JP2002501786A - 放射線照射および熱処理がなされた骨ペースト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 整形外科の分野において、例えば癒合不全骨折の修復、歯周堤の増強術、頭蓋顔面手術、インプラント固定、脊椎固定術を含む脊柱および他の関節の固定術、または新骨の生成が必要と考えられる任意の他の処置において有用な、加熱滅菌骨ペーストが、実質的に生体吸収性の骨形成性化合物を11〜30％、好ましくは約15％〜19％（w/w）の加熱滅菌ゼラチン基質中に含む組成物によって提供される。種々の態様において、骨形成性成分は（i）脱灰骨基質（DBM）、（ii）生物活性ガラスセラミックス、バイオグラス（BIOGLASS）（登録商標）、生物活性セラミックス、リン酸カルシウムセラミック、ハイドロキシアパタイト、ハイドロキシアパタイトカーボネート、コラリンハイドロキシアパタイト、か焼骨（calcined bone）、皮質骨片、海綿骨片、リン酸三カルシウムまたは類似の材料、（iii）天然型または組換え型の、骨髄抽出物、血管増殖もしくは再生増殖因子、骨形成蛋白質、TGF-β、PDGFまたはそれらの混合物、および（iv）（i）〜（iii）の混合物から選択される。加熱滅菌ゼラチンは、加熱および放射線照射の双方による滅菌がなされた市販グレードのゼラチンでもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願に関する相互参照 本出願は、1998年1月18日に提出された出願中の米国特許出願第09／014,519号
の一部継続出願である。

【０００２】発明の背景 1．発明の分野 本発明は、骨融合、インプラントと骨との融合、骨欠損の充填、または骨誘導
性、骨形成性の組成物が望ましいその他の任意の用途を実現するために、整形外
科医学の分野で用いるための骨形成性、骨誘導性および／または骨導性（osteoc
onductive）組成物の製造に有用な、改良型の、加熱滅菌骨ペースト（thermally
sterilized bone paste）を提供する。

【０００３】2．背景： 毎年、米国だけでも100,000件を上回る骨移植術が行われている（Cornell）。
再建術の大半では、骨小片同士の連続的な接触が修復部位でのより迅速かつ完全
な治癒（ならびに力学的完全性の向上）につながるという考えから、移植材料が
骨小片間の充填剤として用いられる（Bloebaum）。骨増強術（bone augmentatio
n）および脊椎固定術の場合には、領域内に骨断片が存在しないことから、これ らの骨移植片が移植片の全構造を形作ると考えられる。例外と考えられる1つの 製品を除き（その使用ガイドラインではこれを許容していない）、骨移植用材料
はすべて外科的配置を要し、それには切開が不可欠である。

【０００４】 骨形成性の骨移植用材料は、骨導性のものおよび骨誘導性のものという2つの 種類に分類できる。これらの用語の厳密な定義については現在も議論があるが、
骨導性インプラントは、骨組織中に移植された際に骨が欠損部を越えて増殖する
ように「導く」（Einhorn）。これに対して、骨誘導性インプラントは、領域内 の細胞が自ら骨を形成するように「誘導」する能力をもつ（Einhorn）。これら の骨誘導性インプラントは、非骨組織中に移植された場合（例えば、皮下移植ま
たは筋肉内移植）にも骨形成をもたらすと考えられる（Einhorn、Benedict、Str
ates、Urist）。

【０００５】 現在入手可能な人工的に製造された骨移植用材料はいずれも骨導性移植片に分
類される。これらには、バイオグラス（Bioglass）（登録商標）、ノリアン（No
rian）（登録商標）、コラグラフト（Collagraft）（登録商標）、コラリンハイ
ドロキシアパタイト（corraline hydroxyapatite）、粉末ハイドロキシアパタイ
ト、結晶および非晶質ハイドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイト）なら
びに多数の他の製品がある。これらのインプラントはすべて、それらが天然の骨
のハイドロキシアパタイトに類似することに依拠している。骨導に関して想定さ
れている機序は、これらの材料がその極めて広い表面の全面にわたって栄養因子
および細胞の拡散を促進させる能力をもち、ならびにそれらが成長中の組織に対
して力学的支持を与えるというものである。主な骨移植用材料のこの点に関連す
る特性の一覧を図1に示す。

【０００６】 もう一方の分類に属する現在入手可能な骨移植用材料は、自己移植片または同
種移植片に含まれる。極めて激しい処理を行わない限り、これらの材料は一般に
骨誘導性である（Yazdi）。それらは組織移植片であるため、その使用には一定 のリスクが伴う。自己移植片では摘出部位の罹病率が20％を上回る（Younger） 。凍結または凍結乾燥がなされた同種移植片は何らかの免疫応答を誘発するほか
、適切なスクリーニングがなされなければ疾患の伝染をもたらすことがある（Ho
rdin）。同種移植片の残る分類は、脱灰骨基質（demineralized bone matrix） である。

【０００７】 脱灰基質（DBM）は、1889年に初めて記載された（Senn）。これは1960年代後 半になってユリスト（Urist）およびストレーツ（Strates）によってほとんど偶
然に再発見された（Strates、Urist）。それ以来、これは世界中の組織バンクの
主要な製品となっている。その名の通り、これは酸処理によって脱灰された骨で
ある。この製造物を製造するための工程の詳細な概要を図2に示す。

【０００８】 DBMは、非骨組織においても4週間以内に骨形成を誘導する能力をもつ（Strate
s、Urist、Lasa）。DBMの活性を評価するための標準的な技法は、それを皮下ま たは筋肉内に移植することである（Nathan）。DBMにおける主な活性因子は、1種
または複数の骨形成蛋白質（bone morphogenetic protein）（BMP）である（参 照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,294,753号を参照されたい）。T
GF-β（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,422,340号を参照され
たい）、血小板由来増殖因子（PDGF）などを非制限的に含むその他の増殖因子も
、この機能に関して重要と思われる。

【０００９】 バイオグラス（Bioglass）（登録商標）は、SiO_２、Na_２O、CaO、P_２O_５ガラ スである骨移植用材料であり、移植後数分以内にハイドロキシアパタイトカーボ
ネートの生物活性表面層を形成する能力をもつ（Hench）。

【００１０】 DBMまたはバイオグラスの使用に伴う問題には2つがある。これらの材料はいず
れも大きな粒子として供給され、移植される領域に必ずしも留まるとは限らない
（Scarborough、Frenkel）。また、それらの性質は粗いため、手術室におけるそ
れらの成形および取り扱いは困難である。このため、粒子の移動が起こらず、さ
らに手術環境で用いやすい製品に関する需要が存在する。

【００１１】 表1に示す通り、近年、骨充填性外科用ペーストがいくつか市販されている。 これらの製品は、生理食塩水と砂様粉末との単純な混合物から、グリセリンを基
剤とする非架橋性組成物であってグラフトン（GRAFTON）（登録商標）として知 られる最近発売されたゲルに至るまでさまざまである。これらの製品はすべて、
空隙、空洞、亀裂などの骨欠損を修復するために整形外科において用いられる。
このような欠損は外傷の結果であることも先天性のこともあり、既知のペースト
は、このような欠損の継ぎ当てもしくは充填のため、または既存の骨構造上への
構築のために用いうる。このような治療の最終的な目標は、外科医がペースト適
用時に作成した形態を維持しながら、ペーストを置き換えるようにペーストに骨
形成を誘導させることである。

【００１２】 骨ペーストは、骨導性（すなわち、領域内に細胞を導く）および骨誘導性（す
なわち、新骨形成を開始する骨形成細胞への幹細胞の分化を誘導する）であるこ
とが望ましい。一般に、当技術分野で知られた骨ペーストは骨導性であるが、骨
誘導効果はわずかに過ぎない。したがって、このようなペーストは大きな空隙を
充填するには不適切であり、小さな空隙でも適切な骨形成効果が得られないこと
がしばしばである。ある程度の骨誘導活性を示すものを含め、現在入手可能な骨
ペーストはすべて取り扱いが難しいか、移植部位に十分に留まらないか、または
その両方である。

【００１３】 このため、市販されている製品の一つであるグラフトン（GRAFTON）（登録商 標）（米国特許第5,484,601号参照）は、ゼラチンを含む種々の他の成分を選択 的に含む、ポリヒドロキシ化合物（グリセリンなど）またはそのエステル中に懸
濁化された脱灰骨粉末の非架橋性組成物である。この材料は、水溶性のグリセリ
ンが担体基質であるため、移植部位から迅速に洗い流せると考えられている。

