KR20210132054A - 무기 염류 단백 복합 의료 기기 - Google Patents

Abstract

펩티드 호르몬 등을 포매한 아파타이트 등의 무기 염류 고체가 금속 등을 코팅하도록 배치된 의료 기기로서, 상기 무기 염류 고체가 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의 제어된 지연 공침 등으로 제공되어 있고, 상기 의료 기기가 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선에 노출되어 있는 의료 기기.

Description

무기 염류 단백 복합 의료 기기

본 발명은, 무기 염류의 결정 또는 무기 염류의 아모르퍼스 고체 (이하, 본 명세서에 있어서 간단히 「무기 염류 고체」 라고 부르는 경우가 있다) 와 생물 활성을 갖는 단백을 포함하는, 전리 방사선 멸균 내성이 있는 의료 기기에 관한 것이다.

보다 특정하면, 본 발명은, 인간을 포함하는 포유류 동물에 사용하는 의료 기기로서, 그 동물에 있어서 이물질로 인식되지 않는 생물 활성이 있는 단백을 포매한 무기 염류 고체를 포함하고, 포매에 의해 획득한 전리 방사선 멸균 내성을 이용하여, 단백의 생물 활성을 유지한 채로 전리 방사선에 의해 멸균된 의료 기기에 관한 것이다.

포매 (embedding) 란, 병리학에서 사용되는 용어이다. 병리 검사의 대상이 되는 생체 조직을, 고화 (固化) 가능한 액상의 파라핀이나 수지에 매립 고화시켜 생체 조직을 고정시키는 것을 말한다. 병리 검사에서는, 조직 포매 블록을 마이크로톰 등으로 박절 (薄切) 하여 조직 염색용의 절편 (프레파라트) 으로서 현미경 검사 등에 제공한다. 본 명세서에서는, 이 개념을 확장하여, 무기 염류 고체 중에 단백 분자 전체 또는 일부를 매입시키거나, 혹은 단백 분자 전체 또는 일부를 무기 염류 고체로 치밀하게 싸서, 단백 분자를 무기 염류 고체 중에 고정시키는 것을 「포매」 라고 부른다. 「포매」 는, 당해 무기 염류 고체에 단백 분자가 단순히 「흡착」 또는 「접촉」 하고 있는 상태, 혹은 「혼합」 되어 있는 상태와는 상이하다.

단백 분자가 무기 염류 고체에 「포매」 되어 있는 실례로는, 단백을 공존시킨 인산칼슘 과포화 용액으로부터, 그 단백 분자와 인산칼슘을 공침시켜, 인산칼슘의 매트릭스 중에 그 단백 분자가 나노미터 오더의 간격으로 분산되어 배치된 조성물을 들 수 있다 (비특허문헌 1).

한편, 무균성이 요구되는 의료 분야에서 사용되는 의약품·의료 기기 등의 제품이나 원료는, 제조 공정에서 여러 가지 방법으로 멸균된다. 멸균법 중, 물질을 투과하기 쉬운 방사선의 특성을 이용한 멸균법이 전리 방사선 멸균이다. 특히 제조의 최종 공정에서 적용하기 쉬우므로, 전리 방사선 조사에 의한 대상물의 변성·실활을 문제로 하지 않는 경우에 있어서는, 최종 멸균법으로서 범용되고 있다.

멸균되는 대상물에 존재한다고 예상되는 균종, 균수나 존재 형태에 따라, 사용되는 전리 방사선의 선종과 선량은 상이하지만, 의료용의 기구류에서는, 물질 투과성이 높은 감마선이 많이 사용되고, 적절한 멸균선량으로서 25 kGy 를 대표로 하여 그 전후의 선량이 범용되고 있다. 또, 대상물의 표면을 멸균하고자 하는 경우에는, 선량률이 커서 단시간 조사로 끝나는 전자선도 범용된다.

그러나, 어떠한 멸균법도 생물 활성을 갖는 물질의 실활을 일으키기 쉽다. 전리 방사선 멸균에서는, 특히 핵산이나 단백에 대해서는 분자 사이즈가 큰 만큼 실활되기 쉽고, 예를 들어 생체 내에 있어서의 단백의 활성 도메인의 분자량 측정법으로서 방사선 실활법이 확립되어 있을 정도이다 (비특허문헌 2). 또, 일반적으로는, 「생물학적 제제는 최종 멸균법을 적용할 수 없기 때문에, 무균 제조 공정을 적용하여 제조하는 무균 관리가 매우 어려운 제품이다」 (비특허문헌 3) 라는 개념이 상식으로 되어 있고, European Medicines Agency 의 의약품의 멸균법에 관한 가이드 라인의 공개 드래프트 (비특허문헌 4) 에도, 「For highly sensitive products such as biological products where terminal sterilization of the drug product is not possible, aseptic processing under controlled conditions provides a satisfactory quality of the drug product (의약품의 최종 멸균이 불가능한 생물학적 제제와 같은 고도로 감수성이 높은 제품에 관해서는, 관리된 조건하에서의 무균 조작법에 의한 가공이 그 의약품의 만족스러운 품질을 부여한다)」 라고 기재되어 있다. 「최종 멸균법에 의한 무균 의약품의 제조에 관한 지침」 (비특허문헌 5) 이 개시되어 있다. 그러나, 멸균되어야 할 의약품의 활성을 보호하는 방법에 대해서는, 전혀 언급되어 있지 않다.

전리 방사선은 선종에 상관없이 비특이적으로 여러 가지 화합물을 히트하여 라디칼을 만든다. 라디칼 발생 부위에서는 라디칼 전자의 전이가 발생하여, 원래의 화합물과는 완전히 상이한 화합물에 라디칼 반응이 일어나는 경우가 있다. 라디칼 반응의 결과, DNA 든지 막 지질이든지 세포에 있어서 중요한 화합물에 부자연스러운 변화가 발생하면 세포에 유해하다 (비특허문헌 6). 이와 같은 유해 작용을 세균이나 바이러스에 부여하면 멸균이 된다. 동일하게, 생물 활성을 갖는 단백이 라디칼과 반응하면 실활된다.

유해한 라디칼을 불활성화하는 방사선 방호제로서, 시스틴이나 글루타티온과 같은 티올류가 알려져 있으며, 대표예로는 아미노티올 유도체가 있다. 시스테아민 (메르캅토에틸아민), WR-2721 (S-2-(3-Aminopropylamino)ethylphosphorothioic acid) 등은 예전부터 알려져 있었다 (비특허문헌 7). 그 밖에 2-메르캅토에틸아민, 알코올 (에탄올) 도 문헌에 기재되어 있다 (비특허문헌 8). 또, 세포 상해성을 지표로 한 스크리닝에서는, (+)카테킨, 쿠르쿠민, 비타민 C, 레스베라트롤, 카페인산, 케르세틴이 방사선 방호 효과를 나타내는 물질로서 기재되어 있다 (비특허문헌 9). 또한, 질소 함유 화합물류가 방사선 방호 효과를 나타내는 물질로서 기재되어 있다 (비특허문헌 10). 그 밖에도, 아미노산 혼합물에도 생물 활성 단백의 방사선 방호 작용이 있는 것이 알려져 있다 (특허문헌 1, 2). 또한, 전리 방사선으로 멸균할 때의 단백의 실활을 억제하는 방법으로는, 셀룰로오스에테르 유도체나 특정한 아미노산군과 공존시켜 억제하는 방법 (특허문헌 3, 4), 지방족 폴리에스테르를 공존시키는 방법 (특허문헌 5), 젤라틴 등의 외래 단백질을 공존시키는 방법 (특허문헌 6) 이 개시되어 있다. 그러나 이들은 모두 유기물의 방사선 방호제이다. 또, 생물 활성 단백과 콜라겐 스펀지나 흡수성 폴리머를 공존시키는 방법 (특허문헌 7, 8) 이 개시되어 있지만, 전리 방사선으로 멸균할 때에 실활을 억제하는 방법은 개시되어 있지 않다.

한편, 무기물의 방사선 방호제에 대해서는, 셀렌 (비특허문헌 11), 바나데이트 (비특허문헌 12), 황산아연 (비특허문헌 13), 망간 화합물 (특허문헌 9, 10) 이 알려져 있다. 그러나, 많은 무기 염류에 대해서는, 포유류 동물에 대한 의료 기기로는, 독성이 염려되기 때문에, 의료용을 위한 방사선 방호제로는 개발 대상으로 되어 있지 않다.

무기물 중에서는, 인산칼슘은 안전성이나 생체 적합성이 높고, Ca 이온과 PO₄ 이온의 몰비율이 상이한, 아파타이트 (Ca/P 몰비 1.67), 인산삼칼슘 (Ca/P 몰비 1.50) 등의 결정이나, 비정질 인산칼슘 (Ca/P 몰비 1 ∼ 1.8) 이 의료 기기 등에 사용된다.

인산칼슘에 전리 방사선이 조사되었을 때에 발생하는 라디칼을 전자 스핀 공명에 의해 분석하는, 소성 아파타이트를 사용한 선량 측정법이 개발되고 있다 (특허문헌 11). 그러나, 기재된 선량 범위는 0 ∼ 60 Gy 정도이고, 그 1000 배 이상이나 되는 전리 방사선 멸균에 적합한 선량 범위 (수 kGy 이상, 통상 10 ∼ 30 kGy 가 많다) 에서 조사하는 것이나, 공존하는 다른 생물 활성 분자에 대한 방사선 방호 작용에 대해서는 전혀 언급되어 있지 않다.

또, 무기 염류인 아파타이트 또는 하이드록시아파타이트에 대해, 멸균에 적합한 방사선량을 조사했을 경우, 생물 활성 단백에 대한 방호 효과에 언급한 문헌으로는, 일본 공표특허공보 평11-506360호 (특허문헌 12) 가 알려져 있다. 이 문헌에는, 생물 활성 골원성 단백을 함유하는 불용성의 합성 폴리머 캐리어 재료의 하나로서 「세라믹스 (예를 들어, 하이드록시아파타이트, 인산삼칼슘 및 다른 인산칼슘 및 그들의 조합을 (제한 없이) 포함하는 재료의 임의의 하나 또는 조합이, 유리하게 사용될 수 있다」 고 기재되고, 포유류 동물에 이식하기 위한 최종 멸균 골원성 디바이스가 기재되어 있다.

그러나, 이 문헌에는, 생물 활성 골원성 단백과, 세라믹스를 포함하는 재료의 「임의의 하나 또는 조합」 이 어떠한 양태이어야 하는지에 대해서는 전혀 언급되어 있지 않다. 생체 활성 골원성 단백과 재료의 조합의 양태로는, 「혼합」, 「흡착」, 「접촉」, 「포매」 등의 종류가 있으며 (이하, 일괄적으로 「조합 양태의 종류」 라고 한다), 조합 양태의 종류의 차이에 의해, 최종 멸균 후의 단백의 생물 활성에 큰 차이가 생기는 것은 개시되어 있지 않고, 하물며 골원성 단백의 생물 활성을 유지한 상태의 최종 멸균을 가능하게 하는 최적인 조합 양태가 어떠한 조합 양태인가에 대해서는 기재도 시사도 없다.

일본 공표특허공보 2007-513083호 (특허문헌 13) 에는, 의료용 이식편으로서, 무기 염류와 생물 활성 단백을 포함하여, 멸균성의 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 동일하게, 무기 염류와 생물 활성 단백의 조합 양태의 차이에 의해, 최종 멸균 후의 생물 활성 단백의 생물 활성에 큰 차이가 생기는 것, 및 생물 활성 단백의 활성을 유지한 상태의 최종 멸균을 가능하게 하는 최적인 조합 양태가 어떠한 조합 양태인가에 대해서는 기재도 시사도 없다.

일본 공표특허공보 2007-515196호 (특허문헌 14) 에는, 골 출혈의 제어를 위한 퍼티로서, 무기 염류인 하이드록시아파타이트와 골 생장 유발 물질을 포함하는 조성물이 개시되어 있지만, 그 골 생장 유발 물질이 탈염 골 기질이나 골 형태 형성 단백과 같은 방사선 감수성의 생물 활성 단백인 경우에는, 최종 멸균을 할 수 없다고 기재되어 있다.

일본 공표특허공보 2002-501786호 (특허문헌 15) 에는, 가열 또는 방사선 멸균된 젤라틴, 재생 증식 인자 등의 골 형성 성분, 인산칼슘 세라믹 등의 무기 염류를 포함하는 골 페이스트 조성물이 개시되어 있지만, 그 조성물을 형성하고 나서 최종적으로 방사선 조사 및 열처리로 멸균하는 것은 기재도 시사도 없다.

일본 공표특허공보 2002-529201호 (특허문헌 16) 에는, 인간에게 이식하는 이식편으로서, 무기 염류인 세라믹스, 증식 인자 등의 생물 활성 물질이나 또한 그것들을 포함하는 동종/자기/이종 이식 조직을 포함하는 이식편이 개시되어 있지만, 최종 멸균은, 「조직 특성에 유해한 영향을 미치지 않는 것이 주지된 선량의 γ 선 또는 다른 종류의 조사」, 혹은 「독성 또는 바람직한 생물 활성의 저하가 발생하지 않는 한」 의 전자선 멸균이나 에틸렌옥사이드 멸균이 실시된다. 즉, 생물 활성을 유지하기 위해서, 방사선의 멸균 효과를 희생하는 것을 용인하고 있다고 생각되고, 조사선량을 제한함으로써 유해 영향이나 생물 활성 저하를 방지하고 있다. 해결책으로서, 필요에 따라 최종 멸균 전에 「추가적인 증강으로서, 바람직한 생물 활성 물질을 이식편에 주입하는」 것만이 기재되어 있다.

일본 공표특허공보 평10-511957호 (특허문헌 17) 에는, 평균 직경이 약 300 ㎚ 미만인 생체 적합성·생분해성 폴리머의 코어로 이루어지는 나노 미립자로서 생물 활성제를 포함하고 있고, 아파타이트나 골 세라믹스와 조합하는 방사선 멸균된 나노 미립자가 개시되어 있지만, 방사선 멸균에 의한 생물 활성제의 실활을 방지하는 방법이나, 활성을 유지한 상태의 최종 멸균을 가능하게 하는 최적인 조합 양태가 어떠한 조합 양태인가에 대해서는 언급되어 있지 않다.

일본 공표특허공보 2003-503423호 (특허문헌 18) 에는, 생물 활성이, 무기, 유기 또는 유기 및 무기 물질을 포함하는 캐리어의 매트릭스 내에 삽입되고, 합성 후에 멸균되는 캐리어가 기재되어 있지만, 무기, 유기 또는 유기 및 무기 물질을 포함하는 캐리어의 매트릭스가, 조합 양태의 종류가 어떠한 경우에, 생물 활성이 멸균 후에도 유지되는지, 혹은 어떠한 멸균법일 때에 생물 활성이 멸균 후에도 유지되는지라는 점에 대해서는 기재되어 있지 않고, 시사도 없다.

