology,Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer，Gribskov,M.和Devereux,J.编，M Stockton Press,New York(1991))。虽然有几种测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性的方法，但是术语“同一性”为技术人员众所周知(Carillo,H.&Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988))。通常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop编，AcademicPress,San Diego(1994)和Carillo,H.&Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988)中公开的方法。计算机程序也含有计算同一性和相似性的方法和算法。确定两个序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法的实例包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等，Nucleic Acids Research 12(i):387(1984))、BLASTP、ExPASy、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等，J Molec Biol215:403(1990))和FASTDB。通过引用并入的Michaels,G.和Garian,R.，Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley&Sons,Inc.(2000)中讨论了确定同一性和相似性的方法的实例。
在本发明的一个实施方案中，用于确定两个或更多个多肽之间的同一性的算法为BLASTP。在本发明的另一实施方案中，用于确定两个或更多个多肽之间的同一性的算法为FASTDB，其基于Brutlag等(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)，通过引用并入)的算法。在FASTDB序列比对中，查询和参考序列为氨基酸序列。序列比对的结果为同一性百分比。可用于氨基酸序列的FASTDB比对以计算同一性百分比的参数包括但不限于：矩阵＝PAM，k-元组＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化基团长度＝0，划界分＝1，空位罚分＝5，空位大小罚分0.05，窗口大小＝500或受试氨基酸序列的长度(取较短值)。
如果因为N端或C端添加或缺失，但并不是因为内部添加或缺失，参考序列比查询序列短或长，可进行人工校正，因为FASTDB程序在计算同一性百分比时并不说明参考序列的N端和C端切断或添加。对于在N或C端切断的查询序列而言，相对于参考序列，可通过计算查询序列在参考序列的N和C端的未匹配/对准的残基数量将同一性百分比校正为查询序列总碱基的百分比。FASTDB序列比对的结果确定匹配/比对。然后从同一性百分比中减去比对百分比，通过以上FASTDB程序使用指定参数计算，以得出最终同一性百分比分数。该校正分数可用于确定比对如何相互对应，以及同一性百分比。延伸超过查询序列的N或C端的参考序列残基可视为用于人工调节同一性百分比分数。即，当人工调节同一性百分比分数或比对编号时可计数与比较序列的N或C端未匹配/比对的残基。
例如，将90个氨基酸残基的查询序列与100个残基的参考序列比对以确定同一性百分比。缺失在查询序列的N端出现，因此FASTDB比对并不显示N端前10个残基的匹配/比对。10个未配对残基占参考序列的10％(N和C端未匹配残基的数量/参考序列中残基的总数量)，所以从通过FASTDB程序计算的同一性百分比分数中减去10％。如果剩余90个残基完全匹配(100％比对)，则最终同一性百分比为90％(100％比对-10％未匹配突出)。在另一实例中，将90个残基的查询序列与100参考序列进行比较，除缺失为内部缺失外。在这种情况下因为在受试序列的N或C端没有残基与查询序列匹配/比对，所以不人工校正通过FASTDB计算的同一性百分比。在又一实例中，将110个氨基酸的查询序列与100个残基的参考序列进行比对以确定同一性百分比。查询序列中的添加在查询序列的N端出现，因此FASTDB比对不可能显示N端前10个残基的匹配/比对。如果查询序列的剩余100个氨基酸残基与整个长度的参考序列具有95％同一性，则将忽视查询序列的N端添加并且查询序列与参考序列的同一性百分比将为95％。