【００１４】 米国特許第5,236,456号および第5,405,390号（O'LearyおよびPrewett）は、濃
酸（3M HCl）による処理および40〜50℃への加熱によって脱灰骨基質（DBM）か ら製造される「骨形成性」ゲル組成物を概説している。その特許は、ゲルとDBM およびいくつかの他の成分との混合を簡単に説明している。しかし、ゲル組成物
を製造するその方法は、主としてコラーゲン線維が生成されるものである（すな
わち、ゼラチンが生成されるには温度上昇が不十分である）。その結果、コラー
ゲン線維は中性溶液では不溶性となる。ゲルを得るために、その特許では、コラ
ーゲンを低pHの酸（例えば、HClまたは1％酢酸、pH 4.0未満）に溶解させる必要
があると明記している。しかし、低pHの組成物は生体移植との適合性がそれほど
高くないことが一般的である。また、第5列の第20行および第6列の第20行では、
ゲルが凝固する温度は0〜5℃であり、インビボでのゲル化に先行することが明記
されていることも注目される。米国特許第4,440,750号（GiowackiおよびPharris
）は、ペプシン（Pepsin）を用いて組織からコラーゲンを抽出するための標準的
な酵素的技法を概説している。高度に精製されたコラーゲンを動物性供給源から
採取し、それを再構成した後に実用に供する組成物を形成する。コラーゲンは他
の化学物質（例えば、アルデヒド類、コンドロイチン硫酸）を添加しなければ容
易に架橋を生じないと考えられるが、発明者らはそれを組成物中に明記していな
い。設定温度の記載および架橋反応に関する言及もなされていない。

【００１５】 米国特許第4,394,370号および第4,472,840号（Jefferies）では、再構成コラ ーゲンと脱灰骨または可溶化骨形成蛋白質との複合体であって、選択的にはグル
タルアルデヒドによって架橋されたものが、インビボに移植した際に骨形成性で
あることが報告されている。これらの特許の再構成コラーゲンは、コラーゲン調
製物中に用いた塩酸を除去するための透析処理がなされ、微粉砕されて凍結乾燥
された微結晶コラーゲンである。したがって、それらの特許の組成物では、組成
物の形成の前にコラーゲンのゼラチンへの変換は起こらない。このため、その組
成物は、本組成物の熱架橋反応を示さないと考えられる。

【００１６】 米国特許第4,678,470号（Nashefら）は、グルタルアルデヒドもしくは類似の 架橋剤による処理によって架橋がなされ、ゼラチン質または半固体性の担体中に
懸濁化された脱灰骨基質を含む非吸収性の骨移植用材料を開示している。その特
許の脱灰骨は化学的に架橋されるため、その骨誘導性は消失すると考えられ、そ
の組成物は本質的に、その中にレシピエントの骨が成長しうる構造的充填剤また
は基質となる。

【００１７】 国際公開公報第89／04646号（Jefferies）には、優れた構造強度をもつ骨修復
用材料が開示されている。その材料は、生体適合性基質とのその結合性を高める
ためにグルタルアルデヒドまたは類似の架橋剤による処理によって表面活性化が
なされた脱灰骨基質を含む。その結果生じる材料は非常に強固な構造をもつため
、レシピエント生体に移植する前に、材料の機械加工を要すると思われる。

【００１８】 米国特許出願第08／816,079号には、ゼラチンおよび脱灰骨基質を含む骨ペー ストが開示されている。その開示では、ゼラチン担体基質は、本アテリオペプチ
ド（ateliopeptide）コラーゲン担体基質の場合と同じく、水熱吸収性（dehydro
thermal）架橋を受けない。

【００１９】 本発明の加熱滅菌骨ペーストは、用いる特定の態様に依存して移植部位に付着
し、骨導性および骨誘導性活性の両方を示し、重量百分率にして約20％から約45
％までの間で熱架橋を生じる実質的に生体吸収性（bioabsorbable）である米国 特許出願第08／816,079号の「骨ペースト」と比較して、重量百分率にして約15 ％から約19％までの間の濃度で38℃での熱架橋を生じる、取り扱いおよび保存が
容易な新たな材料を提供することにより、当技術分野における需要を満たす。さ
らに、米国特許出願第09／014,519号の「加熱滅菌骨ペースト」と比較して、本 発明の加熱滅菌骨ペーストは、市販グレード（commercial grade）のゼラチンを
ヒトまたは動物への移植用に加工することを可能にする新規工程によるγ線照射
、加圧滅菌および諸成分との混合を含む、新規工程によって生産される。

【００２０】 好ましくは、本発明の組成物は、迅速な骨内部成長を誘導することが臨床的に
示されている鉱質および蛋白質成分を含むゲルとして提供される。本組成物は、
シリンジ中にあらかじめ充填された使用可能な状態で外科医に供給することがで
きる。第1の温度では、ゲルは任意の形態に容易に成形することができ、接着性 であることが好ましい。いったん生体環境の内部に置かれた場合、または第2の 温度では、ゲルは移植部位から流されたり移動したりしないゴム状固体として硬
化することが望ましい。骨内部成長に伴い、インプラント材料は生体システムに
完全に取り込まれる。本組成物の製造および使用の様式を以下に詳しく述べる。

【００２１】発明の簡単な概要 整形外科の分野において、例えば癒合不全骨折の修復、歯周堤の増強術、頭蓋
顔面手術、インプラント固定、脊椎固定術を含む脊柱および他の関節の固定術、
または新骨の生成が必要と考えられる任意の他の処置において有用な、加熱滅菌
骨ペーストが、ゼラチンおよび付加的な骨形成性成分を含む組成物によって提供
される。好ましくは、ゼラチンは約38℃ではゼラチン濃度が約11〜30％、好まし
くは約15％〜19％（w/w）で熱架橋され、骨形成性成分は以下のものより選択さ れる： （i）脱灰骨、好ましくは加熱滅菌骨ペーストを移植しようとする種に由来する 脱灰骨、または （ii）生物活性ガラスセラミック、バイオグラス（BIOGLASS）（登録商標）、生
物活性セラミック、リン酸カルシウムセラミック、ハイドロキシアパタイト、ハ
イドロキシアパタイトカーボネート、コラリンハイドロキシアパタイト、か焼骨
（calcined bone）、皮質骨片、海綿骨片、リン酸三カルシウム、類似の材料も しくはそれらの混合物、または （iii）天然型もしくは組換え型の、骨形成蛋白質、骨形成性蛋白質もしくはペ プチド（例えば、オステオゲニン、p15、CDMPなど）、TGF-β、骨髄抽出物、血 管増殖または再生増殖因子、PDGFもしくはそれらの混合物、または （iv）（i）〜（iii）の混合物。

【００２２】 （ii）または類似の材料が存在する場合、それらは本組成物が示す強度および
骨誘導性の操作可能な特性の範囲を拡大するために含められ、それらは重量にし
て組成物の質量の約40％を含む約0〜60％の範囲を占めることが可能である。

【００２３】 （iii）が存在する場合、それは通常であれば骨誘導性因子の源となる脱灰骨 の必要性を減じる。

【００２４】 脱灰骨は骨形成の誘導に極めて有効であることが示されている。ゼラチンは、
本組成物の骨導性および骨誘導性要素が内部に保持される架橋性、接着性および
易操作性の基質を提供する。抗生物質、天然型もしくは組換え供給源に由来する
骨形成蛋白質および他の蛋白質、湿潤剤、グリセリン、デキストラン、カルボキ
シメチルセルロース（CMC）、増殖因子、ステロイド、非ステロイド性抗炎症性 化合物もしくはそれらの組み合わせ、または本発明の必須組成物の望ましい特性
に付加的に働くことが明らかになっている任意の他の材料を含むことができる。

【００２５】 本組成物は凍結乾燥しても事前に構成してもよく、あらかじめ充填されたシリ
ンジなどの便利な投与装置中にある状態で提供してもよい。ゲルは、約40℃を上
回る温度では液体または柔軟性の高いの状態にあるものの、それが移植される生
物の体温または好ましくはそれをわずかに上回る温度（例えば、ヒトでは38℃）
では硬いゲルとなることが好ましい。