일본 특허 5221132호 (특허문헌 19) 에는, 칼슘, 마그네슘, 인산, 탄산수소 이온 및 생물 활성 물질을 포함하는 식염수 혼합물을 포함하는, 산성화된 조성물에 기체를 접촉시켜, pH 를 증가시킴으로써, 염과 생물 활성 물질의 공침을 발생시켜, 코팅된 기체를 얻는 방법이 기재되어 있다. 청구항에 기재된 발명에서는 언급되어 있지 않지만, 발명의 상세한 설명의 란에는, 마지막 공정 후에 감마선 조사를 실시하는 것도 가능하다고 기재되어 있다 (단락 번호 [0020] 에 「공정 c) 에 계속되는 마지막 단계에서, 방부 (aseptic) 및 무균 (sterilize) 상태가 아닌 조건하에서, 감마선 조사를 사용하여 당해 방법을 실시하는 것도 가능하다」 는 기재가 있다). 그러나, 이 감마선 조사에 대해서는 일반적인 멸균 수법의 일례로서 가능성을 언급하고 있는 것에 지나지 않고, 감마선 조사에 의해 멸균을 실시한 구체적인 실험예의 개시는 없다. 또, 기체에는 금속, 세라믹, 폴리머와 같은 재질이 상이한 기체가 있지만, 모든 재질의 기체에 대해 감마선 조사 후에 생물 활성이 유지되거나, 혹은 특정한 재질의 기체에 대해서만 감마선 조사할 때에 생물 활성이 조사 후에도 유지되는가 하는 점, 혹은 어떠한 양태로 감마선 조사할 때에 생물 활성이 조사 후에도 유지되는가 하는 점에 대해서는 기재도 없고 시사도 없다.

국제 공개 WO2006/004778 (특허문헌 33) 에는, 세포 접착 촉진 효과를 갖는 펩티드가 나노 결정성 아파타이트층에 도입된 코팅층을 갖는 임플란트가 기재되어 있고, 실시예에는, 티탄제 디스크에 펩티드 존재하에 있어서 하이드록시아파타이트를 전기 화학적으로 침착시키고, 아파타이트층 내에 펩티드가 도입된 임플란트에서는, 25 kgrey 의 γ 선 조사 후에 세포 접착 촉진 효과가 저하되지 않았던 것, 한편, 아파타이트층의 표면에 펩티드를 흡착시켰을 뿐인 임플란트에서는 γ 선 조사 후에 세포 접착 촉진 효과가 없어진 것이 기재되어 있다 (실시예 1 및 2).

그러나, 상기의 특허문헌에 개시된 임플란트는 하이드록시아파타이트를 전기 화학적으로 침착시킨 것이고, 인산칼슘 과포화 용액 중에 있어서 펩티드와의 공침에 의해 제조한 복합체는 아니다. 전기 화학적인 침착에 의해 펩티드를 아파타이트층 내에 도입시킨 경우와, 펩티드를 아파타이트와 함께 공침시켜 얻어지는 복합체에서는, 미시적인 구조나 결정성이 완전히 상이하다.

즉, 전기 화학적인 침착에 의해 형성되는 아파타이트는, 분말 X 선 회절법으로 (002) (211) (112) (300) 회절선이 분리될 정도까지 결정성이 높고 (예를 들어, 비특허문헌 18), 결정 형태로서도 아파타이트 결정에 특징적인 육각침상이나 육각판상의 형태를 취하기 쉽다. 결정성이 높기 때문에 아파타이트의 용해성은 낮다 (특허문헌 33). 용해성이 낮은 아파타이트는, 서방 (徐放) 이 불필요하고 표면에 고정시키는 것만이 중요한 펩티드나 단백을 복합화하는 데에 적합하다. 서방이 불필요하고 표면에 고정시키는 것만이 중요한 펩티드나 단백의 일례가 세포 접착 촉진 효과를 갖는 펩티드나 단백이다. 실제로, 이 특허문헌에서도 침상의 아파타이트가 형성되는 것, 그 아파타이트의 용해성이 낮아서 안정적인 것, 세포 접착 촉진 효과를 갖는 펩티드가 안정적으로 강하게 표면에 결합하고 있는 것이 기재되어 있다. 한편, 세포 증식 활성, 조직 형성 활성, 세포 분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성을 갖는 펩티드나 단백은, 서방됨으로써 주위의 조직에 효과가 미치므로, 결정성이 높고 용해성이 낮은 아파타이트에 도입되는 것은 적당하지 않다. 오히려, 아파타이트나 인산칼슘의 용해성은 적절히 저하시켜, 도입된 펩티드나 단백이 서방되도록 할 필요가 있다.

원래, 전기 화학적인 침착에 의한 코팅은 도전성의 금속에는 적용할 수 있지만, 비도전성의 세라믹에는 적용할 수 없다. 또한 이 특허문헌에는, 세포외 기질 유래로서 그 자신은 직접적인 세포 증식 분화 활성을 갖지 않는 다당류 (예를 들어 헤파린) 를 펩티드과 함께 공존시켜 하이드록시아파타이트의 층 내에 펩티드를 도입시킨 예는 개시되어 있지 않다.

한편, 생체의 면역 반응 유도를 목적으로 한 백신에서는, 무기 염류의 면역 아쥬반트가 항원과 함께 사용되는 경우가 있다. 무기 염류의 면역 아쥬반트로는, 수산화알루미늄 외에, 염화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등의 알루미늄염이 오랫동안 범용되고, 인산칼슘도 사용된다. 인산칼슘 면역 아쥬반트로는, 생체 유래의 암 특이적 항원을 무기 염류인 β-인산삼칼슘에 조합하고, 암 특이적 항원 백신으로서 기재한 백신·아쥬반트 (특허문헌 20, 21), 항원과 함께 사용하는 인산칼슘 면역 아쥬반트 (특허문헌 22, 23) 가 있지만, 모두 단백인 항원과 조합한 후에 방사선 멸균하는 것에 대해서는 전혀 언급되어 있지 않다. 알루미늄염 면역 아쥬반트는, 세균이나 바이러스 등의 항원과 조합하여, 감염증 예방용의 백신에 사용되어 온 긴 역사가 있으며, 그 중에는 방사선에 의한 최종 멸균을 거쳐 제조되어 온 백신도 있다 (비특허문헌 14).

그러나, 세균이나 바이러스 등과 같은 항원은, 백신 투여 대상의 동물과는 이종의 생물 또는 이종 생물의 생체 분자이고, 투여 또는 이식 대상 동물이 이물질이라고 인식하는 단백이다. 그러므로, 이들 문헌은, 투여 또는 이식 대상의 동물이 이물질로 인식하지 않는 단백을 방사선 멸균하는 것을 개시하고 있는 것은 아니다. 원래 세균이나 바이러스 등과 같은 항원은, 투여 대상 동물에 있어서 이물질로서, 면역계에 의해 배제되는 것이다. 그 때문에 방사선 멸균에 의해 부자연스러운 분자 변화가 일어나도 이물질인 것에는 변함이 없고, 따라서, 의도한 효과 (면역계에 의한 배제) 에 미치는 악영향은 비교적 작다고 생각된다. 한편, 투여 또는 이식 대상 동물이 이물질로 인식하지 않는 단백을 이용하여, 조직 재생 등의 효과를 얻고자 하는 경우에는, 방사선 멸균에 의한 부자연스러운 분자 변화는, 이물질로 인식되는, 수용체와의 결합이 일어나지 않는 등, 당해 단백이 갖는 기능에 악영향을 미쳐, 의도한 효과를 얻기 어려워지는 것으로 생각된다.

이와 같은 상황에서, 생물 활성 단백, 특히, 아미노산 잔기수가 50 정도까지의 단사슬의 펩티드가 아니라, 50 이상이나 있는 장사슬의 단백으로서 방사선에 의한 최종 멸균법이 적용된 생물학적 제제는 키모트립신, 파파인의 예 (비특허문헌 15, 16) 가 알려져 있을 뿐이다.

국제 공개 WO01/043143 일본 공개특허공보 2016-53063호 일본 특허공보 제5872032호 일본 특허공보 제6317307호 일본 특허공보 제5746430호 미국 특허공보 제5730933호 유럽 특허공개 0562864 A1 유럽 특허 0562864 B1 일본 공개특허공보 2016-106104호 일본 공개특허공보 2017-222687호 일본 공개특허공보 평09-133770호 일본 공표특허공보 평11-506360호 일본 공표특허공보 2007-513083호 일본 공표특허공보 2007-515196호 일본 공표특허공보 2002-501786호 일본 공표특허공보 2002-529201호 일본 공표특허공보 평10-511957호 일본 공표특허공보 2003-503423호 일본 특허공보 5221132호 일본 특허공보 6082901호 국제 공개 WO2012/105224 국제 공개 WO2017/047095 일본 특허공보 제4569946호 일본 특허출원공보 2016-173357호 유럽 특허공개 806212 일본 공개특허공보 2000-93503호 유럽 특허 1786483 B1 (특허문헌 17 의 대응 유럽 특허) 국제 공개 WO2006/016807 일본 특허공보 4478754호 미국 특허 제6136369호 미국 특허 제6143948호 미국 특허 제6344061호 국제 공개 WO2006/004778

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본 발명의 과제는, 방사선 멸균을 실시해도 생물 활성을 유지하고 있는 생물 활성 단백을 포함하는, 동물에 사용하기 위한 의료 기기를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 과제는, 방사선 멸균을 실시해도 생물 활성을 유지하고 있는 생물 활성 단백을 포함하는, 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기를 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 과제는, 방사선 멸균을 실시해도 생물 활성을 유지하고 있는 생물 활성 단백을 포함하는, 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기로서, 예를 들어, 골조직 수복용 의료 기기 또는 인공 관절 등을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는, 방사선 멸균을 실시해도 생물 활성을 유지하고 있는 생물 활성 단백을 포함하는, 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기로서, 예를 들어, 골조직 수복용 의료 기기 또는 인공 관절 등을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 실시한 결과, 무기 염류 고체 중에 생물 활성 단백을 포매시킴에 있어서, 무기 염류와 생물 활성 단백을 공침시킨 복합체를 형성함으로써, 멸균에 적합한 선량의 방사선을 조사해도, 그 단백의 실활이 대폭 억제되는 것을 알아내었다. 즉, 무기 염류 고체 자체에 유용한 방사선 방호 작용이 있는 것을 알아내었다.

예를 들어, 인산칼슘은, 조건에 따라서는 용이하게 과포화 용액을 만들 수 있다. 여기에 어떠한 (물리적 혹은 화학적인) 자극을 가하면, 과포화 상태는 신속하게 해소되고 인산칼슘이 석출되어 침전을 일으킨다. 이 때, 과포화 용액에 용질로서 생물 활성 단백을 첨가해 둠으로써, 침전하는 인산칼슘이 그 단백을 말려들게 하여, 그 단백을 포매한 상태의 아파타이트 등의 인산칼슘 공침 석출 조성물이 생성된다. 이 침전을 동결 건조시켜 얻어지는 조성물에서는, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사해도, 그 생물 활성 단백의 실활은 대폭 억제되었다. 동일하게, 생물 활성 단백을 염화나트륨에 포매하고, 진공 건조시켜 얻어지는 조성물에 있어서도, 멸균에 적합한 선량의 감마선의 조사에 의한 그 생물 활성 단백의 실활은 대폭 억제되었다. 이들의 지견은, 조사시의 라디칼 발생을 억제하면, 생물 활성 단백의 실활을 방지할 수 있는 것을 시사하고 있지만, 본 발명은 이들의 지견을 기초로 하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

[1] 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 금속, 세라믹, 또는 그 양자의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된, 인간을 포함하는 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기로서,

(a) 상기 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 자발 핵 형성을 발생시키는 중성 또는 약알칼리성의 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의 제어된 지연 공침 또는 피복 샌드위치법 또는 건조법의 공정으로 제공되어 있고,

(b) 상기 의료 기기가, 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선을 노출시키고, 그에 의해 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조직 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 생물 활성을 갖는 최종 멸균 의료 기기로서 제조하는 공정으로 제조되어 있고,

(c) 상기 무기 염류가, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 및 탄산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 무기 염류이고, 또한,

(d) 상기 생물 활성을 갖는 단백이, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 및 골원성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 단백인,

의료 기기.

[2] 아파타이트가 저결정성 아파타이트인 상기 [1] 에 기재된 의료 기기.

[3] 지연 공침이, 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, Ca 이온 0.5 ∼ 2.5 mM, 인산 이온 1.0 ∼ 20 mM, K 이온 0 ∼ 40 mM, Na 이온 0 ∼ 200 mM, Cl 이온 0 ∼ 200 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액에 있어서의 KCl 농도의 제어에 의한 인산칼슘 석출까지의 시간의 인공적인 제어 지연을 포함하는 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 의료 기기.

[4] 지연 공침이, 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, Ca 이온 1.2 ∼ 2.75 mM, 인산 이온 0.6 ∼ 15 mM, K 이온 0 ∼ 30 mM, Na 이온 30 ∼ 150 mM, Mg 이온 0.1 ∼ 3.0 mM, Cl 이온 30 ∼ 150 mM, HCO₃ 이온 0 ∼ 60 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액에 있어서의 KCl 농도의 제어에 의한 인산칼슘 석출까지의 시간의 인공적인 제어 지연을 포함하는 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 의료 기기.

[5] 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 추가로 세포외 기질 유래로서 그 자신은 직접적인 세포 증식 분화 활성을 갖지 않는 다당류, 바람직하게는 헤파린을 포매하고 있는 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[6] 금속이, 티탄, 티탄 합금, 스테인리스, 및 코발트 크롬 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 금속인 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[7] 세라믹이, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 알루미나, 지르코니아, 및 이들의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 세라믹인 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[8] 전리 방사선이 감마선 및/또는 전자선인 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[9] 감마선 및/또는 전자선에 의한 멸균이, 라디칼 발생을 억제하는 조건하에서 실시되고, 그 조건이, (a) 대기압 50 ㎪ 이하의 탈기 상태에서의 멸균, (b) 대기를 질소 또는 불활성 가스로 교환한 상태에서의 멸균, (c) 0 ℃ 내지 -196 ℃ 의 범위의 저온에서의 멸균, 및 (d) 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체에 추가로 아스코르브산 또는 아스코르브산염을 첨가한 상태에서의 멸균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 조건인, 상기 [8] 에 기재된 의료 기기.

[10] 아스코르브산 또는 아스코르브산염이 아스코르브산, 아스코르브산나트륨, 아스코르브산칼슘 이수화물, 및 아스코르브산인산에스테르마그네슘염 n 수화물로 이루어지는 군에서 선택되는 상기 [9] 에 기재된 의료 기기.