在一个实施方案中，组合物包含腺苷、尿苷、亮氨酸、腺嘌呤和锰。在另一实施方案中，组合物包含约1至约15mM腺苷和1至约12.5mM MnCl2。在另一实施方案中，组合物包含含有一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的耐辐射奇球菌提取物。
可通过使用本发明的方法保护任何蛋白质功能。在本发明的一个优选实施方案中，蛋白质为酶。本公开的方法在防止紫外线和老化相关的蛋白质氧化中特别有用。此外，所述方法还保护干燥期间的蛋白质功能性并因此有助于延长干燥血液制品和干燥保存的基于酶的药物的保质期。
本发明的方法最佳保护暴露于辐射期间的蛋白质功能(例如，酶活性)。本发明的一个实施方案为保护方法，所述方法包括使蛋白质(例如，酶)与包含一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的组合物接触。
本发明的另一实施方案为延长微生物和酶驱动染料电池的耐久性和寿命，所述方法包括使燃料电池的组分与包含一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的组合物接触。
该方法可适于保护许多蛋白质的功能，包括但不限于具有Fe-S复合物的蛋白质(例如代谢酶)和依赖于氧化还原活性(4Fe-4S)簇的酶修复功能。示例性蛋白质包括与活性氧簇(ROS)的生成相关的蛋白质群体，可降低生物合成需求并抑制ROS生成的转运蛋白前体，防御ROS的蛋白质，参与受损分子(非DNA)的修复和氧化还原调节以及Mn和Fe依赖系统的蛋白质。Ghosal等(2005)，FEMS Microbiology Reviews 29:361-375中列出了其它示例性蛋白质，其内容整体并入本文。
本发明还提供了生产针对微生物的疫苗的方法，所述方法包括在本发明的防辐射组合物存在下培养、收获和/或悬浮所述微生物并且用足以致使所述微生物复制缺陷的辐射剂量照射所述细菌。在一个实施方案中，防辐射组合物是合成的；在另一实施方案中，防辐射组合物为DR超滤液提取物。
疫苗制备方法在本领域中众所周知。本文提供的方法可应用于这些众所周知的疫苗制备方法中，或它们可与传统疫苗制备方法分开单独使用。例如，本发明的一个实施方案提供了无需基因工程化制备疫苗所抵抗的微生物的疫苗制备方法。本文公开的方法允许在防辐射组合物存在下培养、收获和/或悬浮正常、野生型微生物，以致在极端辐射剂量期间保护微生物体内蛋白质的三维结构和微生物上的细胞表面标志。将辐射剂量设计为除去微生物的基因组，以致微生物不能给复制。按剂量给予辐射后，可收集复制缺陷型细胞并且可使用一般疫苗制备技术进行疫苗制备。本发明的防护性组合物保护微生物的免疫原蛋白的至少一种成分，以致向动物施用包含经照射微生物的疫苗将产生免疫原性反应。因此，可使用常规细胞培养技术实践现有的疫苗制备方法。可使用本发明的方法制备疫苗的微生物包括细菌和病毒。细菌和病毒的标准细胞培养技术在本领域中众所周知。
当然，本发明的疫苗制备方法不限于特殊类型的辐射，只要所用类型和剂量能够致使微生物复制缺陷。辐射的实例包括但不限于紫外光、α辐射、β辐射、γ辐射、X射线辐射和中子辐射。在一个实施方案中，辐射剂量为至少约20kGy。对于细菌混合物而言辐射剂量可高于25,000Gy(25kGy)并且对于病毒混合物而言辐射剂量可高于40,000Gy(40kGy)。
本发明还提供了致使培养中的细菌耐电离辐射(IR)的方法，这些方法包括在防辐射组合物存在下培养所述细菌。本发明的耐IR方法中使用的防辐射组合物包含至少一种核苷、磷酸盐、至少一种抗氧化剂和任何非代谢性羟基自由基清除剂，例如但不限于二甲基亚砜(DMSO)。
本发明还提供了治疗或防止辐射暴露影响的方法。所述方法包括用包含一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的治疗剂治疗或防止辐射暴露影响。
在本发明的一个实施方案中，辐射暴露归因于紫外光暴露。在本发明的另一实施方案中，辐射暴露归因于电离辐射。在本发明的另一实施方案中，辐射暴露为慢性。
如本文所使用，术语“治疗剂”应涵盖包含一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的组合物以及含有其它药学上可接受的组分，例如药学上可接受的载体的制剂。