【００２６】発明の詳細な説明 本発明の組成物の詳細、その調製および使用の方法を、任意の脊椎動物種に用
いるためのこのような組成物に対して適用しうることは、当業者には理解される
と思われる。しかしながら、この新たな材料の主な整形外科的用途はヒトでの使
用である可能性が高いと考えられるため、以下の説明ではヒトに適用するための
この材料の例示を中心に論じることとする。

【００２７】 本発明の組成物は、ゼラチンおよび付加的な骨形成性成分を含む。好ましくは
、ゼラチンは約38℃ではゼラチン濃度が約11〜30％、好ましくは約15％〜19％（
w/w）で熱架橋され、骨形成性成分は以下のものから選択される： （i）脱灰骨、好ましくは加熱滅菌骨ペーストを移植しようとする種に由来する 脱灰骨、または （ii）生物活性ガラスセラミック、バイオグラス（BIOGLASS）（登録商標）、生
物活性セラミック、リン酸カルシウムセラミック、ハイドロキシアパタイト、ハ
イドロキシアパタイトカーボネート、コラリンハイドロキシアパタイト、か焼骨
（calcined bone）、皮質骨片、海綿骨片、リン酸三カルシウム、類似の材料も しくはそれらの混合物、または （iii）天然型もしくは組換え型の、骨形成蛋白質、骨形成性蛋白質もしくはペ プチド（例えば、オステオゲニン、p15、CDMPなど）、TGF-β、骨髄抽出物、血 管増殖または再生増殖因子、PDGFもしくはそれらの混合物、または （iv）（i）〜（iii）の混合物。

【００２８】 本組成物は、第1の温度（例えば、38℃を上回る）では液体であり、移植しよ うとする生物の正常体温に相当する第2の温度またはそれをわずかに上回る温度 （例えば、ヒトでは38℃）では熱架橋される。

【００２９】 「熱架橋される」または「熱架橋性である」という用語は、本明細書において
、ある所定の温度および濃度条件において、またはそれ未満の条件において、こ
れらの分子を含む溶液のゲル化が起こるような様式で会合する分子を含む組成物
の特性を説明するために用いられる。

【００３０】 「加熱滅菌がなされた」という用語は、本明細書において、材料の滅菌（すな
わち、生きた生物を消失させること）のために当技術分野で一般に認識されてい
るような温度条件下で材料を処理することを示す。例えば、「加圧滅菌」の標準
的手順では、材料を密封容器に入れ、その中に蒸気を注入して容器内の温度が約
121℃に達するような圧力にする。このような条件下での20分間の処理は、熱が 伝えられる物体または液体の体積に応じてより長い期間を要することもあるが、
物体を表面滅菌するには十分であると一般に認識されている。別の条件である乾
熱（すなわち、蒸気を用いないこと）も無菌環境を生じることが一般に認められ
ており、例えば、約121〜130℃の乾熱を約5分間から約6時間までの範囲にわたっ
て用いる。さらに、滅菌領域を得るためには曝露時間を考慮する必要がある。い
ずれの状況においても、本発明の組成物に対して適用されるこの用語は、「加熱
滅菌がなされた」と記載される材料が無菌状態にあり続けることは必要でない。
換言すれば、材料はそれが無菌であり続けることが好ましい場合に移植してもよ
く、または開放的および汚染された状態で放置してもよく、それでも「加熱滅菌
がなされている」。決定的に重要なのは、このように処理された材料の物理的特
性（すなわち、分子量、および動粘性率によって明らかになる溶液の挙動）であ
り、無菌状態にあるか否かではない。本開示によれば、乾燥されたゼラチン組成
物を約5分間から約18時間まで、好ましくは約3〜6時間の間にわたって約121℃か
ら130℃で処理することが、「加熱滅菌がなされた」という用語の意味する範囲 に含まれると考えられる。

【００３１】 「実質的に生体吸収性である」という用語は、本明細書において、3カ月から1
年後というような適切な生体吸収期間をおいた後に、移植部位でもはや検出可能
でないか、またはその部位でリモデリングを受けて内因性組織を生じるという材
料の特性を説明するために用いられる。このため、例えば、グルタルアルデヒド
などの薬剤によって化学的に架橋された脱灰骨基質は、実質的に生体吸収性であ
るとはみなされない。しかし、脱灰骨基質それ自体、ゼラチンおよび骨形成蛋白
質はすべて、それらが新たな内因性組織へのリモデリングを受けることなく単に
構造的剛性または支持をもたらすのではなく、新骨形成に協調的に働くことから
、実質的に生体吸収性であるとみなされる。

【００３２】 ゼラチンは担体相として作用するほか、極めて狭い温度範囲で熱架橋される能
力を有する。この熱架橋反応は主として鎖同士の物理的絡み合いおよび水素結合
によって制御されるため、濃度および温度に依存的である（Sperling）。さらに
、ゼラチンは医療市場で大規模に用いられてきたため、そのインビボ特性は詳細
に検討されている（McDonald）。ゲルフォームスポンジは、この生体高分子の最
もよく知られた応用例である。諸研究により、ゼラチンの移植時の抗原性は非常
に弱いこと、およびその特性のいくつかはコラーゲンに匹敵することが示されて
いる（McDonald）。しかし、コラーゲンは、本発明の組成物にとって極めて重要
である熱架橋性を示さない。

【００３３】 バイオグラス（BIOGLASS）（登録商標）などの生物活性ガラス、生物活性セラ
ミックス、リン酸カルシウムセラミックス、ハイドロキシアパタイト. ハイドロ
キシアパタイトカーボネート、か焼骨、リン酸三カルシウムまたは類似の材料な
どは、存在する場合には、本組成物が示す強度および骨形成性（骨誘導および骨
導）の操作可能な特性の範囲を拡大するために含められる。

【００３４】 ゼラチンの製造は、コラーゲンの部分加水分解に基づく。コラーゲンは皮膚、
骨、軟骨、腱およびその他の結合組織から入手可能である。皮膚および骨からは
I型およびIII型のコラーゲン分子が得られ、腱からはほぼ純粋なI型コラーゲン が得られ、軟骨からはII型および稀な種類のコラーゲン分子の混合物が得られる
。ゼラチン分子はコラーゲンの三本鎖ヘリックスに類似しているが、それらは部
分的に加水分解を受けている。その結果、それらは溶液中ではほとんど構造をも
たない。しかし、溶液が冷却されるに従って、粘性が高まり、溶液からゲルへの
相転移が起こる。この相転移は加熱により可逆性である。

【００３５】 ゼラチン溶液の設定時間および設定温度は、溶液中のゼラチンの濃度、ゼラチ
ン分子の分子量または固有粘度、ならびに溶液のpHに依存的である。等電点、す
なわちゼラチン分子が電気的に中性であるpHでは、設定時間が最も短くなる。

【００３６】 コラーゲンの部分加水分解はいくつかの方法によって行いうる。タイプAの工 程は最も容易かつ最も迅速な工程であり、コラーゲンを部分加水分解するために
希酸（例えば、1M HClよりも薄いもの）を用いる。タイプAの工程では一般にブ タ皮膚および脱灰されたブタ骨が用いられる。タイプBの工程では、コラーゲン の部分加水分解のためにアルカリ溶液を用いる。タイプBの工程では一般にウシ 皮膚および脱灰されたウシ骨が用いられる。さらに、コラーゲンの部分加水分解
のためにペプシンなどの酵素を用いてもよい。ペプシンは芳香族アミノ酸同士の
間のペプチド結合を選択的に切断する。コラーゲンでは、ペプシン処理によって
テロペプチドを含む天然型コラーゲンがアテロペプチド材料へと変換され、この
ためにコラーゲンの三次構造で生じうる鎖間ジスルフィド結合の程度が減少する
。

【００３７】 本方法の一例としては、骨の粉砕および脱脂を行った後に0.5N HCl中での脱灰
を行い、続いて約300mg／L ペプシン（0.5M酢酸中）中に33℃で24時間浸漬する ことにより、本組成物を移植しようとする種の骨からゼラチンを調製する。本発
明者らは、1回目を約30℃、2回目を約33℃としてこのような抽出を2回行い、続 いて産物をプーリングすることにより、ゼラチンの収率が高まることを見いだし
た。ペプシンを変性させるために、この結果得られた溶液のpHを水酸化ナトリウ
ムによって約7.0にする。残るコラーゲンの変性およびゼラチンへの完全な変換 を生じさせるために、溶液の温度を約12〜30分間にわたって約60〜65℃に高め、
ゼラチンが可溶性を維持する19〜20℃または類似の温度に戻す。微粒子を除くた
めにこの結果得られた溶液を濾過し、分子量カットオフ値が30K〜100K（30K〜10
0K MWCO）である透析膜または透析濾過膜内にて蒸留水に対して48時間の透析ま たは透析濾過を行う。