[11] 감마선의 선량이 3 ∼ 40 kGy 인 상기 [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[12] 펩티드 호르몬이, 시상하부 유래 펩티드 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 인터메딘, 성선 자극 호르몬, 성장 호르몬, 파라타이로이드 호르몬, 인히빈, 액티빈, 릴랙신, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 콜레시스토키닌, 세크레틴, 모틸린, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 에리트로포에틴, 렙틴, 엔도셀린, 그렐린, 아디포넥틴, 인슐린형 성장 인자, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 펩티드 호르몬인 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[13] 성장 인자가 FGF-2 및 그 기능적 등가물로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 성장 인자인 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[14] 골원성 단백이, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, DPP, Vg1, Vgr-1, 및 그들의 기능적 등가물로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 골원성 단백인 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[15] 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선에 의해 최종 멸균된 후의 생물 활성이, 멸균 전의 생물 활성에 대해 13 ％ 이상인 상기 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[16] 조직 수복에 사용하기 위한 상기 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[17] 체내 고정핀, 체내 고정용 나사, 인공골, 골 보전재, 치과용 골내 임플란트, 척추내 고정 기구, 수내정 (髓內釘), 및 척추 케이지로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 의료 기기인, 상기 [16] 에 기재된 의료 기기.

[18] 인공 관절로서 사용하기 위한 상기 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 의료 기기.

[19] 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 금속, 세라믹, 또는 그 양자의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된, 인간을 포함하는 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기를 제조하는 방법으로서,

(a) 상기 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체를, 자발 핵 형성을 발생시키는 중성 또는 약알칼리성의 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의 제어된 지연 공침 또는 피복 샌드위치법 또는 건조법으로 제조하는 공정, 또한

(b) 상기 의료 기기를, 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선에 노출시키고, 그에 의해 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조직 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 생물 활성을 갖는 최종 멸균 의료 기기로서 제조하는 공정

을 포함하는 방법.

[20] 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 금속, 세라믹, 또는 그 양자의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된, 인간을 포함하는 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기를 제조하는 방법으로서,

(a) 상기 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체를, 자발 핵 형성을 발생시키는 중성 또는 약알칼리성의 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의 제어된 지연 공침 또는 피복 샌드위치법 또는 건조법으로 제조하는 공정, 또한

(b) 상기 의료 기기를, 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선에 노출시키고, 그에 의해 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조직 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 생물 활성을 갖는 최종 멸균 의료 기기로서 제조하고, 그 최종 멸균 의료 기기의 생물 활성이 적어도 멸균 전의 약 13 ％ 이상인 공정

을 포함하는 방법.

[21] 무기 염류가 저결정성 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 및 탄산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 무기 염류인 상기 [19] 또는 [20] 에 기재된 방법.

[22] 지연 공침이, 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, Ca 이온 0.5 ∼ 2.5 mM, 인산 이온 1.0 ∼ 20 mM, K 이온 0 ∼ 40 mM, Na 이온 0 ∼ 200 mM, Cl 이온 0 ∼ 200 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액에 있어서의 KCl 농도의 제어에 의한 인산칼슘 석출까지의 시간의 인공적인 제어 지연을 포함하는 상기 [19] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[23] 지연 공침이, 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, Ca 이온 1.2 ∼ 2.75 mM, 인산 이온 0.6 ∼ 15 mM, K 이온 0 ∼ 30 mM, Na 이온 30 ∼ 150 mM, Mg 이온 0.1 ∼ 3.0 mM, Cl 이온 30 ∼ 150 mM, HCO₃ 이온 0 ∼ 60 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액에 있어서의 KCl 농도의 제어에 의한 인산칼슘 석출까지의 시간의 인공적인 제어 지연을 포함하는 상기 [19] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[24] 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체를 제조하는 공정이, 생물 활성을 갖는 단백에 더하여 세포외 기질 유래로서 그 자신은 직접적인 세포 증식 분화 활성을 갖지 않는 다당류로서, 바람직하게는 헤파린을 포매한 무기 염류 고체를 제조하는 공정을 포함하는, 상기 [19] 내지 [23] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[25] 금속이, 티탄, 티탄 합금, 스테인리스, 및 코발트 크롬 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 금속인 상기 [19] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[26] 세라믹이, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 알루미나, 지르코니아, 및 이들의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 세라믹인 상기 [19] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[27] 전리 방사선이 감마선 및/또는 전자선인 상기 [19] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[28] 감마선 및/또는 전자선에 의한 멸균이, 라디칼 발생을 억제하는 조건하에서 실시되고, 그 조건이, (a) 대기압 50 ㎪ 이하의 탈기 상태에서의 멸균, (b) 대기를 질소 또는 불활성 가스로 교환한 상태에서의 멸균, (c) 0 ℃ 내지 -196 ℃ 의 범위의 저온에서의 멸균, 및 (d) 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체에 추가로 아스코르브산 또는 아스코르브산염을 첨가한 상태에서의 멸균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 조건인, 상기 [27] 에 기재된 방법.

[29] 아스코르브산 또는 아스코르브산염이 아스코르브산, 아스코르브산나트륨, 아스코르브산칼슘 이수화물, 및 아스코르브산인산에스테르마그네슘염 n 수화물로 이루어지는 군에서 선택되는 상기 [28] 에 기재된 방법.

[30] 감마선의 선량이 3 ∼ 40 kGy 인 상기 [27] 내지 [29] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[31] 펩티드 호르몬이, 시상하부 유래 펩티드 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 인터메딘, 성선 자극 호르몬, 성장 호르몬, 파라타이로이드 호르몬, 인히빈, 액티빈, 릴랙신, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 콜레시스토키닌, 세크레틴, 모틸린, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 에리트로포에틴, 렙틴, 엔도셀린, 그렐린, 아디포넥틴, 인슐린형 성장 인자, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 펩티드 호르몬인 상기 [19] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[32] 성장 인자가 FGF-2 및 그 기능적 등가물로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 성장 인자인 상기 [19] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[33] 골원성 단백이, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, DPP, Vg1, Vgr-1, 및 그들의 기능적 등가물로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 골원성 단백인 상기 [19] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[34] 조직 수복에 사용하기 위한 의료 기기의 제조 방법으로서, 상기 [19] 내지 [33] 중 어느 하나의 방법을 포함하는 방법.

[35] 상기 조직 수복에 사용하기 위한 의료 기기가, 체내 고정핀, 체내 고정용 나사, 인공골, 골 보전재, 치과용 골내 임플란트, 척추내 고정 기구, 수내정, 및 척추 케이지로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 의료 기기인, 상기 [34] 에 기재된 방법.

[36] 인공 관절로서 사용하기 위한 의료 기기의 제조법으로서, 상기 [19] 내지 [33] 중 어느 하나의 방법을 포함하는 방법.

본 발명의 의료 기기는, 공정 관리가 번잡한 무균 제조 공정을 회피할 수 있고, 그 일 양태는, 방사선에 의한 최종 멸균법 (멸균되는 것이 최종 포장에 넣어진 상태에 있어서 방사선 조사를 실시하고, 당해 멸균 후의 미생물의 사멸을 정량적으로 측정 또는 추측할 수 있는 멸균법) 으로 멸균된 의료 기기이다.

생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 금속, 세라믹, 또는 그 양자의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된 본 발명의 의료 기기에서는, 방사선 멸균에 의한 그 단백의 생물 활성의 실활을 억제할 수 있기 때문에, 그 단백의 생물 활성을 이용하는 여러 가지 의료 기기의 제조 공정에 있어서 방사선에 의한 간편한 최종 멸균법이 적용 가능해지고, 무균적인 제조법을 회피할 수 있으므로, 대폭적인 비용 절감이 가능하다.

도 1 은, 아파타이트로 포매한 FGF-2 를 골 수복용의 티탄제 창외 (創外) 고정핀에 코팅하면, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사해도, FGF-2 의 세포 증식 활성이 유지되어, 방사선 실활로부터 방호되는 것을 나타낸 도면이다. 감마선 조사 후의 FGF-2 에 의한 세포 증식률이, 감마선 비조사의 FGF-2 에 의한 세포 증식률과 유의차가 없다.
도 2 는, 아파타이트로 코팅한 골 수복용의 티탄제 창외 고정핀에 FGF-2 를 흡착시킨 경우에는, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사하면, FGF-2 의 세포 증식 활성이 없어져, 방사선 실활로부터 방호되지 않는 것을 나타낸 도면이다. 감마선 조사 후의 FGF-2 에 의한 세포 증식률은, 감마선 비조사의 FGF-2 에 의한 세포 증식률보다 통계적 유의하게 낮다.
도 3 은, 젤라틴으로 포매한 FGF-2 를 골 수복용의 티탄제 창외 고정핀에 코팅한 경우에는, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사하면, FGF-2 의 세포 증식 활성이 없어져, 방사선 실활로부터 방호되지 않는 것을 나타낸 도면이다. 감마선 조사 후의 FGF-2 에 의한 세포 증식률은, 감마선 비조사의 FGF-2 에 의한 세포 증식률보다 통계적 유의하게 낮다.
도 4 는, 아파타이트로 포매한 FGF-2 를 코팅하고, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사할 때, FGF-2 의 세포 증식 활성이 유지되는 의료 기기의 부재로서, 이식용 세라믹스를 사용할 수 있는 것을 나타낸 도면이다. 감마선 조사 후의 FGF-2 에 의한 세포 증식률이, 감마선 비조사의 FGF-2 에 의한 세포 증식률과 유의차가 없다.
도 5 는, 아파타이트로 포매한 FGF-2 를 골 수복용의 티탄제 창외 고정핀에 코팅하고, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사할 때, 탈기하여 감마선 조사하면 FGF-2 의 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성의 소실을 억제할 수 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 6 은, 아파타이트로 포매한 FGF-2 를 골 수복용의 티탄제 창외 고정핀에 코팅하고, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사할 때, 탈기에 더하여 드라이아이스 존재하의 저온에서 감마선 조사하면 FGF-2 의 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성의 소실을 억제할 수 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 7 은, 아파타이트로 포매한 BMP-2 를 아파타이트제 디스크에 코팅하고, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사하면, BMP-2 의 Dex 존재하에서의 간엽계 줄기세포의 분화 유도능이 잔존하는 것을 나타낸 도면이다.
도 8 은, 아파타이트로 포매한 FGF-2 를 골 수복용의 티탄제 창외 고정핀에 코팅하고, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사할 때, 그 코팅에 아스코르브산염을 첨가하여 감마선 조사하면 FGF-2 의 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성의 소실을 억제할 수 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 9 는, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 코팅층, 및 FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트에 흡착시킨 코팅층을 티탄제 창외 고정핀 상에 제조하고, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사한 후에 FGF-2 의 세포 증식 활성을 비교하면, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트에 흡착시킨 코팅층보다, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 코팅층쪽이 FGF-2 의 세포 증식 활성의 소실을 억제할 수 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 10 은, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 코팅층, 및 FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트에 흡착시킨 코팅층을 인공 관절·인공골용 지르코니아 상에 제조하고, 멸균에 적합한 선량의 감마선을 조사한 후에 FGF-2 의 세포 증식 활성을 비교하면, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트에 흡착시킨 코팅층보다 FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 코팅층쪽이 FGF-2 의 세포 증식 활성의 소실을 억제할 수 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 11 은, 지르코니아 상에, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 코팅층을 제조할 때의 공침물이, 저결정성 아파타이트, 비정질 인산칼슘, 탄산칼슘을 주성분으로 하는 무기 염류 고체인 것을 나타낸 분말 X 선 회절 패턴을 나타낸 도면이다.

본 발명에 의해 제공되는 의료 기기 및 그 제조 방법은, 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 금속, 세라믹, 또는 그 양자의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된, 인간을 포함하는 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기 및 그 제조 방법으로서,

(a) 상기 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체를, 자발 핵 형성을 발생시키는 중성 또는 약알칼리성의 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의 제어된 지연 공침 또는 피복 샌드위치법 또는 건조법의 공정으로 제공하는 것이고,

(b) 상기 의료 기기를, 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선에 노출시키고, 그에 의해 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조직 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 생물 활성을 갖는 최종 멸균 의료 기기로서 제조하는 공정으로 제조되는 것이고,

(c) 상기 무기 염류가, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 및 탄산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 무기 염류이고, 또한,

(d) 상기 생물 활성을 갖는 단백이, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 및 골원성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 단백

인 것을 특징으로 하고 있다.

「포매 (embedding)」 의 용어는, 일반적으로는, 상기와 같이 병리 검사의 대상이 되는 생체 조직을 고화 가능한 액상의 파라핀이나 수지에 매립 고화시켜 생체 조직을 고정시키는 것을 의미하지만, 본 명세서에 있어서, 「포매」 란, 무기 염류 고체 중에 단백 분자 전체 또는 일부를 매입시키거나, 혹은 단백 분자 전체 또는 일부를 무기 염류 고체로 치밀하게 싸서, 단백 분자를 무기 염류 고체 중에 고정시키는 것을 의미한다. 따라서, 「포매」 는, 당해 무기 염류 고체에 단백 분자가 단순히 「흡착」 또는 「접촉」 하고 있는 상태, 혹은 「혼합」 되어 있는 상태와는 상이하다. 단백 분자가 무기 염류 고체에 「포매」 되어 있는 실례로는, 단백을 공존시킨 인산칼슘 과포화 용액으로부터, 그 단백 분자와 인산칼슘을 공침시키고, 인산칼슘의 매트릭스 중에 그 단백 분자가 나노미터 오더의 간격으로 분산되어 배치된 조성물을 들 수 있다 (비특허문헌 1).

보다 상세하게 설명하면, 본 명세서에 있어서, 「포매」 의 용어는, 무기 염류와 단백 분자의 양방 모두가 액상 중으로부터 동시에 결정화 또는 석출에 의해 고상화됨으로써, 무기 염류 고체 중에 단백 분자 전체 또는 일부를 매입시키거나, 혹은 단백 분자 전체 또는 일부를 무기 염류 고체로 치밀하게 싸서, 단백 분자를 무기 염류 고체 중에 고정시키는 것을 포함한다.

동일하게 젤라틴 등의 유기물과 단백 분자의 양방 모두가 액상 중으로부터 동시에 결정화 또는 석출에 의해 고상화됨으로써, 고체상의 유기물 중에 단백 분자 전체 또는 일부를 매입시키거나, 혹은 단백 분자 전체 또는 일부를 고체상 유기물로 치밀하게 싸서, 단백 분자를 고체상 유기물 중에 고정시키는 것도 「포매」 의 용어에 포함된다.

무엇보다, 「포매」 의 용어는, 상기의 정의를 포함하도록 가장 광의로 해석해야 하고, 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안 된다.

한편, 「흡착」 또는 「접촉」 이란, 무기 염류 혹은 젤라틴 등의 유기물을 미리 결정화 또는 석출에 의해 고상화시켜 두고, 그 후에 액상 중에 있는 단백 분자를 고체상의 무기 염류 혹은 유기물에 고정시킴으로써 얻어지는 상태이다. 그 때문에, 통상, 단백 분자가 단순히 「흡착」 또는 「접촉」 하고 있는 상태에서는, 고정화된 단백 분자는 무기 염류 고체나 고체상 유기물의 표면에 특이적으로 존재하게 된다.

또, 「혼합」 이란, 무기 염류와 단백 분자의 양방을 미리 결정화 또는 석출에 의해 고상화시켜 두고, 그 후에 양자를 접근시킴으로써 얻어지는 상태, 혹은 젤라틴 등의 유기물과 단백 분자의 양방을 미리 결정화 또는 석출에 의해 고상화시켜 두고, 그 후에 양자를 접근시킴으로써 얻어지는 상태 중 어느 것이다. 「혼합」 의 예로서, 무기 염류의 분말 입자와 단백의 분말 입자의 거시적으로 균일한 공존 상태, 및 유기물 고체 분말의 입자와 단백의 분말 입자의 거시적으로 균일한 공존 상태가 있다.