如本文所使用，术语“辐射暴露”应指暴露于一定剂量的任何辐射足以引起损伤的时间。辐射暴露包括但不限于暴露于紫外光、α辐射、β辐射、γ辐射、X射线辐射和中子辐射。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防放射疗法副作用的方法。如本文所使用，术语“放射疗法”应指使用某些类型的能量(例如，电离辐射)杀伤癌细胞和皮肤肿瘤。术语“放射疗法”包括所有类型的放射疗法，包括但不限于外部放射疗法(例如，术中放射疗法和预防性脑照射(PC))、内部放射疗法(例如，组织内放射疗法、腔内或管腔内放射疗法)、全身放射疗法、立体定向(或立体定位)放射手术、三维(3-D)适形放射疗法、调强放射疗法(IMRT)。此外，术语“放射疗法”还涵盖使用各种辐射源的放射疗法，包括但不限于X射线、γ射线、粒子束、质子束疗法和高能光子辐射。放射疗法用于治疗各种癌症，包括实体肿瘤(例如，脑癌、乳腺癌、宫颈癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脊柱癌、胃癌、子宫癌或软组织肉瘤)。放射疗法还用于治疗白血病和淋巴瘤(即，分别是造血细胞和淋巴系统的癌症)以及皮肤癌、宫颈癌和甲状腺癌。
如本文所使用，术语“放射疗法的副作用”应指接受放射疗法的受试者所经历的任何副作用。此类副作用包括但不限于疲劳和皮肤反应、贫血、擦伤或出血风险升高、生育力下降、口干、食欲不振和体重下降、脱发等。
“需要治疗的受试者”是具有可能威胁生命或损害健康或缩短动物寿命的细菌感染的动物。动物可为鱼、鸟或哺乳动物。示例性哺乳动物包括人、家畜(例如，牛、马、羊、猪、狗和猫)和例如动物园中的展览动物。在一个优选的实施方案中，受试者为人。
如本文所使用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”和“疗法(therapy)”指治愈性疗法、预防性疗法和防治性疗法。
如本文所使用，除非另外规定，术语组合物旨在涵盖而不限于含有一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的药物组合物和营养组合物。组合物也可能含有一种或多种“赋形剂”，所述赋形剂是对疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防或影响人体的结构或任何功能无药理学活性或其它直接影响的“非活性成分”或“化合物”。
“药学上可接受的”组分是适合用于人、动物和/或植物，而没有与合理利益/风险比相应的不良副作用(例如，毒性、刺激作用和变态反应)的成分。
治疗剂可能含有任何核苷。适合核苷包括但不限于腺苷、尿苷、β-假尿苷、肌苷及其混合物。在一个实施方案中，核苷为腺苷和/或尿苷。在一个实施方案中，治疗剂含有腺苷。在本发明的其它实施方案中，治疗剂含有尿苷。
治疗剂可能含有本文已经公开的各种适合抗氧化剂。例如，适合抗氧化剂包括但不限于锰、维生素E和磷酸亚锰、Mn-肽、Mn-氨基酸[例如，亮氨酸]、Mn-TRIS、Mn-黑色素、Mn-咖啡因、Mn-核糖、Mn-海藻糖、Mn-吡啶二羧酸、Mn-磷酸盐和Mn-重碳酸盐。在本发明的一个实施方案中，治疗剂的抗氧化剂为锰。在另一实施方案中，抗氧化剂为MnCl2。又一实施方案中，抗氧化剂为一种或多种肽。
在本发明的一个实施方案中，重要的抗氧化剂为可以近毫摩浓度提供的磷酸亚锰。在另一实施方案中，抗氧化剂为与磷酸盐分别添加的MnCl2。磷酸盐可能是或可能不是正磷酸盐。组合物指抗氧化剂的量随其用途而改变。本领域的技术人员将能够确定适合的量。在一个实施方案中，组合物含有约0.01mM至约15mM的二价锰(Mn(II)离子和1mM至约25mM磷酸盐缓冲液。
治疗剂中核苷和抗氧化剂的量不同。本领域的技术人员将能够根据各种因素确定适合的量，例如受试者、辐射暴露的持续时间、辐射暴露的量等。在本发明的一些实施方案中，核苷的量范围从约0.01mM至约15mM，从约0.1mM至约1mM，从约1mM至约10mM，从约1mM至约15mM。在一个实施方案中，一种或多种核苷的浓度包含约1mM至约15mM的腺苷和/或尿苷。在另一实施方案中，抗氧化剂的量范围从约0.01mM至约15mM。在另一实施方案中，治疗剂含有约0.01mM至约12.5mM。
治疗剂可进一步含有一种或多种表现出细胞保护性质的氨基酸。在本发明的一个实施方案中，治疗剂进一步含有至少一种或多种选自亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸。在另一实施方案中，氨基酸为亮氨酸。在另一实施方案中，氨基酸为甘氨酸。
在一个实施方案中，治疗剂包含腺苷、尿苷、亮氨酸、腺嘌呤和锰。在一个替代性实施方案中，治疗剂包含约1mM至约15mM腺苷和约1mM至约12.5mM MnCl2。在另一实施方案中，治疗剂包含含有一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的耐辐射奇球菌提取物。