【００３８】 本発明の1つの態様では、このようにして製造されたゼラチンを続いて、好ま しくは密封可能なバイアル中で、凍結乾燥する。バイアルを窒素、アルゴンなど
の乾燥した不活性ガスで満たして密封し、続いて密封環境で加熱滅菌を行う（ま
たは、乾燥機中で例えば約121〜130℃に加熱する）。この処理を行うと、後に可
溶化させた際にゼラチンの動粘性率が高まり、約38℃でのゲル化を実現するため
に骨ペースト中で用いる必要のあるゼラチンの有効濃度をこれまで可能であった
よりも低くできることが明らかになっている。密封環境内での残存が許容される
湿度の程度に応じて、後に測定される動粘性率の上昇の程度を用量依存的な様式
で制御することができる（粘性率の上昇は加湿によって消失する）。凍結乾燥お
よび熱処理の後に、約11〜19％、好ましくは約15〜19％（w/w）のゼラチンを含 む最終組成物が得られるような十分に高い有効濃度となるように、ゼラチンをリ
ン酸緩衝生理食塩水（PBS）または水に再び溶解する。この工程により改良され る結果は、このように処理されたゼラチンが、このような処理を行わない場合の
20〜45重量百分率に対して、約15〜19重量百分率の有効ゼラチン濃度でゲルにな
るという点である。この違いは、凍結乾燥した材料の熱処理の有無により、上記
の通りに製造されるゼラチンの動粘性率の間に差がみられることから明らかであ
る。凍結乾燥（または他の形式による乾燥および除湿）および熱架橋を行った場
合には、このような処理を行わない場合よりも、同一濃度のゼラチンに関する熱
処理材料の粘性は高く、設定温度は低くなる。

【００３９】 本発明の1つのさらなる態様では、ブタゼラチンなどの市販グレードのゼラチ ンを骨ペーストの製造に用いる。市販グレードのブタゼラチンは医薬品用カプセ
ルの生産などにおいて周知であり、止血用に用いられる不溶性基質であるゲルフ
ォーム（GELFOAM）（登録商標）として知られる製品の製造にも用いられている 。この態様のこの面においては、例えば、ダイナゲル社（DynaGel, Inc.）（Plu
mmer St. & Wentworth Ave.、Calumet City、IL 60409）、バイスゼラチン社（V
yse Gelatin Company）（5010 North Rose Street、Schiller Park、IL 610176 ）などから販売されている、約275ブルーム（bloom）を含む、250〜300ブルーム
の市販グレードのブタゼラチンなどの高品質の市販ブタゼラチンを購入し、適切
な耐久性パッケージまたは二重パッケージによってパッケージ化した後に、適切
な線量の滅菌照射を行うことによって滅菌する。例えば、約2〜3MRadのCo^６０に
よる照射または別のγ線線源からの等価な滅菌線量の放射線照射を行う。γ線照
射後に、当技術分野で知られた標準的な加圧条件下でゼラチンの加圧滅菌を行う
。これらの処置に続いて、滅菌されたゼラチンのパッケージの完全性を検査する
。

【００４０】 加工をさらに行う前に、滅菌されたゼラチンを滅菌パッケージから取り出し、
滅菌粉砕器またはブレンダー中で粉砕して粒子径を約1.5mmまたはそれ未満とす る。このような粉砕の後にゼラチン粒子を脱灰骨基質（DBM）とよく混合し、こ の混合物が所定の望ましい設定温度で水性溶媒への溶解に対する抵抗性をもつこ
とを確かめる。したがって、例えば、混合物をヒトに移植しようとする場合には
、混合物が約38℃に加熱した水または生理食塩水への溶解に対する抵抗性をもつ
ことを確かめる。溶解が生じた場合には、混合物が望ましい設定温度で確実に固
体であるように、製剤にさらにゼラチンを添加する。本発明のこの面によれば、
骨形成蛋白質（BMP）または他の骨形成性増殖因子が存在しない場合には、DBMは
約1％から約37％までの範囲、好ましくは約24〜33％の範囲で存在することが好 ましく、それらが存在する場合にはDBMの濃度を下げることができる。ゼラチン は望ましい設定温度に応じて、約12〜30％の範囲で存在することが好ましい。

【００４１】 DBMとの混合に続いて、組成物を、もし存在する場合には、ハイドロキシアパ タイトなどの無菌リン酸カルシウム組成物、またはより好ましくは滅菌された皮
質-海綿骨片と混合する。皮質海綿骨片の固形材料は約30〜40％に過ぎず、その 残りの体積は空隙スペースであるため、体積ベースで約100％（v/v）の皮質海綿
骨片を含み、組成物の60〜75％（v/v）がゼラチン／DBMもしくはゼラチン／BMP または他の増殖因子の混合物から構成される組成物から、本発明の最終的な加熱
滅菌骨ペースト組成物を形成する。

【００４２】 混合に続いて、上記の放射線照射および加熱滅菌骨ペースト組成物を、本骨ペ
ースト組成物が望ましい設定温度またはそれ未満の温度で水性溶液への溶解に対
する抵抗性をもつことを確かめるために、さらに一貫性検査にかける。本発明の
この面で極めて重要なことは、移植後に本組成物が生理的温度で直ちに液化する
のであれば、組成物の溶解が急速すぎることにより、骨形成の誘導に関する本組
成物の有効性が低下するという点である。最終組成物が所望の設定温度で固体状
態を維持しないような状況においては、組成物が所望の温度で固形であるように
ゼラチンを添加してその濃度を高める。

【００４３】 本発明の組成物の製造方法によれば、ゼラチンは、組成物を移植しようとする
ものと同じ種または異なる種のいずれに由来するものでもよい。例えば、ヒト、
ブタ、ウシ、魚類、ウマ、ネコまたはイヌのゼラチンを、骨、皮膚、腱または軟
骨などのコラーゲン源から採取し、続いてDBMまたは他の骨形成性（骨誘導性ま たは骨導性）材料と混合することができる。上記の通り、コラーゲンは、ライミ
ング（liming）、酸性化、またはペプシンもしくは類似の酵素処理による酵素抽
出に続いて加熱もしくは他の手段による変性を加えることによってゼラチンに変
換される。組織を咀嚼した後に、長いコラーゲン鎖内部の架橋を切断しうる処理
をさらに行うことによって組織からゼラチンを採取してもよい。1つの態様では 、組織を粉砕した後に、約2〜40℃の0.1N酢酸などの希酸中に約24〜72時間浸漬 する。ペプシンなどの酵素を十分な高濃度となるように添加することが好ましい
。処理開始時に約10〜20,000 i.u.／l、100〜2,000 i.u.／lの範囲の濃度または
類似の濃度となるようにペプシンを添加し、用いた酵素濃度に従って処理時間を
調整する。遠心処理などによって組成物から固形物を除去し、分子が約50,000ダ
ルトンまたはそれ以上である溶液中の上清材料を保持する。これは、分子量カッ
トオフ値50,000ダルトンの膜の内部に入れた上清を溶液に対して数回交換しなが
ら行う透析、類似の分子量カットオフ値（MWCO）を有する膜に対する限外濾過、
または分子量カットオフ値が50,000ダルトンの媒体を用いるゲル浸透クロマトグ
ラフィーを非制限的に含む当技術分野で知られた数多くの方法の任意のものによ
って行いうる。ゼラチンのMWCOが高いほど収率が低下することを当業者は理解す
ると思われる。したがって、MWCOが約1000ダルトンと低い低MWCOのゼラチン調製
物も、望ましくない低分子量種も保持されうるという認識の下で用いることがで
きる。さらに、上記に開示した凍結乾燥および熱架橋を含めることにより、高分
子量材料の収率は高まる。