단백이 무기 염류 고체에 포매되어 있는지의 여부는, 예를 들어 면역 전자 현미경법에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 즉, 금 콜로이드나 페리틴과 같은 전자 밀도가 높은 물질 또는 그 전구 물질로 표지한 항체를 이용하여, 전자 현미경 관찰용으로 무기 염류 고체 중의 단백을 염색·가시화하면, 전자 현미경을 사용하여 단백이 무기 염류 고체에 포매되어 있는지의 여부를 확인할 수 있다. 단백이 무기 염류 고체에 포매되어 있으면, 단리한 단백이 무기 염류 고체 매트릭스 중에 분산되어 존재하고 있는 것을 확인할 수 있다 (비특허문헌 1).

본 명세서에 있어서, 무기 염류 고체는, 의료 기기로서 적합하도록 생체 적합성을 갖는 무기 염류 고체로서, 구체적으로는, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 및 탄산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 무기 염류이다.

무기 염류 고체는 결정질 무기 염류 고체 또는 비정질 무기 염류 고체 중 어느 것이어도 된다. 또, 비정질 무기 염류 고체와 결정질 무기 염류 고체가 혼재되는 상태이어도 되고, 조성이 상이한 복수의 무기 염류 고체가 혼재되는 상태이어도 된다. 결정질인지 비정질인지는, 일반적으로는 분말 X 선 회절법으로 용이하게 구별하는 것이 가능하고, 무기 염류 고체가 완전히 비정질이면, 분말 X 선 회절도에는 브로드한 1 개의 회절 할로가 출현하고, 결정질이면 복수의 회절 피크가 출현한다.

본 명세서에 있어서, 「저결정성 아파타이트」 란, 분말 X 선 회절도에 있어서 (211), (112), (300) 의 3 개의 회절선이 분리되지 않고 하나의 피크 또는 회절 할로로서 출현하는 것을 특징으로 한 저결정성을 갖는 아파타이트이다. 이들 3 개의 회절선은 결정성이 높은 아파타이트 (예를 들어, 순수한 결정성 하이드록시아파타이트) 에서는, CuKα 선으로 측정할 때에 회절각 31.8°, 32.2°, 32.9°의 위치에 3 개로 분리되어 출현한다.

인산칼슘, 탄산칼슘, 탄산수소칼슘, 인산나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 및 비정질 인산칼슘은, 다른 무기 원소나 이온단이 불순물로서 고용 (固溶) 되어 있는 것이어도 된다. 그러한 예로는, 마그네슘이 고용된 탄산칼슘, 탄산이 고용된 인산칼슘이나 인산나트륨, 아연이 고용된 인산칼슘, 칼륨이 고용된 염화나트륨 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것도 아니다. 고용되는 원소나 이온단으로는, 마그네슘, 철, 아연, 칼륨, 수소 이온, 수산화물 이온, 탄산 이온, 황산 이온, 질산 이온 등을 들 수 있고, 이들은, 포매시의 원재료에 공존시킴으로써, 무기 염류에 고용시킬 수 있다.

본 명세서에 있어서, 생물 활성을 갖는 단백으로는, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 및 골원성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 단백을 사용할 수 있다. 생물 활성을 갖는 단백은, 의료 기기가 사용되는 포유류 동물에 있어서 이물질로는 인식되지 않고, 그 포유류 동물이 생물학적으로 거절하지 않는 단백이면 된다. 예를 들어, 의료 기기가 사용되는 포유류 동물에 본래 존재하는 이들의 단백을 기초로 하여 인공적으로 조제되고, 동일한 생리 기능을 갖는 유전자 재조합체 단백이나, 물리적 혹은 화학적 처리에 의해 변성되어 있지만, 본래의 생물 활성을 잃지 않은 상태에 있는 단백 등을 포함한다. 본 명세서에 있어서 사용되는 생물 활성을 갖는 단백의 용어는 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안 되고, 가장 광의로 해석해야 한다. 생물 활성으로는, 예를 들어, 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조직 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 생물 활성을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, 의료 기기는, 인간을 포함하는 포유류 동물의 질병의 진단, 치료, 예방에 사용되는 기기를 의미하고 있고, 예를 들어, 인간을 포함하는 포유류 동물의 신체의 구조나 기능 등에 영향을 미치는 기기를 의미하고 있다. 본 명세서에 있어서, 포유류 동물은 인간 및 비인간 포유류 동물을 포함하고 있고, 비인간 포유류 동물로는, 예를 들어, 원숭이, 고양이과의 동물, 개과의 동물, 말과의 동물, 토끼과의 동물, 모르모트 등의 쥐목의 동물 등을 포함하지만, 이들의 특정한 동물에 한정되지 않는다. 일부의 의료 기기에 대해서는 정령 (政令) 에서 특정되어 있지만, 본 발명의 의료 기기는 정령에서 특정되어 있는 이외의 것, 예를 들어 마스크 등도 포함한다. 예를 들어, 페이스 메이커, 관동맥 스텐트, 인공 혈관, PTCA 카테터, 중심 정맥 카테터, 흡수성 체내 고정용 볼트, 수술용 부직포 등이 포함되지만, 이들의 특정한 양태에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 조직 수복에 사용하기 위한 의료 기기나, 관절 기능을 수복하기 위한 의료 기기, 예를 들어 인공 관절 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 천자 (穿刺) 를 포함하는 주사 이외의 외과적 침습에 의해 체내에 송달되어 유치되기 위한 의료 기기가 바람직하다. 체내의 용어에는, 예를 들어 치아도 포함된다. 유치의 기간은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 24 시간 이내의 일시적 유치 외에, 1 ∼ 30 일 정도의 단·중기적 유치 또는 30 일 이상의 장기적 유치 등이어도 된다.

본 발명의 바람직한 양태에 의해, 예를 들어, 금속제 스템, 세라믹제 골두 (骨頭), 초고분자량 폴리에틸렌제 라이너를 사용한 인공 고관절로서, 골과 직접 접촉하는 금속제 스템 부분을 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체로 코팅한 것을 들 수 있다. 또, 다른 예로는, 골 고정용의 금속제 나사로서, 나사산의 부분만을 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체로 코팅한 것, 치과용의 골내 임플란트로서, 골 및 치주 조직과 접촉하는 부분만을 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체로 코팅한 것, 척추내 고정 기구나 척추 케이지로서, 골과 접촉하는 부분만을 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체로 코팅한 것, 혹은 골 보전용의 세라믹제 인공골로서, 인공골 전체를 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체로 코팅한 것, 금속과 세라믹의 복합화물로서 인공골 전체를 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체로 코팅한 것 등을 들 수 있다. 무엇보다, 본 발명의 범위는 이들의 특정한 양태에 한정되는 것은 아니다.

생리 활성 물질을 무기염과 공침전시킴으로써, 이들을 기체에 코팅하고, 마지막 단계에서 감마선 조사를 사용하여 멸균하는 방법이 개시되어 있지만 (특허문헌 19), 이 간행물에는, 멸균 후에 생리 활성 물질의 특정한 생물 활성을 남기는 것, 또한 멸균 후에 생리 활성 물질의 특정한 생물 활성을 남기기 위한 최적인 기체에 대해서는 기재도 시사도 없다. 본 발명자들은, 고분자 재료의 기체에 코팅한 경우에는 멸균 후에 생리 활성 물질의 생물 활성이 잘 남지 않지만, 금속 또는 세라믹의 기체에 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체를 코팅함으로써, 전리 방사선 멸균 후에도 단백의 특정한 생물 활성이 고도로 잔존하는 것을 알아내었다.

세라믹은, 협의로는 인위적 열처리에 의해 만들어진 비금속 무기질 고체 재료를 의미하지만, 본 명세서에 있어서는, 의료나 의료 기기의 분야에서 이용 가능한 열처리를 가하지 않은 비금속 무기질 고체 재료도 포함하여 세라믹이라고 부른다. 본 명세서에 있어서, 세라믹은, 비금속 무기질 고체 재료이면 되고, 인위적 열처리에 의해 조제된 것, 또는 열처리 없음으로 조제된 것 등, 임의의 조제 방법으로 얻어진 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 양태로서 예를 들어, 생물 활성을 갖는 단백 뿐만 아니라, 추가로 다당류, 바람직하게는 헤파린도 포매하고 있는 무기 염류 고체가, 이식용 금속, 이식용 세라믹, 또는 그 양자의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된 구성체를 포함하는 의료 기기 및 그 제조 방법이 제공된다. 헤파린을 일례로 하는 세포외 기질 유래의 다당류는 그 자신은 직접적인 세포 증식 분화 활성을 갖지 않는 생체 고분자이지만, 생물 활성을 갖는 단백의 생물 활성의 유지에 도움이 되므로 가치가 높다.

본 발명의 바람직한 양태로서 예를 들어, 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 티탄, 티탄 합금, 스테인리스, 코발트 크롬 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는 이식용 금속의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된 구성체를 포함하는 의료 기기 및 그 제조 방법이 제공된다. 티탄, 티탄 합금, 스테인리스, 코발트 크롬 합금은 생체 적합성이 높은 금속으로서 정형 외과나 치과에서 범용되기 때문에, 정형 외과나 치과 분야의 의료 기기로서 가치가 높다.

본 발명의 더욱 바람직한 다른 형태로서, 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 및 이들의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 이식용 세라믹의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된 의료 기기 및 그 제조 방법이 제공된다. 상기의 이식용 세라믹에는, 알루미나 및/또는 지르코니아 등이 포함되어 있어도 된다. 이들의 세라믹도 생체 적합성이 높은 재료로서, 정형 외과나 치과에서 범용되기 때문에, 정형 외과나 치과 분야의 의료 기기로서 가치가 높다. 이들 세라믹에는, 다른 무기 원소나 이온단이 불순물로서 고용되어 있는 것도 포함된다. 그러한 예로는, 탄산이나 규소가 고용된 아파타이트, 규소가 고용된 인산삼칼슘, 마그네슘이 고용된 비정질 인산칼슘, 이트륨이 고용된 지르코니아 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 복합체의 예로는, 아파타이트와 인산삼칼슘으로 이루어지는 2 상성 세라믹이나 알루미나와 지르코니아의 복합 세라믹을 예시할 수 있지만, 이들의 특정한 양태에 한정되지 않는다.

생물 활성을 갖는 단백이 포매된 무기 염류 고체를 포함하는 상기 의료 기기는, 그 생물 활성 단백의 활성을 실질적으로 유지한 채로, 멸균에 적합한 충분한 전리 방사선 선량으로 조사하여 멸균할 수 있고, 최종 멸균된 의료 기기로 하는 것이 가능하다.

멸균을 위해서 사용하는 전리 방사선으로는, 감마선 및/또는 전자선이 바람직하다. 물질을 투과하기 쉬운 감마선을 이용하면, 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체이어도 용이하게 멸균할 수 있다. 무기 염류 고체에 포매된 단백 중, 고체 표면에 노출되어 있는 부분 등에 대해서는, 당업자에게 주지된 방법에 의해, 전자선 조사에 의해 멸균할 수도 있다. 그 의료 기기의 전체를 먼저 적절히 포장하여 밀봉 상태로 한 후에, 당업자에게 주지된 방법으로 감마선 또는 전자선 조사하면, 멸균된 의료 기기를 밀봉 내포하는 제품을 얻을 수 있고, 무균적으로 밀봉 포장된 의료 기기로서 의료 현장에 제공하는 것이 가능해진다 (비특허문헌 17). 무엇보다, 본 발명의 양태는 이들의 특정한 양태에 한정되는 것은 아니다.

멸균에 필요한 선량은, 전형적으로는, 무균성 보증 수준 (SAL : Sterility Assurance Level) 10^-6 을 담보할 때에 필요한 최저 선량이면 된다. 이 무균성 보증 수준은, ISO (ISO 11137-1, 1137-2), JIS (JIS T 0806-1, 0806-2) 등의 규격으로 정해져 있고, 미국의 FDA 나 본방 (本邦) 의 PMDA (의약품 의료 기기 종합 기구) 등의 각국의 규제 당국에서 채용되고 있다.

멸균을 위해서 감마선을 사용하는 경우, 무균성 보증 수준 10^-6 을 담보하여 본 발명의 의료 기기를 멸균하기 위한 선량으로서, 예를 들어 10 ∼ 40 kGy 정도, 바람직하게는 15 ∼ 30 KGy 의 선량을 선택할 수 있다. 무균성 보증 수준을 달성하는 방사선 선량으로서 약 25 kGy 가 바람직한 경우도 있다. 무엇보다, 이들의 특정한 방사선 선량에 한정되지 않는다.

본 발명의 더욱 바람직한 일 형태로서, 감마선 및/또는 전자선으로의 멸균 공정에 있어서 라디칼 발생을 억제하기 위해, 대기압 50 ㎪ 이하, 바람직하게는 50 ㎩ 미만, 더욱 바람직하게는 20 ㎩ 이하의 탈기 상태로 멸균을 실시할 수 있다. 혹은, 대기를 질소나 불활성 가스로 치환한 상태로 멸균을 실시하는 것도 바람직하다. 또한 0 ℃ 내지 -196 ℃, 바람직하게는 -20 ℃ 내지 -80 ℃, 더욱 바람직하게는 드라이아이스 공존하에 있어서의 -20 ℃ 내지 -80 ℃ 의 저온에서의 멸균이 바람직한 경우도 있다. 혹은, 단백을 포매한 무기 염류 고체에 아스코르브산이나 아스코르브산염을 첨가하고 나서의 멸균이 바람직한 경우도 있다. 아스코르브산이나 아스코르브산염을 균일하게 분산시켜 첨가시키기 위해서는, 5 - 50 mM, 바람직하게는 10 - 30 mM 의 아스코르브산이나 아스코르브산염의 용액에 침지시켜 건조시킴으로써 달성할 수 있지만, 그것들에 한정되는 것도 아니다.

다른 관점에서, 본 발명의 바람직한 일 형태로서, 시상하부 유래 펩티드 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 인터메딘, 성선 자극 호르몬, 성장 호르몬, 파라타이로이드 호르몬, 인히빈, 액티빈, 릴랙신, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 콜레시스토키닌, 세크레틴, 모틸린, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 에리트로포에틴, 렙틴, 엔도셀린, 그렐린, 아디포넥틴, 인슐린형 성장 인자, 및 칼시토닌 유전자 관련 펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 호르몬이 포매된 무기 염류 고체를 포함하는, 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기 및 그 제조 방법이 제공된다.

또, 다른 바람직한 일 양태로서, 성장 인자로서 FGF-2 (선유아 세포 성장 인자-2) 가 포매된 무기 염류 고체를 포함하는, 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기 및 그 제조 방법이 제공된다. FGF-2 는, 연조직 재생, 혈관 형성, 골 형성에 유용한 성장 인자이기 때문에, 이와 같은 의료 기기는, 조직 재생을 촉진하는 용도에 유용하다.