在本发明的又一实施方案中，治疗剂为适合人类使用的组合物，所述组合物包含一种或多种核苷(例如，腺苷、尿苷、β-假尿苷、肌苷及其混合物)、一种或多种抗氧化剂(例如，锰、肽和维生素E)和任选一种或多种选自亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸。在一个实施方案中，适合人类使用的组合物包含腺苷和锰。
在本发明的一个替代性实施方案中，治疗剂为含有一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的耐辐射奇球菌提取物。
治疗或预防辐射暴露影响的方法包括向需要的受试者施用包含一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的治疗剂。
一个实施方案为预防放射疗法副作用的方法，所述方法包括向需要的受试者施用包含一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂的耐辐射奇球菌提取物。
本发明的另一实施方案为预防放射疗法副作用的方法，所述方法包括向需要的受试者施用包含一种或多种核苷、抗氧化剂且任选包含选自丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的氨基酸的组合物。优选地，所述一种或多种核苷为腺苷和/或尿苷，其可能以约1mM至约15mM的腺苷和/或尿苷的量存在。所述一种或多种核苷也可能选自腺苷、尿苷、β-假尿苷、肌苷及其混合物。抗氧化剂可为锰(例如，约1mM至约12.5mM)。在一个实施方案中，抗氧化剂为MnCl2。在另一实施方案中，抗氧化剂为一种或多种肽。在另一实施方案中，组合物包含腺苷、尿苷、亮氨酸、腺嘌呤和锰。
本发明的方法特别有利。与得到确认的辐射防护剂(例如，氨磷汀)相比，包含述一种或多种核苷和述一种或多种抗氧化剂(例如，腺苷、尿苷、肽和Mn)的组合物相对无毒。
本发明的方法特别适合意外或故意暴露于电离辐射的军人和平民的暴露前和暴露后治疗。
所述方法也可预防性用于暴露于显著慢性水平辐射的个体，例如在核电厂、长期空间飞行或国际空间站的个体。
当以本发明的方式使用时，“安全有效量”指足以产生所需治疗反应，没有与合理利益/风险比相应的不良副作用(例如，毒性、刺激作用和变态反应)的组分的量。用“治疗有效量”指产生所需治疗反应有效的组分的量，例如减缓细菌细胞分裂速率，或引起细菌细胞分裂中止，或引起死亡或降低细菌种群生长速率有效的量。特定安全有效量或治疗有效量将随如受治特殊病状、受试者的身体状况、受治受试者的类似、治疗持续时间、同步疗法的性质(若有)和采用的特定制剂和化合物或其衍生物的结构等因素改变。
应用方式包括但不限于直接、间接、载体和特殊方式或任何方式组合。噬菌体的直接应用可通过鼻用喷雾剂、滴鼻剂、鼻用软膏、鼻用洗剂、鼻用注射剂、鼻用填片、支气管喷雾剂和吸入器，或间接通过使用咽喉含片(lozenge)，或通过使用嗽口水或含漱剂，或通过使用涂至鼻孔、鼻梁或脸部的软膏或这些方式的任何组合和相似应用方法。噬菌体施用的形式包括但不限于含片、锭剂、糖锭、注入物、口香糖、片剂、粉剂、喷雾剂、液体、软膏和气溶胶。
也可将治疗剂置于鼻用喷雾剂中，其中鼻用喷雾剂为载体。鼻用喷雾剂可为长效或定时释放喷雾剂，并且可通过本领域中众所周知的方式生产。也可使用吸入剂，以致治疗剂可深入到达支气管，包括肺部。
也可将治疗剂添加到这些呈液体形式或冻干状态的物质中，于是当治疗剂遇到体液例如唾液时将溶解。酶也可在胶束或脂质体中。
虽然这些方法可用于任何哺乳类动物，例如家畜，包括但不限于马、羊、猪、鸡和牛，但是组合物优选用于人类。
组合物的有效剂量率或量将部分取决于组合物是用于治疗还是预防，受者暴露于辐射的持续时间、辐射类型、个体的大小和体重等。使用组合物的持续时间也取决于使用是否是为了预防目的，其中使用可为短期每小时一次、每日一次或每周一次，或使用是否是为了治疗目的，其中可能需要更密集的组合物使用方案，以致使用可能持续数小时、数天或数周，和/或每天或一天内定时使用。采用的任何剂型均应提供最短时间量的最小单位数量。在鼻和口腔通道的湿润或潮湿环境中，认为提供有效量或剂量的噬菌体的噬菌体活力单位浓度范围可为约100个单位/ml至约100,000个单位/ml液体，并且可能范围为约100个单位/ml至约10,000个单位/ml。更特别地，暴露于辐射的时间可能影响每毫升活性防辐射组合物的预期浓度。应当指出的是，分类为“延长”或“缓慢”释放载体的载体(例如，某些鼻用喷雾剂或含片)可具有或提供每毫升较低浓度的组合物，但经过较长时间，而“短”或“快速”释放载体(例如，含漱剂)可具有或提供每毫升高浓度的组合物，但经过较短时间。此外将意识到，可由本领域的普通技术人员适当考虑与受试者有关的因素确定特殊组合物的治疗有效量。
