JP2009528090A - 石灰化ゼラチンに由来する骨移植材 - Google Patents

Abstract

本発明は、骨から石灰化ゼラチン担体を形成する新規方法を提供する。本発明は、石灰化ゼラチン担体自体と、ＤＢＭ骨製品を含む当該石灰化ゼラチン担体を含む骨製品と、骨から形成される石灰化ゼラチン担体を含むキットと、をさらに提供する。本発明は、ＤＢＭおよびＤＢＭのための石灰化ゼラチン担体の両方が独立して骨ロットに由来する、ＤＢＭ骨製品を作製する方法をさらに提供する。

Description

発明の分野
本発明は、皮質あるいは海綿骨などの骨から石灰化ゼラチン担体を形成する新規方法を提供する。本発明は、石灰化ゼラチン担体自体、ＤＢＭ骨製品を含む当該石灰化ゼラチン担体を含む骨製品、および骨から形成される石灰化ゼラチン担体を含むキットをさらに提供する。本発明は、骨移植製品および石灰化ゼラチン担体の両方が独立して骨ロットに由来する、骨製品を作製する方法をさらに提供する。また、その上に、またはそれに組み込まれて、石灰化担体あるいは骨移植製品を含む、外科的インプラントまたは装置も提供する。本発明は、本発明の石灰化担体、骨製品、または外科的インプラント、あるいは装置を使用して治療する方法をさらに提供する。

発明の背景
骨移植は、外傷、疾病、あるいは変形によって影響を受けた部位の組織を再生成するために、整形外科的外傷および脊髄外科医によって施される一般的処置である。移植材は、患者自身の骨格から得られた骨、組織提供者から得られた同種骨、および多孔セラミックならびにポリマーから構成される合成材を含む。脱灰骨基質（ＤＢＭ）は、ＤＢＭ粒子内の成長因子の存在により、骨形成を積極的に刺激する骨移植の特殊な種類である。同種皮質骨に由来するＤＢＭは、多様な整形外科の症例において広く使用されてきた。しかしながら、ＤＢＭ粒子の性質により、その送達および封じ込めが困難となっている。

ＤＢＭの取り扱い特性を改善するために、いくつかの企業がＤＢＭ粒子をゲル様担体と混合させる製品を開発し、外科手術部位におけるＤＢＭの取り扱いおよび移植封じ込めを改善する取り組みを行ってきた。しかしながら、全ての担体が、ＤＢＭ送達媒体として等しく適切に機能するわけではない。例えば、米国特許第５，０７３，３７３号（特許文献１）に開示される、グリセロールおよびＤＢＭの混合により、成形可能パテが実現されるが、グリセロール成分は水および体液内で高い可溶性を有し、移植部位から容易に押し流される可能性がある。米国特許第６，３０９，６５９号（特許文献２）に開示される、熱可逆的共重合体およびＤＢＭの混合により、担体の可溶性は改善されるが、最終製品は一定しない生物活性を有することが研究により明らかとなっている［Ｗａｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ”．Ｔｒａｎｓ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｓｐｉｎｅ Ｓｏｃ ２０００；１５：３５−３７（非特許文献１）］。米国特許第６，６５２，８８７号（特許文献３）に開示される、別のＤＢＭ製品は、硫酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース、水、およびＤＢＭの混合物である。本製品は取り扱いも便利で灌水に耐性を有するが、再吸収に６〜８週間かかる担体に含有されることが不利な点である。典型的な移植結合が、最初の７２時間以内に発生することから、担体の再吸収の遅延は治癒反応を妨害する可能性もある［Ｌｅｅ ＹＰ，Ｗａｎｇ ＪＣ，Ｋａｎｉｍ ＬＥ，Ｊｏ ＭＪ，Ｄａｖｉｓ Ｍ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＪＲ．“Ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ａｎ ａｔｈｙｍｉｃ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．”Ｔｒａｎｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ Ｓｐｉｎｅ Ｓｏｃ ２００１；１６：８６−８７（非特許文献２）］。