또 다른 바람직한 일 형태로서, 골원성 단백으로서, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, DPP, Vg1, Vgr-1, 및 그들의 기능적 등가물로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 골원성 단백이 포매된 무기 염류 고체를 포함하는, 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기 및 그 제조 방법이 제공된다. 이와 같은 의료 기기는, 골 재생을 촉진하는 용도에 유용하다.

또 다른 관점에서는, 본 발명의 바람직한 일 형태로서, 생물 활성을 갖는 단백의 생물 활성이, 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 및 아고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 생물 활성인 의료 기기 및 그 제조 방법이 제공된다. 단백이나 의료 기기에 이들의 생물 활성이 있는 것은, 세포 배양에 있어서의 세포수, 분화 마커, 산생 물질, 유전자 발현, 세포 형태, 혈관형 구조 형성 등의 세포 집합 형태로 평가하는 것이 가능하다. 동물 실험에 있어서는, 조직 표본을 사용한 조직 형태 관찰, X 선이나 MRI 등의 조직 화상, 유전자 발현 등으로 평가하는 것이 가능하다. 생물 활성을 갖는 단백이 항원이나 아고니스트 혹은 안타고니스트로서 작용하는 경우에는, 단백의 생물 활성 부위에 관여하는 모노클로날 항체나 표지된 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯 등의 각종 방법으로 평가할 수 있다. 생물 활성을 갖는 단백이 항체인 경우에는, 미리 항체를 표지하고 나서 항원과 결합시키고, 표지 물질의 활성이나 양을 사용하여, 항원과 결합한 항체의 양이나 결합 활성을 평가함으로써 생물 활성을 평가하는 것이 가능하다. 생물 활성을 갖는 단백이 효소인 경우에는, 효소 기질을 사용하여, 효소에 의한 효소 기질로부터의 반응 생성물을 평가하는 방법에 의해 생물 활성을 평가할 수도 있다. 무엇보다, 평가하고자 하는 특정한 생물 활성에 따른 평가법이면 이들에 한정되는 것도 아니다. 어느 평가법이어도, 예를 들어, 단백을 포함하는 무기 염류 고체의 군과 단백이 포함되지 않는 무기 염류 고체의 군 사이에서 특정한 생물 활성을 비교함으로써, 그 단백이나 의료 기기의 생물 활성이 있는 것을 검증할 수 있다. 양 군의 생물 활성의 비교에 사용하는 샘플은, 단백 함유와 불함유의 무기 염류 고체, 의료 기기, 이식편을 직접 사용해도 되고, 적절한 추출액을 사용하여 무기 염류 고체를 용해시켜 단백을 추출한 추출액을 사용해도 된다.

상기 서술한 생물 활성과 그 평가법을 이용하여 정량 평가하는 수법은, 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선에 의해 멸균된 후의 의료 기기의 생물 활성을 평가하기 위해서 사용할 수 있다. 본 발명의 의료 기기는, 무균성 보증 수준 10^-6 을 담보하는 멸균 후에, 적어도 멸균 전의 약 13 ％ 이상, 바람직하게는 65 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 70 ％ 이상의 생물 활성을 가지고 있다.

생물 활성을 갖는 단백을 무기 염류 고체에 포매하는 바람직한 방법으로서 예를 들어, 염화나트륨 용액, 인산나트륨 용액, 탄산 이온 함유 칼슘 용액, 탄산나트륨 용액, 또는 탄산수소나트륨 용액을 사용한 공침 석출법, 피복 샌드위치법, 또는 건조법을 채용할 수 있다.

공침 석출법은, 원하는 무기 염류 과포화 용액 중에 원하는 생물 활성 단백을 공존시켜 두고, 그 과포화 용액으로부터 그 무기 염류의 결정 또는 비정질 고체를 석출시킬 때, 그 단백을 포착하면서, 혹은 그 단백 분자를 무기 염류 고체로 치밀하게 싸면서 석출시킴으로써 포매하는 방법이다. 이 공침 석출은, 그 단백을 포매한 무기 염류의 결정 또는 아모르퍼스 고체가 별종의 고체 표면을 코팅하도록 석출시키는 방법이기도 하다.

피복 샌드위치법은, 원하는 무기 염류 고체 표면에 원하는 생물 활성 단백을 흡착 또는 접촉시켜 두고, 그 표면을 생물 활성 단백을 포매한 동종 혹은 별종의 무기 염류 고체로 피복하는 방법이다. 그 밖의 방법으로서 건조법을 들 수 있고, 예를 들어 원하는 무기 염류 용액 중에 원하는 생물 활성 단백을 용해시켜 두고, 그 용액을 동결 건조 또는 농축 건조시킴으로써 그 단백을 무기 염류 고체로 치밀하게 포매할 수도 있다. 이들의 방법을 단독으로 채용해도 되지만, 2 종 이상을 적절히 조합해도 되고, 필요에 따라 적절한 횟수 반복해도 된다. 이들의 방법을 채용함으로써, 바람직하게는, 원하는 생물 활성 단백을 방사선 멸균으로부터 방호할 수 있는 상태에서, 무기 염류 고체 포매 단백 조성물의 층을 복수층 배치할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 생물 활성 단백을 포매하는 무기 염류 고체는, 용액으로부터의 침전 또는 용액 중에 현탁 상태로서 얻어지지만, 전술한 바와 같이 이식용 금속이나 이식용 세라믹을 코팅하는 층으로서도 얻을 수 있고, 적절히, 용액으로부터의 분리나 건조를 실시할 수 있다.

생물 활성을 갖는 단백을 무기 염류 고체에 포매하는 바람직한 방법으로서, 중성 또는 약알칼리성 용액을 사용한 자발 핵 형성을 발생시키는 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서, 생물 활성을 갖는 단백과 인산칼슘의 제어된 지연 공침을 실시하는 공침 석출법 또는 피복 샌드위치법을 채용할 수 있다. 단백 함유의 고농도 인산칼슘 용액에 있어서, 인산칼슘의 자발 핵 형성, 결정화, 또는 침전 생성을 억제하여 고농도인 상태의 용액으로서 안정화시켜 두고, 원하는 시점에서 단백과 인산칼슘을 공침시키기 위한 방법으로서, 탄산 가스의 버블링이나 산의 첨가로 pH 를 낮추어 과포화도를 저하시켜 완전 용해시킨 후, 탄산 가스의 탈가스나 알칼리의 첨가나 수분자의 전기 화학적 환원에 의한 OH^- 이온 생성으로 pH 를 서서히 상승시켜 과포화도를 높여, 인산칼슘을 서서히 결정화시킴으로써 단백과의 공침을 일으키는 방법이 알려져 있다 (특허문헌 19, 특허문헌 25, 특허문헌 26, 특허문헌 27, 특허문헌 33). 이 방법에서는, 산성으로 완전 용해시킨 자발 핵 형성을 발생시키지 않는 안정 인산칼슘 과포화 용액의 pH 를 상승시켜, 과포화도를 높임으로써 공침을 일으키고 있다고 생각된다.

그러나, 많은 단백은, 산성 pH 나 고알칼리 pH 에서는 변성되어 활성을 잃는다는 문제가 있다. 이 문제를 회피하기 위해서, 자발 핵 형성을 발생시키는 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, 즉석에서 침전을 대량 형성하는 중성 또는 약알칼리성의 고농도 인산칼슘 용액에 K 이온이나 Na 이온을 다량으로 첨가한 용액을 조제하여, 결정화의 활성화 에너지를 높게 하고, 이로써 핵 형성 빈도를 줄여 결정화까지의 시간을 지연시켜 두고, 인산칼슘을 서서히 결정화시켜 단백과의 공침을 일으킬 수 있다. 이 방법은, 용액의 과포화도를 조정하는 것이 아니라, 결정화의 활성화 에너지를 바꿈으로써 생물 활성을 갖는 단백과 인산칼슘의 제어된 지연 공침을 실시하는 방법이고, 보다 구체적으로는, 인산칼슘 농도, pH, 및 과포화도에 관계 없는 KCl 농도를 조절하여, 자발 핵 형성까지의 시간을 제어하여 연장시킴으로써 지연 공침을 실시할 수 있다.

예를 들어, 상기의 지연 공침은, 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, Ca 이온 0.5 ∼ 2.5 mM, 인산 이온 1.0 ∼ 20 mM, K 이온 0 ∼ 40 mM, Na 이온 0 ∼ 200 mM, Cl 이온 0 ∼ 200 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액, 바람직하게는 Ca 이온 1.2 ∼ 2.75 mM, 인산 이온 0.6 ∼ 15 mM, K 이온 0 ∼ 30 mM, Na 이온 30 ∼ 150 mM, Mg 이온 0.1 ∼ 3.0 mM, Cl 이온 30 ∼ 150 mM, HCO₃ 이온 0 ∼ 60 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액을 사용하고, 그 수용액의 KCl 농도를 제어함으로써, 인산칼슘 석출까지의 시간을 인공적으로 제어 지연시킴으로써 실시하는 것이 바람직하다. Mg 이온이나 HCO₃ 이온은 인산칼슘 결정화의 인히비터이므로, K 이온이나 Na 이온에 더하여 Mg 이온과 HCO₃ 이온을 첨가한 불안정 인산칼슘 과포화 용액에서는, 또한 인산칼슘 석출까지의 시간을 인공적으로 제어 지연시킬 수 있다 (특허문헌 29).

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예에 한정되지 않는다. 본 실시예에 있어서의 용어나 개념은, 당해 분야에 있어서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 기초하는 것이며, 본 발명을 실시하기 위해서 사용하는 기술은, 특히 그 출전을 명시한 기술을 제외하고는, 공지된 문헌 등에 기초하여 당업자이면 용이하고 또한 확실하게 실시 가능하다. 또, 각종 분석 등은, 사용한 분석 기기 또는 시약, 키트의 취급 설명서, 카탈로그 등에 기재된 방법을 사용하여 실시하고 있다.

예 1 : FGF-2 를 포매한 아파타이트로 코팅한 창외 고정핀의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성

세포 증식 활성이 있는 FGF-2 를 포매한 무기 염류 고체로, 골절 고정에 사용되는 티탄제 체내 고정용 핀을 코팅하고, 전체를 전리 방사선 멸균한 후에 FGF-2 에 세포 증식 활성이 있는지의 여부를 검토하였다.

Ca 이온 4.89 mM, 인산 이온 1.28 mM, K 이온 6.13 mM, Na 이온 138.8 mM, Mg 이온 0.23 mM, Cl 이온 136.6 mM, HCO₃ 이온 15.09 mM 을 포함하고 pH 가 7.8 이고, 그대로 37 ℃ 에서 방치해도 4 - 5 시간 정도에서 자발 핵 형성으로 인산칼슘이 결정화되는 불안정 인산칼슘 과포화 용액을 사용하였다 (이 불안정 인산칼슘 과포화 용액은 특허문헌 19 의 액과는 상이한 것이다). 이 불안정 인산칼슘 과포화 용액에 4 ㎍/㎖ 및 0 ㎍/㎖ 의 농도로 선유아 세포 성장 인자-2 (FGF-2) 를 첨가하였다. 거기에 티탄제 체내 고정용 핀 (신세스사 셀 드릴 4.0/3.0 ㎜Ti, 20 ㎜ - 80 ㎜) 을 37 ℃ 에서 48 시간 침지시키고, FGF-2 를 아파타이트와 함께 공침시켜 코팅함으로써, 공침 아파타이트 FGF-2 (공침 ApFGF) 핀을 6 또는 8 개 제조하였다. 동일하게 FGF-2 불함유의 불안정 인산칼슘 과포화 용액을 사용하여 Ap 핀을 6 또는 8 개 제조하였다. 제조한 공침 ApFGF 핀은 튜브에 넣고 12.4 ㎩ 로 2 시간, 실온에서 진공 건조를 실시하였다. 건조 후 바로 핀이 들어있는 튜브의 뚜껑을 닫고, 가스 차단성의 보존 봉투, 산소 흡수제, 합성 제올라이트 건조제에 의해 구성되는 무산소·건조 보존 시스템 (I·S·O 사) 을 이용하여 포장하였다.

이들의 ApFGF 핀의 반수를 ⁶⁰Co 를 방사선원으로 하여 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하였다. 조사는 상온에서 실시하고, 수송 기간을 포함하여 4 ℃ 에서 보관하였다. γ 선 비조사의 공침 ApFGF 핀은 4 ℃ 에서 보관하였다. γ 선 조사와 비조사의 공침 ApFGF 핀에 담지된 FGF-2 의 세포 증식 활성을 평가하기 위해서, 핀을 10 mM 시트르산나트륨 용액에 30 분간 담가서 용해시켰다. 컨트롤로서 FGF-2 불함유의 Ap 핀도 10 mM 시트르산나트륨 용액에 30 분간 담가서 코팅층을 용해시켰다. 용해액 중의 칼슘은 세포 증식을 촉진하기 때문에, ICP 발광 분광 분석을 실시한 후, 샘플간의 칼슘 농도를 균일하게 하여 마우스 선유아 세포주 NIH3T3 에 첨가하고, 증식률을 Cell Counting Kit-8 을 사용하여 측정하였다. FGF-2 불함유의 Ap 핀을 컨트롤로 하여 그 증식률을 1 로 하고, 증식률이 통계적 유의하게 높은 공침 ApFGF 핀은 「활성 있음」 으로 판단하였다. 공침에 의한 코팅, 진공 건조, γ 선 조사 비조사, 증식률 측정의 조작을 4 회 반복 시행하였다.

표 1 에 4 회의 반복 시행으로 「활성 있음」 으로 판단된 공침 ApFGF 핀의 개수를 나타낸다. 또 도 1 에 측정된 증식률의 값을 나타낸다.

표 1 에 나타낸 바와 같이, 4 회의 반복 시행에 있어서, 공침 ApFGF 핀의 γ 선 조사군에서 10/13 개, 비조사군에서 10/13 개가 세포 증식 활성 있음으로 판정되고, 세포 증식 활성이 있던 핀은 γ 선 조사군과 비조사군에서 동수였다. 또, 도 1 에 나타내는 바와 같이, 공침 ApFGF 핀에 있어서, γ 선 조사군도 비조사군도 Ap 핀의 약 1.5 배의 증식률을 나타내고, γ 선 비조사군의 증식률은 Ap 핀의 증식률 (증식률 = 1) 에 대해 통계적으로 유의하게 높고 (p = 0.021), γ 선 조사군의 증식률과 Ap 핀의 증식률 (증식률 1) 의 차는 매우 유의 수준에 가까운 레벨이었다 (p = 0.058). 조사군과 비조사군의 증식률 사이에는 유의차 (p = 0.436) 는 관찰되지 않았다. 즉, FGF-2 를 아파타이트로 포매한 조성물을, 이식용 금속인 티탄제 체내 고정핀에 코팅했을 경우, 포매에 의해 단백이 전리 방사선 멸균 내성을 획득하는 것, 바꾸어 말하면 아파타이트에 의한 포매가 생물 활성 단백에 대해 방사선 방호 작용을 나타내는 것이 판명되었다. 또한, 25 ± 0.5 kGy 의 감마선 조사의 조건으로 아파타이트에 의한 포매가 생물 활성 단백에 대해 방사선 방호 작용을 나타냈으므로, 25 ± 0.5 kGy 미만의 감마선 조사에 대해서도 당연히 방사선 방호 작용이 발휘되는 것은 말할 필요도 없다.