【００４４】 本発明の1つの態様では、前記の抽出によって得られたゼラチン溶液を、例え ば約50〜65℃での熱処理によって変性させる。続いて変性蛋白質を乾燥させ、上
記の不活性ガス、熱架橋の段階にかける。その後はゼラチンを乾燥状態で保存す
るか、生理的に許容しうる溶液により再構成して凍結状態で保存するか、再構成
後にそれを凍結乾燥するか、またはそれを例えば揮発性有機溶媒中に沈殿させて
ゼラチンの濃度が約15〜19％（w/w）の範囲となるように等張生理食塩水などの 溶液中に再構成する。

【００４５】 脱灰骨は好ましくは粉末化形態であり、大きさの範囲が直径約80〜850μmであ
る粒子から構成されることが好ましい。脱灰骨粉末を製造するための方法は当技
術分野で周知であり（例えば、この目的で本明細書に組み入れられる米国特許第
5,405,390号を参照されたい）、このため、本明細書では詳細には触れない。標 準的な技法によって抽出された脱灰骨粉末を上記の通りに調製したゼラチン溶液
と混合し、脱灰骨粉末を約1〜40％（w/w）含む組成物を生成する。骨形成蛋白質
（BMP）が存在する場合には、それは組成物中に必要なDBMの比率を低下させる。
BMPは、存在するDBMの量（1〜40％w/w）に応じて、約0.0001〜10mg／ml、0.001m
g／ml〜4mg／mlの範囲の濃度、または類似の濃度で存在することが好ましい。

【００４６】 本発明のいくつかの態様において、および加熱滅菌骨ペーストによって形成さ
れる結合の強度が重要な特定の整形外科的用途のためには、生物活性ガラスを添
加することが好ましい。生物活性ガラスが添加されると、組成物の付着性は低下
するが、装着後の組成物の硬度は高まる。したがって、直径が約0.5〜710μmの 範囲にあるバイオグラス（BIOGLASS）（登録商標）などの生物活性ガラスが、ゲ
ル／脱灰骨組成物に添加される。さらに、約0〜40％（w/w）の範囲で生物活性ガ
ラスを含み、ゼラチンが組成物の約11〜19％（w/w）を占める組成物も考えられ る。

【００４７】 上記の通りに調製された組成物は、特に、例えば水浴中への浸漬などにより、
マイクロ波中での限定的な処理により、シリンジ加温装置内に置くことにより、
または容器を加熱するための多数の他の任意の方法により、温度が約40℃を超え
て上昇した場合には容易にシリンジから押し出すことができる。押し出されたゲ
ルは弾力性で粘着性であり、任意の望ましい形態に容易に成形することができる
。さらに、本組成物はいったん固まると、その強度を保持し、生理食塩水または
水中にほとんど溶けない。

【００４８】 以上の通り、本発明の組成物の一般的な説明を行ったことから、以下に提供す
る例示的な裏づけとなる詳細を考慮に入れることにより、本発明の組成物の調製
および使用に関する以下の指針が提供される。

【００４９】 DBMからのゼラチンは約30℃から37℃の温度で調製すべきである。収率は37℃ での方が高いが（60％）、動粘性率の測定値に基づく品質は30℃で製造されるも
のよりもやや低い。ゼラチンは、コラーゲンをペプシンまたは類似の酵素などの
酵素に対して限定的に曝露させることによって生成させることが好ましい。ペプ
シン濃度は300U／L〜500U／Lに設定するとよく作用するが、本明細書に開示され
る内容に基づいて広範な酵素濃度を検討しうることを当業者は理解すると思われ
る。当業者は、皮膚および腱の酸またはアルカリ処理がペプシン法の代わりにな
ることを理解すると考えられる。

【００５０】 最終組成物は好ましくは、44℃での粘度が約3600センチポアズまたはそれ以上
であるか（粘度／ずり速度プロットの-0.87／秒の線形範囲における測定で）、 または44℃での動粘性率が約0.7センチストークスであるゼラチン溶液を含む。3
8℃でのゲル化が適度な時間で確実に起こるためには、担体相（すなわち、骨形 成性成分が添加されていない）におけるゼラチン濃度は約15〜19％（w/w）であ ることが好ましい。通常、当業者は、本組成物を移植しようとする生物種に応じ
て異なる温度が必要になると思われることを理解すると考えられる。これらの要
求にはゼラチン濃度の変更による対応がなされ、より高いゲル温度が望ましい場
合には濃度を高くし、より低いゲル温度が望ましい場合には濃度を低くする。

【００５１】 本組成物のDBM含有率は、本明細書において、DBMのみで認められるものと同様
の骨形成性を得るために必要な濃度によって規定される。本発明者らは、本組成
物中に約5〜40％（w/w）のDBMがあれば有効であることを見いだした。約5％より
も低い場合には、添加されたBMP（成分iii）が組成物中に存在する場合を除き、
骨形成の点では作用がほとんどないように思われるが、この場合にはDBM濃度を かなり低下させても完全になくしてもよいと思われる。通常、当業者はこの開示
に基づいて、さまざまな濃度および組成の骨形成蛋白質または他の骨形成性もし
くは骨導性因子を添加することにより、組成物中のDBMの重量百分率を上下に調 節しうることを理解すると考えられる。さらに、本組成物を移植しようとする生
物種に応じてDBMの重量百分率を上下に調節しうることも理解されると考えられ る。

【００５２】 本発明者らはインビボ試験において、DBM含有率が15〜33％の本組成物はいず れも石灰化組織を産生させることを見いだした。本発明者らは、DBM濃度が約19 ％（w/w）を上回る限り、組成物中のDBMの量と骨誘導レベルとの間には高い相関
があることを見いだした。DBMに関する量の上限は約38〜40％（w/w）である。し
たがって、この成分に関しては1〜40％（w/w）DBM、より好ましくは5〜30％（w/
w）、7〜33％（w/w）または15〜25％（w/w）が望ましい。

【００５３】 本発明者らは、動物への移植後約2週間以内にゼラチンが完全に吸収されるこ とを組織学的に観察している。さらに、軟骨および石灰化骨が2週間以内に形成 され、第4週までには成熟骨が明瞭となる。これらの試験において、動物は試験 期間中に肉眼的健康異常ならびに刺激、血腫、痛み、発熱および体重減少の徴候
を何ら示さなかった。

【００５４】 本発明による組成物は、それがゼラチンおよび骨形成性成分（i〜iv）を含む か否かを問わず、皮質性、海綿性または皮質性および海綿性の骨片に対する担体
として作用する。このような組成物は、比較的大きな骨空隙を充填するために有
用である。さらに、これらの骨片が脱灰されていない場合には、それらは、ゼラ
チン単独またはゼラチン＋骨形成性成分（i〜iv）によっては示されない付加的 スペクトルの生物特性をもたらす。このような骨片が存在する場合、それらの大
きさは約80μmから約10mmの範囲にあることが好ましい。

【００５５】 本発明の1つのさらなる態様においては、ゼラチンおよび骨形成性成分（i〜iv
）の組成物が、注入成形、真空成形、回転成形、ブロー成形、押し出しまたは他
の方法によって固体形状に成形される。このような形状は、椎骨円板、寛骨臼半
球、寛骨臼カップを修復するための成形可能な挿入物、管、空隙充填のための楕
円体形、および骨セメントが健康な骨組織に侵入することを防ぐ目的で、種々の
骨の髄内管（すなわち、骨髄を含む骨の部分）を塞ぐために有用な髄内プラグの
形状をとることが望ましいと考えられる。これらの形状は、例えば、組成物の温
度をその液化温度よりも高めること（例えば、約45℃）、および適切な形状の型
の中で組成物をゲル化させることによって生じる。このような形状のためには、
脊椎動物宿主への移植後にも形状が確実に固定されているように、ゼラチン含有
率はできるだけ高い方が好ましい。

【００５６】 本発明の組成物およびその調整方法を説明したことから、次に本組成物の使用
様式を述べる。本組成物の使用方法には、適切な形状をもつインプラントを製造
するために、インビボもしくはエクスビボにおける射出を介した押し出しまたは
手作業または機械による成形と、これに続く所望の移植部位への移植が含まれる
。本組成物は、癒合不全骨折部位に直接適用しても、癒合させようとする椎骨間
に注入しても、所望の任意の生理的形状へと成形してもよく、骨導または骨誘導
が望ましい任意の整形外科的文脈において適用してもよい。本組成物はさらに、
インプラントの骨形成性ならびにインプラント周囲の骨導性および骨誘導性を高
めるために、同種移植片、自己移植片、異種移植片、金属性、合成性、生体吸収
性または任意の他のタイプのインプラントをコーティングするために用いること
もできる。本発明の骨ペースト組成物のこの使用法は、多孔質インプラントに関
して特に有用である。