可由技术人员根据对将为本领域中普通技术人员所知的若干因素的考虑确定(例如，通过临床试验)优选有效剂量的选择。此类因素包括待治疗或预防的疾病、有关症状、患者的体重、患者的免疫状态和技术人员已知反映施用药物组合物的准确性的其它因素。
制剂中采用的精确剂量也将取决于施用途径并且应根据医师的判断和每位患者的情况决定。可由源自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推断优选剂量。
对于辐射暴露影响的预防性治疗和治疗性治疗和/或预防，也可通过直接、间接、载体和特殊方式和任何方式组合来应用包含核苷和抗氧化剂的组合物。噬菌体的直接应用可通过鼻用喷雾剂、滴鼻剂、鼻用软膏、鼻用洗剂、鼻用注射剂、鼻用填片、支气管喷雾剂和吸入器，或间接通过使用咽喉含片，或通过使用嗽口水或含漱剂，或通过使用涂至鼻孔、鼻梁或脸部的软膏或这些方式的任何组合和相似应用方法。噬菌体施用的形式包括但不限于含片、锭剂、糖锭、注入物、口香糖、片剂、粉剂、喷雾剂、液体、软膏和气溶胶。对于炭疽的治疗，支气管喷雾剂和气溶胶最有利，因为这些载体或分布组合物的方式允许噬菌体达到支气管和肺部。
可通过肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮或口腔途径施用本发明的组合物。例如，可通过微量输注向受伤部位局部施用。可选地，或同时，可通过口腔途径施用。施用的剂量将取决于受者的年龄、健康和体重、同步治疗的种类(若有)、治疗频率和预期效果的性质。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括施用于药学上可接受的载体中的治疗剂。Remington的Pharmaceutical Sciences,2005,Mack Publishing Co.中描述了适合载体及其制剂。通常，在制剂中使用适量的药学上可接受的盐以致使制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括液体，例如盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，并且更优选为约7至约7.5。制剂也可能包含冻干粉。更多载体包括缓释制剂，例如固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形颗粒形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对于本领域的技术人员而言显而易见的是，根据(例如)施用途径和待施用的促炎细胞因子抑制剂的浓度，某些载体可能更优选。
所述方法最佳提供了对由蛋白质损伤介导的许多氧化还原相关形式的细胞损伤的疗法，并促进伤口愈合。
本发明的一个实施方案为制备表现出防辐射性质的耐辐射奇球菌无细胞超滤液提取物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括通过(例如)离心收获耐辐射奇球菌，溶解耐辐射奇球菌培养物以产生溶解产物，洗涤耐辐射奇球菌溶解产物，接着在足以产生上清液的条件下离心溶解产物一段时间。离心后，使上清液通过微型过滤器，优选为3kDa微型过滤器，并煮沸适当时间。在一个实施方案中，过滤后煮沸上清液约15min至约45min。所得的耐辐射奇球菌提取物含有一种或多种核苷和一种或多种抗氧化剂，可溶于丁醇中，耐煮沸并且无细胞。
在一个实施方案中，提取物含有腺苷和锰。在另一实施方案中，提取物含有腺苷和/或尿苷、锰。细胞提取物也可进一步含有亮氨酸、丙氨酸和/或缬氨酸。在一个实施方案中，耐辐射奇球菌提取物至少含有腺苷、尿苷、亮氨酸、腺嘌呤和锰。
无需进一步描述，据信本领域的普通技术人员可使用前面的描述和以下说明性实施例，获得和利用本发明并实践所主张的方法。因此，以下工作实施例特别指出了本发明的优选实施方案，并且不得视为以任何方式限制本公开的剩余内容。
实施例
实施例1-由耐辐射奇球菌制备无蛋白提取物
使耐辐射奇球菌(ATTC BAA-816)在TGY中生长为OD600 0.9，通过离心收获，并通过弗式压力处理溶解。洗涤细胞，然后溶解于双蒸馏去离子无菌水(dH2O)中。溶解之前，用dH2O调节细胞密度以产生占约50％细胞内浓度的溶解产物。粗细胞提取物在175,000×g下离心20h。上清液通过<3kDa的微型离心过滤器(Millipore,USA)并煮沸30min。使用Coomassie(Bradford)蛋白测定法确认超纯提取物中实际上没有蛋白质，等分超纯提取物并储存在-80℃下。