예 2 : FGF-2 를 흡착한 아파타이트로 코팅한 창외 고정핀의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성

세포 증식 활성이 있는 FGF-2 를 흡착한 무기 염류 고체로, 골절 고정에 사용되는 티탄제 체내 고정용 핀을 코팅하고, 전체를 전리 방사선 멸균한 후에 FGF-2 에 세포 증식 활성이 있는지의 여부를 검토하였다.

예 1 과 동일한 불안정 인산칼슘 과포화 용액을 사용하여 FGF-2 불함유의 과포화 인산칼슘 용액을 조제하고, 그것에 6 또는 8 개의 티탄제 체내 고정용 핀 (신세스사 셀 드릴 4.0/3.0 ㎜Ti, 20 ㎜ - 80 ㎜) 을 37 ℃ 에서 48 시간 침지시키고, 표면에 아파타이트를 코팅한 Ap 핀을 제조하였다. 이 Ap 핀을 12 ㎍/㎖ 의 FGF-2 를 함유하는 과포화 인산칼슘 용액에 수 초 침지시키고 -18 ℃ 에서 동결시키며, FGF-2 를 흡착한 아파타이트로 코팅한 흡착 아파타이트 FGF-2 (흡착 ApFGF) 핀을 제조하였다. 예 1 과 완전히 동일한 조건으로 실온에서 진공 건조, γ 선 조사 비조사, 보관, 세포 증식 활성 평가를 실시하였다. FGF-2 를 흡착한 아파타이트에 의한 코팅, γ 선 조사 비조사, 증식률 측정의 조작을 5 회 반복 시행하였다.

표 2 에 5 회의 반복 시행으로 「활성 있음」 으로 판단된 흡착 ApFGF 핀의 개수를 나타낸다. 또 도 2 에 측정된 증식률의 값을 나타낸다.

표 2 에 나타낸 바와 같이, 5 회의 시행에 있어서, 흡착 ApFGF 핀의 γ 선 조사군에서 2/16 개, 비조사군에서 11/16 개가 세포 증식 활성 있음으로 판정되고, γ 선 조사군에서 세포 증식 활성이 있던 핀의 수는 비조사군의 약 1/5 이었다. 양 군에서 카이 제곱 검정을 실시한 결과, γ 선 조사군과 비조사군 사이에서 유의차 (p = 0.001) 가 관찰되었기 때문에, 흡착 ApFGF 핀은 γ 선 조사 멸균에 의해 FGF-2 의 생물 활성을 소실하는 것이 분명해졌다. 또, 도 2 에 나타내는 바와 같이, 흡착 ApFGF 핀에 있어서, 비조사군은 Ap 핀의 약 1.7 배 (p = 0.003) 의 증식률을 나타내지만, γ 선 조사군은 Ap 핀의 1.1 배의 증식률까지 감소하여 Ap 핀과 유의차는 관찰되지 않고 (p = 0.087), γ 선 조사에 의해 FGF-2 의 세포 증식 활성이 유의 (p = 0.0004) 하게 약 35 ％ 정도 소실되어 있는 것을 알 수 있었다. 한편, 전술한 도 1 에 나타내는 바와 같이, 공침 ApFGF 핀에 있어서는, γ 선 조사군도 비조사군도 Ap 핀의 약 1.5 배의 증식률을 나타내고, 조사군과 비조사군의 유의차 (p = 0.436) 는 관찰되지 않았다. 즉, 특허문헌 12, 13, 17 에는 생물 활성을 갖는 단백과 무기 염류를 조합한 조성물을 방사선 멸균하는 것이 기재되어 있지만, 조합의 양태로는, 「혼합」, 「흡착」, 「접촉」, 「포매」 등의 양태가 있고, 조합 양태가 다르면 최종 멸균 후의 단백의 생물 활성에 큰 차이가 생기는 것, 및 「포매」 라는 양태에 있어서 단백의 생물 활성을 높은 효율로 유지할 수 있는 것을 알 수 있었다.

예 3 : FGF-2 를 포매한 젤라틴으로 코팅한 창외 고정핀의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성

4 ㎍/㎖ 의 FGF-2 를 함유하는 1 ％ 젤라틴 용액에 예 1 과 동일한 티탄제 체내 고정용 핀을 수 초간 침지시키고, -18 ℃ 에서 동결시키며, FGF-2 를 포매한 젤라틴으로 코팅한 핀을 제조하였다 (젤라틴 FGF). 예 1 과 완전히 동일한 조건으로 실온에서 진공 건조, γ 선 조사 비조사, 보관, 세포 증식 활성 평가를 실시하였다. FGF-2 를 포매한 젤라틴에 의한 코팅, γ 선 조사 비조사, 증식률 측정의 조작을 4 회 반복 시행하였다.

표 3 에 4 회의 반복 시행으로 「활성 있음」 으로 판단된 젤라틴 FGF 핀의 개수를 나타낸다. 또 도 3 에 측정된 증식률의 값을 나타낸다.

표 3 에 나타낸 바와 같이, 4 회의 시행에 있어서, FGF-2 를 포매한 젤라틴으로 코팅한 젤라틴 FGF 핀의 γ 선 조사군에서 13/13 개, 비조사군에서 13/13 개가 세포 증식 활성 있음으로 판정되고, 세포 증식 활성이 있던 핀은 γ 선 조사군과 비조사군에서 동수였다. 그러나, 도 3 에 나타내는 바와 같이, 젤라틴 FGF 핀에 있어서, 비조사군은 Ap 핀의 약 12 배의 증식률을 나타내지만, γ 선 조사군은 Ap 핀의 약 8 배의 증식률로 감소하고, γ 선 조사에 의해 FGF-2 의 세포 증식 활성이 통계적 유의 (p = 0.011) 하게 약 30 ％ 정도 소실되어 있는 것을 알 수 있었다. 즉, 생물 활성을 갖는 단백을 포매하는 매트릭스가 젤라틴과 같은 유기물인 경우에는, 무기 염류 고체로 포매하는 예 1 도 1 의 경우와는 달리, 방사선 방호 작용이 작은 것을 알 수 있었다. 특허문헌 18 에는, 생물 활성이, 무기, 유기 또는 유기 및 무기 물질을 포함하는 캐리어의 매트릭스 내에 삽입되고, 합성 후에 멸균되는 캐리어가 기재되어 있지만, 무기, 유기 또는 유기 및 무기 물질을 포함하는 캐리어의 매트릭스가, 어떠한 조합이나 재질시에, 생물 활성이 멸균 후에도 유지되거나, 혹은 어떠한 멸균법일 때에 생물 활성이 멸균 후에도 유지되는가 하는 점에 대해서는 기재되어 있지 않다. 본 발명의 실시예는, 생물 활성을 갖는 단백을 무기 염류 고체의 매트릭스 내에 포매하는 경우에는, 유기의 매트릭스 내에 삽입하는 경우보다, 훨씬 우수한 방사선 방호 작용을 나타내는 것을 해명하고 있다. 아마, 유기물은 무기 염류 고체와 달리, 방사선 조사에 의한 라디칼 생성이 많기 때문은 아닐까 생각된다.

예 4 : FGF-2 를 포매한 아파타이트로 코팅한 인공골용 아파타이트 세라믹의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성

폴리비닐알코올을 3 ％ 함유하는, 입경 70 미크론 이하의 수산 아파타이트 분말을, 프레스 성형하여 1150 ℃, 1 시간 소결하여, 치밀질의 아파타이트제 디스크 (타원 직경 5 ㎜ X 폭 3 ㎜ X 두께 1 ㎜) 를 제조하였다. 이 제조 방법은, 인공골용의 아파타이트 세라믹의 제조법과 본질적으로 동일하다. 이 아파타이트제 디스크 상에, 예 1 과 동일한 방법으로 공침 ApFGF 를 코팅, 진공 건조, γ 선 조사를 실시한 후에, NIH3T3 세포를 디스크 상에서 배양하여 세포 증식률을 측정하였다. 디스크 상에서 NIH3T3 세포를 직접 배양하는 경우에는, 단백의 영향으로 세포의 접착성이 변화하기 때문에, 컨트롤로서의 비조사군의 아파타이트제 디스크는, FGF-2 대신에 우혈청 알부민 (BSA) 을 첨가한 불안정 인산칼슘 과포화 용액에 침지시켜, ApBSA 를 코팅하였다. 코팅, γ 선 조사 비조사, 증식률 측정의 조작을 3 회 반복 시행하였다.

표 4 에 3 회의 반복 시행으로 「활성 있음」 으로 판단된 공침 ApFGF 아파타이트제 디스크의 개수를 나타낸다. 또 도 4 에 측정된 증식률의 값을 나타낸다.

표 4 에 나타낸 바와 같이, 3 회의 반복 시행에 있어서, 공침 ApFGF 아파타이트제 디스크의 γ 선 조사군에서 18/18 개, 비조사군에서 18/18 개가 세포 증식 활성 있음으로 판정되고, 세포 증식 활성이 있던 아파타이트제 디스크는 γ 선 조사군과 비조사군에서 동수였다. 또, 도 4 에 나타내는 바와 같이, 공침 ApFGF 아파타이트제 디스크에 있어서, γ 선 조사군도 비조사군도 Ap 핀의 약 1.4 배의 증식률을 나타내고, 조사군과 비조사군의 유의차 (p = 0.415) 는 관찰되지 않았다. 즉, FGF-2 를 아파타이트로 포매한 조성물을, 이식용 세라믹에 코팅했을 경우에도, 이식용 금속에 코팅했을 경우와 동일하게, 포매에 의해 단백이 전리 방사선 멸균 내성을 획득하는 것, 바꾸어 말하면 아파타이트에 의한 포매가 생물 활성 단백에 대해 방사선 방호 작용을 나타내는 것이 판명되었다.

예 5 : FGF-2 를 포매한 아파타이트로 코팅한 폴리머의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성

폴리머인 폴리에테르에테르케톤 (PEEK) 제 환봉 (직경 6 ㎜ X 길이 8 ㎝) 을 사용하여, 예 1 과 동일한 조건으로 공침 ApFGF 를 표면에 코팅, 진공 건조, γ 선 조사 비조사, 보관, 세포 증식률 측정을 실시하였다. 폴리에테르에테르케톤은 이식용으로 사용되는 폴리머이다.

표 5 에 3 회의 반복 시행으로 「활성 있음」 으로 판단된 공침 ApFGF-PEEK 제 환봉의 개수를 나타낸다.

표 5 에 나타낸 바와 같이 3 회의 시행에 있어서, 공침 ApFGF-PEEK 환봉의 γ 선 조사군에서 6/9 개, 비조사군에서 9/9 개가 세포 증식 활성 있음으로 판정되고, γ 선 조사군에서 세포 증식 활성이 있던 핀의 수는 비조사군의 2/3 이었다. 공침 ApFGF-PEEK 환봉은 γ 선 조사 멸균에 의해 FGF-2 의 생물 활성을 소실하는 것이 분명해졌다. 특허문헌 19 에는 칼슘, 마그네슘, 인산, 탄산수소 이온 및 생물 활성 물질을 포함하는 식염수 혼합물을 포함하는, 산성화된 조성물에 기체를 접촉시켜, pH 를 증가시킴으로써, 염과 생물 활성 물질의 공침을 발생시켜, 코팅된 기체를 얻는 방법이 기재되어 있다. 청구항에 기재된 발명에서는 언급하고 있지 않지만, 본문 중에는, 마지막 공정 후에 감마선 조사를 실시하는 것도 가능하다고 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 실시예는, 생물 활성을 갖는 단백을 이식용 폴리머 상에 공침 코팅하는 경우에는 충분한 방사선 방호 작용을 달성할 수 없고, 이식용 금속이나 세라믹 상에 공침 코팅한 쪽이, 훨씩 우수한 방사선 방호 작용을 나타내는 것을 해명하고 있다. 아마, 폴리머는 금속이나 세라믹과 달리, 방사선 조사에 의한 라디칼 생성이 많기 때문은 아닐까 생각된다.

예 6 : 방사선 멸균시의 분위기가 무기 염류 고체에 포매된 단백의 생물 활성에 미치는 영향

이식용 금속인 창외 고정용 티탄핀에 예 1 과 동일한 조건으로 FGF-2 를 포매한 아파타이트를 코팅하고 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하고, γ 선 조사시의 분위기가, 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성을 갖는 FGF-2 에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하였다.

예 1 과 동일하게 티탄제 체내 고정용 핀을 사용하여 공침 ApFGF 핀을 제조하여 밀봉 포장하였다. 그 때, (i) 예 1 과 동일한 무산소·건조 포장, (ii) 탈기 포장, (iii) 질소 충전 포장의 3 종류의 분위기 조건을 적용하였다. 탈기는 29.2 ㎪ 로 5 초간의 진공 탈기 처리로 실시하였다. 질소 치환은 고순도 질소 가스를 유입시켜 실시하였다. 그 후, 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사를 실시하였다. 예 1 과 동일한 무산소·건조 포장으로, γ 선 비조사의 공침 ApFGF 핀 (비조사군) 을 컨트롤로 하였다. γ 선 조사·비조사의 공침 ApFGF 핀을 10 mM 시트르산나트륨 용액에 30 분간 담가서 코팅층을 용해시키고, 항 FGF-2 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 핀에 담지되어 있는 FGF-2 를 검출하였다. 용해액은 동결 건조에 의해 20 배 농축하고 나서 웨스턴 블롯에 제공하였다. 항체는 FGF-2 의 생물 활성에 관여하는 인간 FGF-2 마우스 모노클로날 항체 (Thermo Fisher 사) 를 사용하였다. 취득한 화상 데이터는 Imge Lab (Bio-Rad 사) 을 사용하여, 17 kDa (FGF-2 분자량 : 17,000) 의 위치에 검출된 시그널 강도를 정량하여 비교하였다.

비조사군에서는 17 kDa 의 위치에 밴드의 시그널이 명확하게 검출되었다. 컨트롤인 비조사군의 시그널 강도를 100 ％ 로 하면, 조사군의 시그널 강도는, (i) 예 1 과 동일한 무산소·건조 포장으로 조사한 경우가 13 ％, (ii) 탈기 포장으로 조사한 경우가 19 ％, (iii) 질소 충전 포장으로 조사한 경우에는 14 ％ 이었다 (도 5). 따라서, 탈기 상태 또는 질소 분위기하에서의 γ 선 조사는, 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성을 갖는 FGF-2 의 감소를 억제하고, 특히 탈기 상태는 질소 분위기하와 비교하여, γ 선 조사에 있어서의 FGF-2 의 방호 작용이 높은 것이 분명해졌다. 또한, 무산소·건조 포장에서의 조사에 있어서, 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성을 갖는 FGF-2 가 13 ％ 로 감소해도, 예 1 에 기재된 바와 같이, FGF-2 의 세포 증식 활성은 비조사군과 동등하다.