【００５７】 本発明の一般的な説明を行ったことから、本発明の具体的な特徴および用途を
説明するために以下の実施例を提供する。本発明は、以下に述べる実施例の詳細
に限定されるものではなく、本発明の範囲は本明細書に添付の特許請求の範囲に
よって規定されることを認識する必要がある。

【００５８】実施例1： 加熱滅菌骨ペーストの設定温度を規定するための手順 ： 加熱滅菌骨ペーストの設定温度が、この手順において規定される。凍結状態で
保存されていた基質のアリコートを約45℃で解凍した後に、シリンジ中に吸引し
た。続いてこのアリコートを管にシリンジ注入し、38℃で15分間の平衡化を行っ
た。38℃の蒸留水を入れたバイアルに別のアリコートをシリンジ注入し、15分間
放置した。この時間の後、双方の基質アリコートはいずれも固体であり、蒸留水
への基質の溶解はほとんどまたは全く認められなかった。

【００５９】実施例2： 加熱滅菌骨ペースト中のゼラチン濃度を規定するための方法 ： 各組成物に関して、基質を以下の通りに設定する：

【００６０】 粉末形態のこれらの集積物をビニール袋、または類似の柔軟ではあるが液体不
透過性である容器に入れた後、指示量の水を添加した。袋を密封し、粉末が十分
に混合されるように振盪した。水を添加し、袋を再び密封した。約42〜47℃に設
定した水浴中に袋を浸した状態で材料を混練し、続いて実施例1の記載の通りに3
8℃での固化に関して組成物の試験を行った。

【００６１】実施例3： 無胸腺ラット筋肉内モデルにおける、グラフトン（Grafton）（登録商標）（グ リセリン中のDBM、Osteotech）、DBM、およびDBMの懸濁化された加熱滅菌骨ペー ストの骨誘導性における比較 ： 市販のグラフトン（Grafton）（登録商標）（グリセリン中のDBM、Osteotech ）、DBM、粉末化DBM、およびDBMが懸濁化された本発明の加熱滅菌骨ペーストを 、ストレーツ（Strates）およびユリスト（Urist）のモデルに従った無胸腺ヌー
ドラット（Urist、Clin. Ortho. Rel. Res. 71：271〜278、1970）の筋肉内に移
植した。標準的な骨肉腫誘導アッセイ法において、本発明の加熱滅菌骨ペースト
中に含まれるDBM、およびグラフトン（Grafton）（登録商標）中に含まれるもの
の骨誘導性は同一であることが明らかになった。21日後に移植片を除去し、X線 および原子吸光によって分析した。この分析により、カルシウム沈着量は、加熱
滅菌骨ペースト／DBM組成物のインプラントについては0.40±0.17g／mlであり、
グラフトン（登録商標）では0.039±0.094g／mlであり、DBM単独では0.15±0.07
2g／mlであることが判明した。すなわち、本発明の組成物中のDBMは、DBM単独よ
りも骨誘導性が2.7倍高く、グラフトン（登録商標）よりも骨誘導性が10.7倍高 かった。これらの差はすべて統計的に有意であった。さらに、グラフトン（登録
商標）の骨誘導効果は一定しておらず、10個のインプラントのうち骨形成が生じ
たのは6個のみであった。本発明のDBM／加熱滅菌骨ペーストではすべてのインプ
ラントが骨形成を誘導した。

【００６２】実施例4： 加熱滅菌骨ペーストの製造、動粘性率および38℃でのゲル化のための臨界濃度 ： さまざまな熱滅菌処理（121℃で6時間、130℃で3時間、150℃で2.5時間）を行
ったブタゼラチンの動粘性率を、熱処理を行わなかったブタゼラチンの動粘性率
と比較した。130℃で3時間処理した凍結乾燥ゼラチン試料が55℃の滅菌水に溶解
するには約40〜50分間を要したが、121℃で6時間処理した凍結乾燥ゼラチン試料
が滅菌水に溶解するのに要したのは約10分間に過ぎなかった。150℃で2.5時間処
理したブタ材料は不溶性であった。本発明者らは、非処理ブタ試料のものと比較
して、熱処理（121℃および130℃）がなされたブタ試料の動粘性率が上昇するこ
とを見いだした。ヒト材料に関する同様の試験でも（121℃、6時間）、この結果
が実質的に再現された。

【００６３】 バックグラウンドとして、脱灰骨基質粉末（DBM）とも呼ばれる大きさが250〜 850μmの範囲にある脱灰ヒト皮質骨粉末から抽出されたゼラチンから、0.5M酢 酸およびペプシンによる処理により、加熱滅菌骨ペーストを製造した。DBMは30 ℃で5〜24時間インキュベートした。上清を混ぜ合わせ、1N NaOHでpHを7.0に調 整してペプシンを失活させた。溶液のすべての部分が15分間の全体にわたり60℃
で処理されるように、60℃の水浴に浸した管を通してこの溶液をポンプにより一
定速度で流した後、氷水で冷却した。この溶液を遠心し、上清に対して、分子量
カットオフ値30,000ダルトンの膜に対する透析または透析濾過のいずれかを行っ
た。続いて保持物質を凍結乾燥した。対照として、熱処理を加えずに乾燥試料を
保持した。残りの材料は、まず100ミリトルに減圧した後に窒素を入れて密封し た密封バイアル中にて加圧滅菌を行った。加圧滅菌は121℃で6時間続けるか、ま
たは試料を130℃で3時間処理した。

【００６４】 図3では、121℃で6時間処理したブタ材料の4つの試料（黒い丸）と、130℃で3
時間処理したブタ材料の4つの試料（白い丸）の熱処理の結果を、処理していな いブタ材料の2つの試料（黒い三角）と比較している。さらに、121℃で6時間処 理したヒト材料の1つの試料（黒い四角）を、処理していないヒト材料の1つの試
料（黒い菱形）、121℃での6時間の処理を大気湿度（湿度約1％）の窒素中で行 ったヒト材料の1つの試料（白い菱形）と比較している。

【００６５】 このように処理した材料の希釈濃度（リン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4、25℃）
中にて0.5％、0.25％、0.125％、0.0625％）での動粘性率を、44℃でウッベルホ
ード（Ubbelhode）粘度計を用いて測定した。図3は、動粘性率（センチストーク
ス）を濃度に対してプロットしたものである。線形回帰をゼロまで外挿し、濃度
ゼロでの動粘性率を判定した。

【００６６】 種々の加熱滅菌骨ペースト組成物に関する設定温度を測定するために、水中で
のゼラチン濃度が全混成物の15w/w％から全混成物の19w/w％までのものを用意し
た。検討を行った加熱滅菌骨ペースト混成物はすべて、全混成物中33w/w％のDBM
を含んでいた。加熱滅菌骨ペーストが固体であるか液体であるかを検討するため
に、45℃、43℃、41℃、40℃、38℃および35.5℃というさまざまな外界温度を用
いた。設定温度は、引き続いて外界温度を低下させること、および外界温度を高
めることの両方によって測定した。ヒト体温をわずかに上回る38℃〜39℃で固体
であった加熱滅菌骨ペースト混成物におけるゼラチンの臨界濃度は、33℃で処理
し、混成物の33w/w％がBMPであって残りがPBSまたは水であるヒトゼラチンにつ いては、全混成物の15w/w％〜19w/w％であった。33℃で処理したヒトゼラチンの
濃度ゼロでの動粘性率は0.65センチストークスであった。動粘性率が低いヒトゼ
ラチン溶液では臨界濃度が約19w/w％を上回ることが明らかになった。これと対 応して、粘度が約0.65センチストークスよりも高いゼラチンは、約15％（w/w） よりも低い濃度で熱架橋を起こすと考えられる。

【００６７】実施例5 本発明の加熱滅菌骨ペーストの製造のための手順 ： この実施例は、ゼラチンおよび脱灰骨から骨ペーストを製造するための1つの 手順を提供する。組成物の全質量に占める比率が必要な場合には、以下の成分を
計量する（百分率は混成物の全重量に占める割合である）： 乾燥脱灰骨： 1〜40％（w/w） 凍結乾燥した熱架橋性ゼラチン：11〜30％（w/w） バイオグラス（BIOGLASS）（登録商標）： 0〜40％（w/w） 骨形成蛋白質： 0〜10mg／ml