实施例2-分析来自耐辐射奇球菌的无蛋白提取物
由耐辐射奇球菌(ATCC BAA-816)、恶臭假单胞菌(ATCC 47054)、大肠杆菌(MG1655)和嗜热栖热菌(ATCC BAA-163)制备超纯细胞提取物。M.E.Maguire提供了野生型大肠杆菌(MM1925，菌株K12.)及其等基因mntH突变体(MM2115)。耐辐射奇球菌recA-(rec30)和大肠杆菌recA-(DH10B)在本领域中已知。T淋巴细胞系为ATCC TIB-152。由在600nm下于TGY培养基中作为分批培养物培育至相同光密度(0.9；对数期)的细菌制备耐辐射奇球菌、恶臭假单胞菌、大肠杆菌和嗜热栖热菌超滤液。对于大肠杆菌和T淋巴细胞辐射防护研究中使用的耐辐射奇球菌超滤液的大规模生产而言，耐辐射奇球菌在20L发酵罐中高细胞密度生长。通过穿过弗氏压碎器的通道使细胞破裂。按照以下顺序，在12,000×g下离心细菌溶解产物(1h，4℃)；标准化上清液以在蛋白质基础上浓缩并且在190,000×g下超速离心(48h，4℃)；并将超速离心上清液通过3kDa过滤器进行过滤。煮沸超滤液40min，浓缩5倍并储存在-80℃下。耐辐射奇球菌、恶臭假单胞菌、大肠杆菌和嗜热栖热菌超滤液的化学组成经确定如下：用Perkin Elmer型4100ZL原子吸收光谱仪确定的Mn和Fe；通过孔雀绿测定法确定的无机磷酸盐；通过HPLC确定的碱基、核苷和核苷酸；偶氮酪蛋白作为底物确定的蛋白酶活性；和通过安捷伦科技公司实施的柱前衍生化法确定的氨基酸。
实施例3-在大肠杆菌中的防辐射作用
使用在TGY培养基中培育的大肠杆菌单独且结合确定Mn2+、磷酸盐、尿苷和DMSO的防辐射性质；TGY是基于酵母提取物的富肽培养基，并且含有约200nM Mn。在3kGy下，为TGY补充1μΜMn2+并未使大肠杆菌的耐受性提高；为TGY补充13mM磷酸盐使大肠杆菌的耐受性提高800倍；并且为TGY补充3mM尿苷或384mM(3％)DMSO使大肠杆菌的耐受性提高50倍。当这些试剂按单独应用的浓度组合时，暴露于3kGy的大肠杆菌的存活率提高10,000倍。
实施例4-重组Mn2+肽复合物：
极防辐射的Mn2+-十肽-磷酸盐复合物基于从耐辐射奇球菌纯化的上百个肽的连续氨基酸序列(H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH)(SEQ ID NO:1)。自发形成Mn2+复合物的混合物的组成包含3mM(H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH)(SEQ ID NO:1)、1mM MnCl2、25mM正磷酸盐(Pi)缓冲液(pH 7.4)。当在体外重组时，Mn2+复合物保护暴露于50,000Gy的酶的活性。用十肽进行的研究已经证明，它是十肽的氨基酸组成，并非特定氨基酸序列，当与Mn2+和正磷酸盐缓冲液组合时对其防辐射性质至关重要。不需要将肽限制为10个氨基酸，但相反由上述十肽中存在的特定氨基酸构成。
实施例5-应用重组耐辐射奇球菌Mn2+复合物生产照射疫苗
试验使用本文所述的方法照射细菌并使用噬菌体λ病毒模型在40,000Gy下验证(图5)。从用或未用Mn2+复合物(Mn-pep-Pi)：3mM(H-Asp-Glu-His-Gly-Thr-Ala-Val-Met-Leu-Lys-OH)(SEQ ID NO:1)、1mM MnCl2、25mM正磷酸盐(Pi)缓冲液(pH 7.4)处理的经照射噬菌体λ中制备DNA。在指定γ射线剂量(0-40kGy)下，从噬菌体λ中纯化DNA(48.5kbp基因组)，进行传统琼脂糖凝胶电泳，然后用放射性标记的λDNA探针进行DNA印迹。如图5A所示，Mn2+复合物未显著保护包裹在病毒中的DNA。
通过使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离病毒蛋白来测试如图5A中检查的相同噬菌体λ制剂的蛋白质完整性。如图5B所示，在没有Mn2+复合物时经照射的病毒中的蛋白质逐渐被破坏。相反，含有Mn2+复合物的病毒样品中的蛋白质未受高达40kGy的剂量影响。
在除去病毒DNA(见图5A)并致使病毒完全非感染性的剂量40,000Gy下，病毒蛋白保持完全免疫原性。这通过蛋白质分析试验，从而λ蛋白受兔子体内出现的抗非照射λ噬菌体的抗体激发。对于用出现的在Mn2+复合物存在下暴露于40,000Gy的λ噬菌体的抗体探测的等量蛋白质而言，获得同样积极的免疫原性结果。相反，在没有Mn2+复合物时暴露于40,000Gy的λ噬菌体并未在兔子体内产生对首次接受试验的噬菌体λ有显著特异性的抗体。