예 7 : 방사선 멸균시의 온도가 무기 염류 고체에 포매된 단백의 생물 활성에 미치는 영향

이식용 금속인 창외 고정용 티탄핀에 예 1 과 동일한 조건으로 FGF-2 를 포매한 아파타이트를 코팅하고 실온 및 저온에서 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하고, γ 선 조사시의 온도가, FGF-2 의 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하였다.

예 1 과 동일하게 티탄제 체내 고정용 핀을 사용하여 공침 ApFGF 핀을 제조하고, 예 6 과 동일한 탈기 포장으로 밀봉 포장하였다. 저온에서 γ 선 조사하는 핀은 약 3.8 ㎏ 의 드라이아이스와 공존시키고, 실온에서 γ 선 조사하는 핀은 드라이아이스 없이 γ 선 조사를 실시하였다. 드라이아이스의 승화 온도는 대기압하에서 마이너스 78.5 ℃ 이다. 따라서, 드라이아이스 자체의 온도는 마이너스 78.5 ℃ 이하의 온도로 되어 있다. 조사선량은 예 6 과 동일하다. 그 후, 예 6 과 동일한 방법으로, γ 선 조사 후의 핀에 담지되어 있는 FGF-2 를 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.

도 6 에 방사선 멸균시의 온도가 아파타이트에 포매된 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성을 갖는 17 kDaFGF-2 에 미치는 영향을 나타낸다. 양 군에 있어서 17 kDa 의 위치에 밴드가 검출되었다. 또한 드라이아이스에 의한 마이너스 80 ℃ 부근에서의 저온에서의 조사는 실온에서의 조사와 비교하여, 시그널 강도가 2 배로 증가하는 것이 분명해졌다 (도 6). 이러한 점에서 탈기 포장에 더하여 드라이아이스의 공존에 의한 저온에서의 γ 선 조사는, 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성을 갖는 FGF-2 의 감소를 억제하고, 실온에서의 조사와 비교하여, γ 선 조사에 있어서의 FGF-2 의 방호 작용이 높은 것이 분명해졌다.

예 8 : 인간 재조합 BMP-2 (rhBMP-2) 를 포매한 아파타이트로 코팅한 인공골용 아파타이트 세라믹의 방사선 멸균 후의 골분화 촉진 활성

예 1 의 FGF-2 를 rhBMP-2 로 변경하고, 치밀질의 아파타이트제 디스크에, 공침 ApBMP 코팅, 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하고, γ 선 조사에 대한 BMP-2 의 방호 작용의 유무를 검토하였다.

예 4 와 동일하게 제조한 치밀질의 아파타이트제 디스크를 사용하여, 예 4 의 FGF-2 를 골원성 단백인 인간 재조합 BMP-2 (rhBMP-2) 로 변경하고, 공침 ApBMP 코팅을 실시하였다. 컨트롤로서 rhBMP-2 대신에 우혈청 알부민 (BSA) 을 사용하여 공침 ApBSA 코팅을 실시하였다. 공침 ApBMP 및 공침 ApBSA 를 코팅한 치밀질 아파타이트 디스크를, 진공 건조, γ 선 조사를 실시한 후에, 래트 골수 유래 간엽계 줄기세포를 디스크 상에 파종하고, 골분화 유도 12 일 후, 골분화 마커를 측정하였다. 간엽계 줄기세포는 7 주령 F344/NSlc 래트의 골수로부터 단리된 초대 간엽계 줄기세포를 사용하고, 디스크 상에 파종한 간엽계 줄기세포는 파종 직후로부터, 10 nM 덱사메타손 (Dex) 비첨가 또는 첨가 조건하에 있어서, 10 mM β 글리세로포스페이트, 0.28 mM 아스코르브산을 첨가한 골분화 유도 배지에서 12 일간 배양하였다. 배지 교환은 반량으로 하고, 2 일에 1 회 실시하였다. 12 일간 배양 후, 세포는 0.1 ％ Triron-X 함유 PBS 로 동결 용해시키고, 골분화 마커인 알칼리포스파타아제 (ALP) 활성을 라보어세이 ALP (Wako 사) 를 사용하여 정량하였다. 세포수당의 활성을 평가하기 위해, 세포 용해액 중의 DNA 량을 Quant-iT (등록상표) PicoGreen (등록상표) dsDNA Reagent and Kits (Thermo Fisher 사) 를 사용하여 정량하였다.

도 7 에 BMP-2 를 포매한 아파타이트로 코팅한 γ 선 조사 아파타이트제 디스크에 있어서, Dex 비존재하 또는 존재하에서의 분화 유도 후의 DNA 량당의 ALP 활성을 나타낸다. 도 7 에 나타낸 바와 같이, 공침 ApBMP 아파타이트제 디스크에 있어서, Dex 비존재하에서의 분화 유도 후의 DNA 량당의 ALP 활성은 γ 선 비조사군에 있어서 ApBSA 에 대해 유의하게 높고 (p = 0.02), 조사군에 있어서 ApBSA 와 동등한 활성을 나타냈다 (p = 0.46). 한편, Dex 존재하에서의 분화 유도 후의 DNA 량당의 ALP 활성은 γ 선 조사군도 비조사군도 ApBSA 에 대해 유의하게 높았다 (p = 0.02, 0.0001). 요컨대, 골원성 단백인 BMP-2 를 아파타이트로 포매하면, γ 선 멸균해도, BMP-2 의 생물 활성의 하나인 Dex 존재하에서의 골분화 촉진 작용이 유지되는 것이 나타났다. 즉, BMP-2 를 아파타이트로 포매한 조성물을, 이식용 세라믹에 코팅한 경우에도, FGF-2 를 아파타이트로 포매한 경우와 동일하게, 포매에 의해 전리 방사선 멸균 내성을 획득하여, 단백의 특정한 생물 활성이 유지되는 것, 바꾸어 말하면 아파타이트에 의한 포매가 단백의 특정한 생물 활성에 대해 방사선 방호 작용을 나타내는 것이 판명되었다.

예 9 : 방사선 멸균시의 L-아스코르브산인산에스테르마그네슘염 n 수화물의 공존이 무기 염류 고체에 포매된 단백의 생물 활성에 미치는 영향

이식용 금속인 창외 고정용 티탄핀에 예 1 과 동일한 조건으로 FGF-2 를 포매한 아파타이트를 코팅하고, L-아스코르브산인산에스테르마그네슘염 n 수화물의 용액 (AsMg 용액) 에 수 초 침지시키고 진공 건조시켰다. 제조한 공침 ApFGF 핀을 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하고, γ 선 조사시의 AsMg 의 공존이 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성을 갖는 FGF-2 에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하였다.

예 1 과 동일하게 티탄제 체내 고정용 핀을 사용하여, FGF-2 를 포매한 아파타이트를 코팅한 후에, 25 mM AsMg 용액에 2 회, 수 초 침지시키고 진공 건조시키며, FGF-2 를 포매한 아파타이트에 AsMg 를 첨가하였다. 제조한 공침 ApFGF 핀은 예 6 과 동일한 탈기 포장으로 밀봉 포장하고, 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하였다. 그 후, 예 6 과 동일한 방법으로, γ 선 조사 후의 핀에 담지되어 있는 FGF-2 를 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.

도 8 에 방사선 멸균시의 FGF-2 를 포매한 아파타이트에 대한 AsMg 첨가가, 포매된 FGF-2 의 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성에 미치는 영향을 나타낸다. γ 선 비조사, AsMg 존재하에서의 γ 선 조사, AsMg 비존재하에서의 γ 선 조사 중 어느 군에 있어서도 17 kDa 의 위치에 밴드가 검출되었다. γ 선 비조사군의 시그널 강도를 100 ％ 로 하면, AsMg 존재하에서의 γ 선 조사군의 시그널 강도는 55 ％ 이었다. 그러나, AsMg 비존재하의 γ 선 조사군의 시그널 강도는 13 ％ 이며, AsMg 존재하의 γ 선 조사군의 약 1/4 의 시그널 강도였다. 따라서, FGF-2 를 포매한 아파타이트에 AsMg 를 첨가한 조건에서의 γ 선 조사는, 항 FGF-2 항체에 대한 반응 활성을 갖는 FGF-2 의 감소를 억제하고, AsMg 비존재하와 비교하여, γ 선 조사에 있어서의 FGF-2 의 방호 작용이 높은 것이 분명해졌다. AsMg 는 항산화 작용이 있는 아스코르브산의 화합물의 하나이기 때문에, 우수한 방호 작용은 방사선 조사에 의한 라디칼 생성을 억제했기 때문은 아닐까 생각된다.

예 10 : FGF-2 에 더하여 헤파린을 포매 또는 흡착한 아파타이트로 코팅한 창외 고정 티탄핀의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성

FGF-2 와 헤파린의 양방을 포매한 아파타이트로 코팅한 창외 고정 티탄핀, 및 FGF- 와 헤파린의 양방을 흡착한 아파타이트로 코팅한 창외 고정 티탄핀을 제조하고, 이들을 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하고, γ 선 조사 후에 FGF-2 에 세포 증식 활성이 있는지의 여부를 검토하였다.

예 1 의 4 ㎍/㎖ 및 0 ㎍/㎖ 의 농도로 FGF-2 를 첨가한 불안정 인산칼슘 과포화 용액에 0.5 단위/㎖ 의 농도로 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 이하 예 1 과 동일한 조건으로, 이 불안정 인산칼슘 과포화 용액에 창외 고정 티탄핀 (신세스사 셀 드릴 4.0/3.0 ㎜Ti, 20 ㎜ - 80 ㎜) 을 침지시키고, FGF-2 와 헤파린을 아파타이트와 함께 공침시켜 코팅하였다 (공침 ApFGF 헤파린핀). 한편, 예 2 의 12 ㎍/㎖ 의 FGF-2 를 함유하는 과포화 인산칼슘 용액에 0.5 단위/㎖ 의 농도로 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 이하 예 2 와 동일한 조건으로, 이 불안정 인산칼슘 과포화 용액에 창외 고정 티탄핀을 수 초간 침지시키고, FGF-2 와 헤파린을 흡착한 아파타이트로 코팅하였다 (흡착 ApFGF 헤파린핀). 예 1 과 동일한 조건으로 진공 건조, γ 선 조사 비조사, 보관, 세포 증식 활성 평가를 실시하였다.

표 6 에 3 회의 반복 시행으로 「활성 있음」 으로 판단된 공침 또는 흡착 ApFGF 헤파린핀의 개수를 나타낸다.

표 6 에 나타낸 바와 같이 3 회의 시행에 있어서, 공침 ApFGF 헤파린핀의 γ 선 조사군에서 9/9 개, 비조사군에서 9/9 개가 세포 증식 활성 있음으로 판정되고, 세포 증식 활성이 있는 핀은 γ 선 조사군과 비조사군에서 동수였다. 한편, 흡착 ApFGF 헤파린핀의 γ 선 조사군에서 3/9 개, 비조사군에서 9/9 개가 세포 활성 있음으로 판정되고, γ 선 조사군에서 세포 증식 활성이 있는 핀의 수는 비조사군의 약 1/3 이었다. 양 군에서 카이 제곱 검정을 실시한 결과, γ 선 조사군과 비조사군 사이에서 유의차 (p = 0.003) 가 관찰되었다. 즉, 흡착 ApFGF 헤파린핀은 γ 선 조사 멸균에 의해 FGF-2 의 생물 활성을 소실하는 경향이 강한 것이 분명해졌다.

또, 도 9 에 나타내는 바와 같이, γ 선 비조사군의 세포 증식률을 100 ％ 로 하여 규격화한 γ 선 조사군의 세포 증식률은, 공침 ApFGF 헤파린핀에서는 약 23 ％ 였지만, 흡착 ApFGF 헤파린핀에서는 불과 4 ％ 이고, 양자의 값에는 통계적 유의차가 있었다 (p = 0.0002). 즉, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 조성물을, 이식용 금속인 티탄제 체내 고정핀에 코팅하면, FGF-2 와 헤파린의 양방을 흡착한 아파타이트를 코팅하는 경우보다 전리 방사선 멸균 내성이 높은 것, 바꾸어 말하면 아파타이트가 생물 활성을 갖는 단백 뿐만 아니라, 또한 생물 활성이 없는 헤파린을 포매한 경우에도, 방사선 방호 작용을 나타내는 것이 판명되었다.

예 11 : FGF-2 를 포매한 아파타이트로 코팅한 창외 고정 티탄핀, 및 FGF-2 와 헤파린의 양방을 포매한 아파타이트로 코팅한 창외 고정 티탄핀의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성의 비교

예 1 의 공침 ApFGF 핀의 세포 증식률과 예 10 의 공침 ApFGF 헤파린핀의 방사선 멸균 후의 세포 증식률을 비교하여, FGF-2 에 더하여 헤파린을 포매하는 것의 효과를 검토하였다.

예 1 에서는 방사선 멸균 후의 공침 ApFGF 핀의 코팅층을 10 mM 시트르산나트륨 용액으로 용해시켜 제조한 용해액을, 마우스 선유아 세포주 NIH3T3 에 첨가하여 세포 증식률을 정량 평가하였다. 그 결과, 세포 증식률의 값으로서 1.53 ± 0.27 을 얻었다 (도 1). 이에 대해, 방사선 멸균 후의 공침 ApFGF 헤파린핀의 코팅층을 10 mM 시트르산나트륨 용액으로 용해시켜 제조한 용해액을, 마우스 선유아 세포주 NIH3T3 에 첨가하면, 정량 한계를 초과할수록 세포 증식률이 높았다. 그래서, 용해액을 30 배 희석시켜 마우스 선유아 세포주 NIH3T3 에 첨가하여 세포 증식률을 정량 평가한 결과, 세포 증식률의 값으로서 1.67 ± 0.07 을 얻었다. 즉, 헤파린과 같이 세포외 기질 유래로서 그 자신은 직접적인 세포 증식 분화 활성을 갖지 않는 다당류를, 생물 활성 단백과 함께 포매하면 방사선 멸균 후의 생물 활성을 보다 높게 유지할 수 있는 것을 나타내고 있다.

예 12 : FGF-2 에 더하여 헤파린을 포매 또는 흡착한 아파타이트로 코팅한 인공 관절·인공골용 지르코니아의 방사선 멸균 후의 세포 증식 활성

FGF-2 와 헤파린의 양방을 포매한 아파타이트로 코팅한 인공 관절·인공골용 지르코니아, 및 FGF- 와 헤파린의 양방을 흡착한 아파타이트로 코팅한 인공 관절·인공골용 지르코니아를 제조하고, 이들을 25 ± 0.5 kGy 의 선량으로 γ 선 조사하고, γ 선 조사 후에 FGF-2 에 세포 증식 활성이 있는지의 여부를 검토하였다.

지르코니아 각봉 (角棒) (2.4 ㎜ × 2.4 ㎜ × 21 ㎜) 을 사용하여, 예 10 과 동일한 조건으로 코팅, 진공 건조, γ 선 조사 비조사, 보관, 세포 증식률 측정을 실시하였다.

표 7 에 2 회의 반복 시행으로 「활성 있음」 으로 판단된 공침 또는 흡착 ApFGF 헤파린 지르코니아의 개수를 나타낸다.