【００６８】 これらの成分を乾燥下で十分に混合し、水、リン酸緩衝生理食塩水または任意
の他の生理的に許容しうる液性担体の添加によって組成物集積物の平衡化を行う
。この組成物をこの形でパッケージ化してもよく、後に水で再構成するために凍
結乾燥してもよい。本組成物の柔軟性は、ゼラチンの液化点を十分に上回る温度
で組成物を加熱し、続いて組成物がゲル化する温度までそれを冷却させることに
よって得られる。

【００６９】実施例6 本発明の放射線照射および加熱による滅菌がなされた骨ペースト組成物の製造の ための手順 ： 本発明のこの局面に従って、市販グレードのブタゼラチンを骨ペーストの製造
に用いた。ダイナゲル社（DynaGel, lnc.）（Plummer St. & Wentworth Ave.、C
alumet City、IL 60409）から275ブルーム（bloom）の市販グレードのブタゼラ チンを購入して、密封性の二重パッケージ中にパッケージ化し、2〜3MRadのCo^{６ ０} の照射によって滅菌した。γ線照射後に、標準的な加圧滅菌条件下で（20分間
、121℃）ゼラチンの加圧滅菌を行った。これらの処置に続いて、滅菌されたゼ ラチンのパッケージの完全性を検査した。

【００７０】 加工をさらに行う前に、滅菌されたゼラチンを滅菌パッケージから取り出し、
滅菌粉砕器またはブレンダー中で粉砕して粒子径を約1.5mmまたはそれ未満とし た。このような粉砕の後に、滅菌したソーセージ練り器でゼラチン粒子を脱灰骨
基質（DBM）とよく混合し、この混合物の38℃の水性溶媒への溶解に対する抵抗 性を検討した。約24〜33％の濃度を含む、約1％から約37％までの濃度でDBMを含
む組成物をこのようにして調製した。骨形成蛋白質（BMP）または他の骨形成性 増殖因子を添加した組成物では、DBMの濃度を最低0％まで低下させた。ゼラチン
は望ましい設定温度に応じて組成物中に、約12〜30％の範囲の濃度で含まれた。

【００７１】 DBMとの混合に続いて、組成物を、もし存在する場合には、ハイドロキシアパ タイトなどの無菌リン酸カルシウム組成物、または滅菌された皮質-海綿骨片と 混合した。皮質海綿骨片の固形材料は約30〜40％に過ぎず、その残りの体積は空
隙スペースであるため、体積ベースで約100％（v/v）の皮質海綿骨片を含み、組
成物の60〜75％（v/v）がゼラチン／DBMもしくはゼラチン／BMPまたは他の増殖 因子の混合物から構成される組成物を調製し、これから本発明の最終的な加熱滅
菌骨ペースト組成物を形成した。

【００７２】 混合した後に、上記の放射線照射および加熱滅菌骨ペースト組成物を、本骨ペ
ースト組成物が望ましい設定温度またはそれ未満の温度で水性溶液への溶解に対
する抵抗性をもつことを確かめるために、さらに一貫性検査にかけた。

【００７３】 前記の処理によって、以下の特性を備えた組成物が製造された：47±2℃で前 記組成物を含むシリンジのプランジャーに2644±1グラムの重力を加えた場合の 容量1立方センチメートルのBD（Beckton-Dickinson）スリップチップ（slip-tip
）シリンジからのメルトフローインデックス（MFI）が約0.00719g／秒を上回る 、または容量5立方センチメートルのBDスリップチップシリンジからの値が約0.0
3497g／秒を上回る。このような組成物のさらなる特性は、それを38±0.5℃の蒸
留水中に置いた場合に5分以内に溶解しないことである。

【００７４】 これらの組成物の移植により、移植部位で骨形成の誘導がもたらされると期待
される。

【００７５】参考文献

【図面の簡単な説明】

【図１】 既存の骨移植用材料の一覧である。

【図２】 骨の脱灰工程を表している。

【図３】 加熱滅菌がなされた、または加熱滅菌がなされていない乾燥状態
のゼラチンを水中に溶解して動粘性率を測定した場合の、動粘性率（センチスト
ークス）と濃度（％）との関係を描いたグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フェルトン フィリップ エイ． アメリカ合衆国 フロリダ州 アラシュア イノベーション ドライブ １ (72)発明者 ジョウ レベッカ アメリカ合衆国 フロリダ州 アラシュア イノベーション ドライブ １ Ｆターム(参考） 4C081 AB03 AB04 AB06 BA16 CC04 CD022 CD032 CD112 CD122 CD152 CD28 CD29 CE02 CE10 CF011 CF021 CF031 CF041 CF061 DA01 DA12 DA14 DC12 EA14