还对病原性金黄色葡萄球菌菌株成功试验了所述方法(图6)。相反，暴露于超致死剂量的IR，无Mn2+复合物的病毒和细菌导致病毒抗原决定部位完整性大体丧失和免疫原性丧失。
虽然已经参考各种特定材料、步骤和实施例描述并说明了本发明，但是应理解，本发明不限于为此目的所选的材料和步骤的特殊组合。正如本领域的技术人员将意识到的那样，可暗指此类细节的很多变化。其目的是，仅将说明书和实施例视为示例性，由以下权利要求说明本发明的真正范围和精神。本申请中提到的所有参考、专利和专利申请通过引用整体并入本文。

Claims (19)

1.一种生产针对微生物的疫苗的方法，所述方法包括：
a)在防辐射组合物存在下培养、收获和/或悬浮所述微生物，所述组合物包含二价锰、正磷酸盐和由SEQ ID NO:1中存在的10种氨基酸构成的十肽，
b)用足以在防辐射组合物存在下致使所述微生物为复制缺陷型的电离辐射剂量照射所述微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述辐射选自紫外光、α辐射、β辐射、γ辐射、X射线辐射和中子辐射。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种选自腺苷、尿苷、β-假尿苷、肌苷及其混合物的核苷。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种核苷的浓度为1mM至15mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述二价锰是浓度为1mM至12.5mM的MnCl2或磷酸亚锰。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包含来自耐辐射奇球菌的超滤液。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述辐射剂量为至少10kGy。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述微生物为细菌。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述微生物为病毒。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述十肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述十肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
12.一种致使微生物为复制缺陷型的方法，所述方法包括：
(i)在防辐射组合物存在下培养、收获和/或悬浮所述微生物，所述组合物包含二价锰、正磷酸盐和由SEQ ID NO:1中存在的10种氨基酸构成的十肽；以及
(ii)在所述组合物存在下用电离辐射剂量照射所述微生物，其中所述电离辐射剂量足以致使所述微生物为复制缺陷型。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述防辐射组合物进一步包含至少一种选自腺苷、尿苷、β-假尿苷、肌苷及其混合物的核苷。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种核苷的浓度为1mM至15mM。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述二价锰是浓度为1mM至12.5mM的MnCl2或磷酸亚锰。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物进一步包含来自耐辐射奇球菌的超滤液。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述微生物为大肠杆菌。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述十肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述十肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
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