표 7 에 나타낸 바와 같이, 2 회의 시행에 있어서, 공침 ApFGF 헤파린 지르코니아의 γ 선 조사군에서 6/6 개, 비조사군에서 6/6 개가 세포 활성 있음으로 판정되고, 세포 증식 활성이 있던 지르코니아는 γ 선 조사군과 비조사군에서 동수였다. 한편, 흡착 ApFGF 헤파린 지르코니아의 γ 선 조사군에서 2/6 개, 비조사군에서 6/6 개가 세포 활성 있음으로 판정되고, γ 선 조사군에서 세포 증식 활성이 있는 핀의 수는 비조사군의 약 1/3 이었다. 양 군에서 카이 제곱 검정을 실시한 결과, γ 선 조사군과 비조사군 사이에서 유의차 (p = 0.014) 가 관찰되었다. 즉, 흡착 ApFGF 헤파린 지르코니아는 γ 선 조사 멸균에 의해 FGF-2 의 생물 활성을 소실하는 경향이 강한 것이 분명해졌다.

또, 도 10 에 나타내는 바와 같이, γ 선 비조사군의 세포 증식률을 100 ％ 로 하여 규격화한 γ 선 조사군의 세포 증식률은, 공침 ApFGF 헤파린 지르코니아에서는 약 76 ％ 였지만, 흡착 ApFGF 헤파린 지르코니아에서는 불과 29 ％ 이고, 양자의 값에는 통계학적 유의차 (p = 0.008) 가 있었다. 즉, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 조성물을, 이식용 세라믹인 지르코니아에 코팅하면, FGF-2 와 헤파린의 양방을 흡착한 아파타이트를 코팅하는 경우보다 전리 방사선 멸균 내성이 높은 것, 바꾸어 말하면 아파타이트가 생물 활성을 갖는 단백 뿐만 아니라, 또한 생물 활성이 없는 헤파린도 포매한 경우에도, 방사선 방호 작용을 나타내는 것이 판명되었다.

예 13 : FGF-2 를 포매한 아파타이트로 코팅한 창외 고정핀의 방사선 멸균 후의 코팅층의 조성 분석

예 1 에서 제조한 γ 선 조사와 비조사의 공침 ApFGF 핀, 및 예 2 에서 제조한 γ 선 조사와 비조사의 흡착 ApFGF 핀을 10 mM 시트르산나트륨 용액에 30 분간 담그고, 코팅층인 공침 ApFGF 와 흡착 ApFGF 를 용해시켰다. 용해액을 ICP 발광 분광 분석법으로 화학 분석하고, 공침 ApFGF 와 흡착 ApFGF 의 칼슘과 인을 정량하였다. 표 8 에 결과를 나타낸다.

표 8 로부터 코팅층인 공침 ApFGF 는 인산칼슘을 주성분으로 하는 것이 나타났다. 공침 ApFGF 의 Ca/P 몰비 (1.70 - 1.71) 는, 불순물 원소를 포함하지 않는 아파타이트 (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) 의 이론 Ca/P 몰비 (1.67) 와 가까운 값이었다. 아파타이트의 인산기를 불순물이 치환하면 Ca/P 몰비는 1.67 보다 높아지는 것이 알려져 있으며, 인산기를 치환하는 대표적인 불순물은 탄산기이다. 예 1 과 예 2 의 공침 ApFGF 는, 탄산 이온을 함유하는 용액 중에서 제조되어 있기 때문에, 탄산기를 함유한 아파타이트가 FGF-2 와 공침하여 FGF-2 를 포매하고 있거나, 혹은 아파타이트와 탄산칼슘이 FGF-2 와 공침하여 FGF-2 를 포매하고 있다고 생각되었다.

예 14 : Ca-PO₄-K-Na-Cl 계의 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의 제조

Ca 이온 1.00 mM, 인산 이온 1.00 mM, K 이온 2.00 mM, Na 이온 16.7 mM, Cl 이온 2.00 mM, HCO₃ 이온 16.7 mM 을 포함하고 pH 가 8.3 이며, 그대로 37 ℃ 에서 방치해도 4 - 5 시간 정도에서 자발 핵 형성으로 인산칼슘이 결정화되는 불안정 인산칼슘 과포화 용액을 사용하였다. 침지 시간이 24 시간인 것 이외에는, 예 12 와 완전히 동일한 조건으로, 공침 ApFGF 헤파린 지르코니아를 제조하고, 진공 건조, γ 선 조사, 보관, 세포 증식률 측정을 실시하였다.

표 9 에 「활성 있음」 으로 판단된 공침 ApFGF 헤파린 지르코니아의 개수를 나타낸다.

표 9 에 나타낸 바와 같이 공침 ApFGF 헤파린 지르코니아의 γ 선 조사군에서3/3 개, 비조사군에서 3/3 개가 세포 활성 있음으로 판정되고, 세포 증식 활성이 있는 지르코니아는 γ 선 조사군과 비조사군에서 동수였다. 즉, Ca-PO₄-K-Na-Cl 계의 불안정 인산칼슘 과포화 용액을 사용하여, FGF-2 와 헤파린의 양방을 아파타이트로 포매한 조성물을, 이식용 세라믹인 지르코니아에 코팅하는 경우에도, 아파타이트에 의한 포매가 방사선 방호 효과를 나타내는 것이 판명되었다.

예 15 : FGF-2 와 헤파린의 양방을 포매한 아파타이트로 코팅한 지르코니아의 코팅층의 분석

예 14 에서 제조한 공침 ApFGF 헤파린 코팅층을 예 13 과 동일한 방법으로 조성 분석하였다. 또, 예 14 에서 공침 ApFGF 헤파린 지르코니아를 제조했을 때의 공침물을, 실리콘 무반사판에 올리고 분말 X 선 회절법으로 분석하였다. 분말 X 선 회절은, CuKα 선을 사용하여 40 ㎸ 100 ㎃ 의 조건으로 실시하였다. 표 10 에 조성 분석의 결과를 나타낸다.

표 10 으로부터 코팅층인 공침 ApFGF 는 인산칼슘을 포함하는 것이 나타났다. 공침 ApFGF 의 Ca/P 몰비는 γ 선 미조사군에서 1.70 - 1.82, 조사군에서 1.51 - 1.79 이었다.

Ca/P 비로부터 예 13 과 동일하게, 탄산기를 함유한 아파타이트가 FGF-2 와 헤파린을 포매하고 있거나, 혹은 아파타이트와 탄산칼슘이 FGF-2 와 헤파린을 포매하고 있다고 생각되었다. 또한, 비정질 인산칼슘의 Ca/P 몰비는 전형적으로는 1.5 이므로, 비정질 인산칼슘이 석출되는 것도 나타내고 있다.

도 11 에 분말 X 선 회절법으로 분석한 결과를 나타낸다. 비정질 인산칼슘은 30°부근에 반치폭이 큰 브로드한 피크가 출현하는 것이 알려져 있다. 도 11 에 나타내는 바와 같이, 공침물의 분말 X 선 회절 패턴에는 30°부근에 비정질 인산칼슘에 상당하는 반치폭이 큰 브로드한 피크가 관찰되었다. 또 31.8°, 32.2°, 32.9°에 출현하는 결정성 아파타이트에 특징적인 3 개의 강한 회절선 ((211), (112), (300)) 은 분리되지 않고 하나의 브로드한 피크를 형성하고 32°부근에 출현하였다. 따라서, 공침물의 아파타이트는 저결정성 아파타이트이다. 또한, 29.4°에는 탄산칼슘의 피크가 관찰되었다. 즉, 공침물은 비정질 인산칼슘, 저결정성 아파타이트, 탄산칼슘을 주성분으로서 함유한다. 공침물은, 저용해성의 결정성 아파타이트를 포함하지 않고, 용해성이 비교적 높은 비정질 인산칼슘, 저결정성 아파타이트, 탄산칼슘을 주성분으로 하기 때문에, 포매된 단백을 서방하는 데에 적합하다.

산업상 이용가능성

생물 활성을 갖는 성장 인자 등의 단백을 포매한 아파타이트 등의 무기 염류 고체가, 금속 또는 세라믹을 코팅하도록 배치된 본 발명의 의료 기기에서는, 방사선 멸균에 의한 그 단백의 생물 활성의 실활을 억제할 수 있기 때문에, 그 단백의 생물 활성을 이용하는 여러 가지 의료 기기의 제조 공정에 있어서 방사선에 의한 간편한 최종 멸균법이 적용 가능해져, 무균적인 제조법을 회피할 수 있으므로, 대폭적인 비용 절감이 가능하다.

Claims (23)

1. 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 금속, 세라믹, 또는 그 양자의 일부 또는 전체를 코팅하도록 배치된, 인간을 포함하는 포유류 동물에 사용하기 위한 의료 기기로서,
   (a) 상기 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 자발 핵 형성을 발생시키는 중성 또는 약알칼리성의 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의 제어된 지연 공침 또는 피복 샌드위치법 또는 건조법의 공정으로 제공되어 있고,
   (b) 상기 의료 기기가, 멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선을 노출시키고, 그에 의해 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조직 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 생물 활성을 갖는 최종 멸균 의료 기기로서 제조하는 공정으로 제조되어 있고,
   (c) 상기 무기 염류가, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 및 탄산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 무기 염류이고, 또한,
   (d) 상기 생물 활성을 갖는 단백이, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 및 골원성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 단백인, 의료 기기.
2. 제 1 항에 있어서,
   아파타이트가 저결정성 아파타이트인 의료 기기.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체가, 추가로 세포외 기질 유래로서 그 자신은 직접적인 세포 증식 분화 활성을 갖지 않는 다당류를 포매하고 있는 의료 기기.
4. 제 3 항에 있어서,
   다당류가 헤파린인 의료 기기.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   금속이, 티탄, 티탄 합금, 스테인리스, 및 코발트 크롬 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 금속인 의료 기기.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   세라믹이, 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산팔칼슘, 비정질 인산칼슘, 알루미나, 지르코니아, 및 이들의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 세라믹인 의료 기기.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   전리 방사선이 감마선 및/또는 전자선인 의료 기기.
8. 제 7 항에 있어서,
   감마선 및/또는 전자선에 의한 멸균이, 라디칼 발생을 억제하는 조건하에서 실시되고, 그 조건이, (a) 대기압 50 ㎪ 이하의 탈기 상태에서의 멸균, (b) 대기를 질소 또는 불활성 가스로 교환한 상태에서의 멸균, (c) 0 ℃ 내지 -196 ℃ 의 범위의 저온에서의 멸균, 및 (d) 생물 활성을 갖는 단백을 포매한 무기 염류 고체에 추가로 아스코르브산 또는 아스코르브산염을 첨가한 상태에서의 멸균에서 선택되는 1또는 2 이상의 조건인, 의료 기기.
9. 제 8 항에 있어서,
   아스코르브산 또는 아스코르브산염이 아스코르브산, 아스코르브산나트륨, 아스코르브산칼슘 이수화물, 아스코르브산인산에스테르마그네슘염 n 수화물로 이루어지는 군에서 선택되는 의료 기기.
10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    감마선의 선량이 3 ∼ 40 kGy 인 의료 기기.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드 호르몬이, 시상하부 유래 펩티드 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 인터메딘, 성선 자극 호르몬, 성장 호르몬, 파라타이로이드 호르몬, 인히빈, 액티빈, 릴랙신, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 콜레시스토키닌, 세크레틴, 모틸린, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 에리트로포에틴, 렙틴, 엔도셀린, 그렐린, 아디포넥틴, 인슐린형 성장 인자, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 펩티드 호르몬인 의료 기기.
12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    성장 인자가 FGF-2 및 그 기능적 등가물로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 성장 인자인 의료 기기.
13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    골원성 단백이, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, DPP, Vg1, Vgr-1, 및 그들의 기능적 등가물로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 골원성 단백인 의료 기기.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물 활성이, 세포 증식 활성, 혈관 증식 활성, 연조직 형성 활성, 골조직 형성 활성, 골분화 촉진 활성, 항체에 대한 반응 활성, 아고니스트 작용 활성, 및 안타고니스트 작용 활성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 생물 활성인 의료 기기.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    멸균하기 위해서 충분한 선량의 전리 방사선에 의해 최종 멸균된 후의 생물 활성이, 멸균 전의 생물 활성에 대해 13 ％ 이상인 의료 기기.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물 활성을 갖는 단백이, 이하의 공정 : (a) 염화나트륨 용액, 인산나트륨 용액, 염화칼슘 용액, 탄산나트륨 용액, 탄산수소나트륨 용액을 사용한 공침 석출법, (b) 피복 샌드위치법, 및 (c) 건조법으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 공정에 의해 무기 염류 고체에 포매되어 있는 의료 기기.
17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물 활성을 갖는 단백이, (a) 중성 또는 약알칼리성 용액을 사용한 자발 핵 형성을 발생시키는 불안정 인산칼슘 과포화 용액 중에서의, 생물 활성을 갖는 단백과 인산칼슘의 제어된 지연 공침에 의한 공침 석출법, 및 (b) 피복 샌드위치법으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 공정에 의해 무기 염류 고체에 포매되어 있는 의료 기기.
18. 제 17 항에 있어서,
    지연 공침이, 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, Ca 이온 0.5 ∼ 2.5 mM, 인산 이온 1.0 ∼ 20 mM, K 이온 0 ∼ 40 mM, Na 이온 0 ∼ 200 mM, Cl 이온 0 ∼ 200 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액에 있어서의 KCl 농도의 제어, 및 인산칼슘 석출까지의 시간의 인공적인 제어 지연을 포함하는 의료 기기.
19. 제 17 항에 있어서,
    지연 공침이, 불안정 인산칼슘 과포화 용액으로서, Ca 이온 1.2 ∼ 2.75 mM, 인산 이온 0.6 ∼ 15 mM, K 이온 0 ∼ 30 mM, Na 이온 30 ∼ 150 mM, Mg 이온 0.1 ∼ 3.0 mM, Cl 이온 30 ∼ 150 mM, HCO₃ 이온 0 ∼ 60 mM 을 포함하고 pH 가 7.0 ∼ 9.0 인 수용액에 있어서의 KCl 농도의 제어, 및 인산칼슘 석출까지의 시간의 인공적인 제어 지연을 포함하는 의료 기기.
20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 수복에 사용하기 위한 의료 기기.
21. 제 20 항에 있어서,
    체내 고정핀, 체내 고정용 나사, 인공골, 골 보전재, 치과용 골내 임플란트, 척추내 고정 기구, 수내정, 및 척추 케이지로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 의료 기기인 의료 기기.
22. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인공 관절로서 사용하기 위한 의료 기기.
23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 의료 기기의 제조 방법으로서, 상기 생물 활성을 갖는 단백을, 이하의 공정 : (a) 염화나트륨 용액, 인산나트륨 용액, 염화칼슘 용액, 탄산나트륨 용액, 탄산수소나트륨 용액을 사용한 공침 석출법, (b) 피복 샌드위치법, 및 (c) 건조법으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 공정에 의해 무기 염류 고체에 포매시키는 공정을 포함하는 방법.

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