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 必要とするレシピエントに用いるための、実質的に生体吸収
   性の骨形成性成分のための担体として加熱滅菌ゼラチンを含む、移植可能な骨ペ
   ースト組成物。
2. 【請求項２】 癒合不全骨折、歯周堤増強術、頭蓋顔面手術、脊柱または他
   の関節の固定術、脊椎固定術およびインプラント固定において移植される、請求
   項1記載の骨ペースト組成物。
3. 【請求項３】 ゼラチンが、移植しようとする生物の体温またはそれをわず
   かに上回る温度で熱架橋性である、請求項1記載の組成物。
4. 【請求項４】 約38℃でゲル化する、請求項3記載の組成物。
5. 【請求項５】 ゼラチンが、組成物の重量に占める比率として約11〜19％（
   w/w）の範囲のゼラチン濃度で存在する、請求項3記載の組成物。
6. 【請求項６】 骨形成性成分が以下からなる群より選択される、請求項5記 載の組成物： （i）脱灰骨、好ましくは加熱滅菌骨ペーストを移植しようとする種に由来す る脱灰骨；または （ii）生物活性ガラスセラミック、バイオグラス（BIOGLASS）(登録商標)、生
   物活性セラミック、リン酸カルシウムセラミック、ハイドロキシアパタイト、ハ
   イドロキシアパタイトカーボネート、コラリンハイドロキシアパタイト、か焼骨
   （calcined bone）、皮質骨片、海綿骨片、リン酸三カルシウム、類似の材料、 もしくはそれらの混合物；または （iii）天然型もしくは組換え型の、骨形成蛋白質、骨形成性蛋白質もしくは ペプチドなど、TGF-β、骨髄抽出物、血管増殖因子、再生増殖因子、PDG、また はそれらの混合物；または （iv）（i）〜（iii）の混合物。
7. 【請求項７】 ゼラチン脱灰骨基質（demineralized bone matrix）または その両方が骨ペーストを移植しようとする種に由来する、請求項6記載の組成物 。
8. 【請求項８】 DBMが全混成物重量の約1〜40％（w/w）の範囲で存在する、 請求項7記載の組成物。
9. 【請求項９】 DBMが全混成物重量の約15〜33％（w/w）の範囲で存在する、
   請求項8記載の組成物。
10. 【請求項１０】 生物活性ガラスがバイオグラス（BIOGLASS）(登録商標)で
    ある、請求項6記載の組成物。
11. 【請求項１１】 成分（ii）が全組成物質量の約0〜60％（w/w）の範囲で存
    在する、請求項6記載の組成物。
12. 【請求項１２】 抗生物質、天然型もしくは組換え供給源に由来する骨形成
    蛋白質および他の蛋白質、湿潤剤、グリセリン、デキストラン、カルボキシメチ
    ルセルロース（CMC）、増殖因子、ステロイド、非ステロイド性抗炎症性化合物 、またはそれらの組み合わせを含む、請求項6記載の組成物。
13. 【請求項１３】 約0.0001〜10mg／mlの範囲で天然型または組換え型の骨形
    成蛋白質を含む、請求項6記載の組成物。
14. 【請求項１４】 凍結溶液である、または凍結乾燥されている、請求項1記 載の組成物。
15. 【請求項１５】 ゼラチンがヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、魚類、ウマ、ネコ
    、イヌのものであるか、またはそれらの混合物である請求項1記載の組成物。
16. 【請求項１６】 ゼラチンが酵素的抽出、酸抽出、またはアルカリ抽出を介
    するヒトコラーゲン源に由来する、請求項1記載の組成物。
17. 【請求項１７】 ヒトコラーゲン源がヒト皮膚、骨、軟骨、腱、結合組織ま
    たはそれらの混合物である、請求項16記載の組成物。
18. 【請求項１８】 以下の段階によって製造される、請求項17記載の組成物：
    （a）約30℃における、ペプシンによるコラーゲン源の処理段階、不溶性残渣か らの可溶性上清の分離段階、および可溶性上清の保持段階； （b）約33℃における、ペプシンによる不溶性残渣の処理段階、不溶性残渣から の可溶性上清の分離段階、および可溶性上清の保持段階； （c）このようにして得られた可溶性上清のプール段階； （d）ゼラチン製造のための制御された条件下における、プールされた上清の熱 変性段階； （e）乾燥ゼラチンの製造のためのゼラチンの水分除去段階； （f）乾燥ゼラチンの加熱滅菌段階；および （g）乾燥ゼラチンが約11〜19％（w/w）の最終濃度で存在するような、既知の質
    量の乾燥ゼラチンと既知の質量の骨形成性化合物との混合段階。
19. 【請求項１９】 変性が少なくとも60℃の加熱によって達成される、請求項
    18記載の組成物。
20. 【請求項２０】 ゼラチンの分子量が約50,000ダルトンを上回る、請求項19
    記載の組成物。
21. 【請求項２１】 乾燥ゼラチンの加熱滅菌の段階が、約5分間〜18時間の範 囲で、約121℃〜130℃の範囲で行われる、請求項20記載の組成物。
22. 【請求項２２】 骨形成性成分が粉末化形態の脱灰骨基質であって、大きさ
    が直径約80〜850μmの範囲にある粒子から構成される、請求項1記載の組成物。
23. 【請求項２３】 約1〜40％（w/w）の脱灰骨基質粉末を含み、脱灰骨基質粉
    末が存在しない場合には少なくとも0.0001mg／mlの濃度で骨増殖因子が存在する
    、請求項22記載の組成物。
24. 【請求項２４】 骨増殖因子が、天然型もしくは組換え型の骨形成蛋白質、
    TGF-β、骨誘導性因子、骨導性因子またはそれらの混合物である、請求項23記載
    の組成物。
25. 【請求項２５】 生物活性ガラスが、約0.5〜710μmの範囲の直径を有する バイオグラス（BIOGLASS）(登録商標)である、請求項6記載の組成物。
26. 【請求項２６】 皮質性、海綿性、または皮質性および海綿性の骨片をさら
    に含む、請求項1記載の組成物。
27. 【請求項２７】 骨片の大きさが80μm〜10mmの範囲である、請求項26記載 の組成物。
28. 【請求項２８】 注入成形、真空成形、回転成形、ブロー成形、押し出しま
    たは他の方法によって固体形状に成形された、請求項1記載の組成物。
29. 【請求項２９】 形状が空隙充填、髄内プラグ形成および埋伏移植のための
    椎骨円板、寛骨臼半球、管、楕円体、長円形および「U」型から選択される、請 求項28記載の組成物。
30. 【請求項３０】 インビボ骨形成を必要とするレシピエントにおいて誘導す
    るための方法であって、実質的に生体吸収性の骨形成性成分のための担体として
    加熱滅菌ゼラチンを含む、移植可能な骨ペースト組成物の有効量を移植する段階
    を含む方法。
31. 【請求項３１】 癒合不全骨折の修復、歯周堤増強の実現、頭蓋顔面手術の
    実施、インプラントの固定、脊柱もしくは他の関節の固定術、脊椎固定術または
    埋伏移植を含む、請求項30記載の方法であって、組成物をこのような治療を必要
    とするインビボ部位に移植する段階を含む方法。
32. 【請求項３２】 組成物をそれが液体または展性の高い状態に留まる第1の 温度で、シリンジから押し出す段階、および移植しようとする生物の体温と等し
    いか、またはそれをわずかに上回る第2の温度で、そのゲル化に伴って該組成物 から弾力性、粘着性および易成形性の形態を形成させる段階を含む、請求項31記
    載の方法。
33. 【請求項３３】 熱架橋性のゼラチン担体を含む加熱滅菌組成物を調製する
    段階、および該組成物中に実質的に生体吸収性の骨形成性成分を懸濁化させる段
    階を含む、移植可能な移植片を製造するための方法。
34. 【請求項３４】 骨形成性成分が以下より選択される、請求項33記載の方法
    ： （i）脱灰骨、好ましくは加熱滅菌骨ペーストを移植しようとする種に由来す る脱灰骨；または （ii）生物活性ガラスセラミック、バイオグラス（BIOGLASS）(登録商標)、生
    物活性セラミック、リン酸カルシウムセラミック、ハイドロキシアパタイト、ハ
    イドロキシアパタイトカーボネート、コラリンハイドロキシアパタイト、か焼骨
    （calcined bone）、皮質骨片、海綿骨片、リン酸三カルシウム、類似の材料、 もしくはそれらの混合物；または （iii）天然型もしくは組換え型の、骨形成蛋白質、骨形成性蛋白質もしくは ペプチドなど、TGF-β、骨髄抽出物、血管増殖因子、再生増殖因子、PDGF、また
    はそれらの混合物；または （iv）（i）〜（iii）の混合物。
35. 【請求項３５】 注入成形、真空成形、回転成形、ブロー成形、押し出しま
    たは他の方法によって組成物を所望の形状の固形移植片に成形する段階、および
    ゼラチンが熱架橋を生じる温度で組成物を固化させる段階をさらに含む、請求項
    34記載の方法。
36. 【請求項３６】 形状が空隙充填、髄内プラグ形成および埋伏移植のための
    椎骨円板、寛骨臼半球、管、楕円体、長円形および「U」型から選択される、請 求項35記載の方法。
37. 【請求項３７】 組成物の温度をその液化温度よりも高める段階、および適
    切な形状の型の中で組成物をゲル化させる段階を含む、請求項35記載の方法。
38. 【請求項３８】 組成物が、該組成物中に実質的に生体吸収性の骨形成性成
    分を懸濁化させる前に、乾燥ゼラチンを約5分間〜約18時間の範囲にわたって約1
    21℃〜130℃の範囲で処理することによって加熱滅菌を受ける、請求項33記載の 方法。
39. 【請求項３９】 ゼラチンが滅菌線量のγ線照射によって滅菌される、請求
    項1記載の骨ペースト組成物。
40. 【請求項４０】 成分（a）を体積ベースで60〜75％、および成分（b）を、
    それが存在する場合には、体積ベースで0〜100％の範囲で含み、その実質的な空
    隙体積のために成分（a）のあらゆる体積面への寄与を完全に吸収する、請求項3
    9記載の組成物であって、 成分（a）が、水または水性溶液で平衡化がなされた、約11〜30％（w/w）ゼラ
    チン、24〜33％（w/w）脱灰骨基質を含み、 成分（b）が無菌皮質海綿骨片を含む組成物。
41. 【請求項４１】 成分（a）が約15〜19％ゼラチンを含む、請求項40記載の 組成物。
42. 【請求項４２】 ゼラチンに滅菌線量のγ線照射を行うことを含む、請求項
    33記載の方法。
43. 【請求項４３】 ゼラチンの加圧滅菌によって該ゼラチンの加熱滅菌がなさ
    れる、請求項42記載の方法。
44. 【請求項４４】 ゼラチンが市販グレードのブタゼラチンである、請求項43
    記載の方法。
45. 【請求項４５】 ゼラチンのブルーム数（bloom number）が約250〜300の範
    囲である、請求項44記載の方法。
46. 【請求項４６】 47±2℃で組成物を含むシリンジのプランジャーに2644±1
    グラムの重力を加えた場合に、容量1立方センチメートルのBDスリップチップ（s
    lip-tip）シリンジからのメルトフローインデックス（MFI）が約0.00719g／秒を
    上回る、または容量5立方センチメートルのBDスリップチップシリンジからの値 が約0.03497g／秒を上回る、請求項1記載の組成物。
47. 【請求項４７】 組成物が38±0.5℃の蒸留水中に置かれた場合に5分以内に
    溶解しない、請求項1記載の組成物。
48. 【請求項４８】 インプラントの骨導性、骨誘導性またはオッセオインテグ
    レーション活性を高める方法であって、請求項1記載の組成物によって該インプ ラントをコーティングすることを含む方法。
49. 【請求項４９】 請求項1記載の組成物によってコーティングがなされたイ ンプラント。