１９００年代初期以降、ゼラチン製造においての骨使用は広く一般的に使用されてきたプロセスである。重量で、骨は骨塩約７０％、コラーゲン約２０％、成長因子約５％、および水５％から構成されている［Ｂｏｓｔｒｏｍ，ＭＰ，Ｂｏｓｋｅｙ Ａ，Ｋａｕｆｍａｎ ＪＫ，Ｅｉｎｈｏｒｎ ＴＡ．“Ｆｏｒｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ．”Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ ＪＡ，Ｅｉｎｈｏｒｎ ＴＡ，Ｓｉｍｏｎ ＳＲ．（ｅｄｓ）．Ｒｏｓｅｍｏｎｔ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ，ｐｐ．３２７−３２８（２０００）（非特許文献３）］。多様な処理方法を通して、骨の架橋コラーゲン成分は、分解され、ゼラチンを生成することが可能である。ゼラチン分子は、室温および室温以下で相互作用して剛体および半剛体ゲルを形成するコラーゲン断片を含む。原料として骨を使用する、標準のゼラチン製造プロセスは、酸性溶液で骨を処理して骨塩を溶解することから始まる。オセインと称される残材は、乾燥した状態での重量でコラーゲン８０％を含む。酸、塩基、および高温度を組み合わせることでオセイン内のコラーゲン分子を分解し、ゼラチン断片を作製することができる。複数の抽出ステップを実施すると、種々の精製ゼラチン溶液を得ることができる。類似するプロセスが、ＤＢＭの担体としての使用を目的としてヒト骨からゼラチンを作製するために開示されている。これらの技術は全て、出発材としてＤＢＭを使用する。ＤＢＭおよびオセインは化学的に類似するが、ＤＢＭプロセスは、骨に見られる成長因子の生物活性を維持するために注意が必要であるという点で、僅かに異なる。

ゼラチンの商業的生成において、脱灰処理において、より積極的なプロセスが使用されるのは、最終的に精製ゼラチンのみを抽出することを目的としているためである。Ｇｅｎｄｌｅｒらは標準的ゼラチンプロセスに従い、ゼラチンの作製を目的に、コラーゲンを熱分解するために高温および高圧でＤＢＭを処理する方法を開示する（米国特許第６，５７６，２４９号（特許文献４））。これは、オートクレーブおよびその他の圧力器を使用することで達成された。ＤＢＭの生物活性は破壊されるが、活性ＤＢＭがゼラチンに再添加され、ＤＢＭパテが作製される。ヒトゼラチンは、Ｇｅｎｄｌｅｒプロセスを用いて形成されるが、ＤＢＭを圧力および温度にさらす単一ステップは、一定しない特性を有する低品質のゲルを生成する。結果生成されるＤＢＭ骨移植パテは、取り扱いが困難であり、各ロットにより異なる。

Ｋａｙらは、室温および室温以下でコラーゲンを化学的に分解するために、ＤＢＭを酸、塩基、および／あるいは塩で処理することで、ゼラチンを抽出する、より穏やかなアプローチを用いた（米国公開特許出願第２００３／００４４４４５号（特許文献５））。このプロセスにおいて、室温抽出は、ＤＢＭの成長因子要素の生物活性をある程度維持することができる。しかしながら、低温抽出は、抽出プロセスから生成されるゼラチンの用量および品質に限界が生じる。両技術において、ＤＢＭは出発材として使用され、結果生成されるゲルは、ヒトＤＢＭに存在するコラーゲンおよびその他のタンパク質から得られるタンパク質断片を含む。これらのゲルから製造される骨移植材は、ＤＢＭ由来ゼラチンをＤＢＭ粒子と混合することで形成される。

米国特許第５，０７３，３７３号 米国特許第６，３０９，６５９号 米国特許第６，６５２，８８７号 米国特許第６，５７６，２４９号 米国公開特許出願第２００３／００４４４４５号 Ｗａｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．"Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ"．Ｔｒａｎｓ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｓｐｉｎｅ Ｓｏｃ ２０００；１５：３５−３７ Ｌｅｅ ＹＰ，Ｗａｎｇ ＪＣ，Ｋａｎｉｍ ＬＥ，Ｊｏ ＭＪ，Ｄａｖｉｓ Ｍ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＪＲ．"Ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ａｎ ａｔｈｙｍｉｃ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．"Ｔｒａｎｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ Ｓｐｉｎｅ Ｓｏｃ ２００１；１６：８６−８７ Ｂｏｓｔｒｏｍ，ＭＰ，Ｂｏｓｋｅｙ Ａ，Ｋａｕｆｍａｎ ＪＫ，Ｅｉｎｈｏｒｎ ＴＡ．"Ｆｏｒｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ．"Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ ＪＡ，Ｅｉｎｈｏｒｎ ＴＡ，Ｓｉｍｏｎ ＳＲ．（ｅｄｓ）．Ｒｏｓｅｍｏｎｔ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ，ｐｐ．３２７−３２８（２０００）

発明の概要
本発明は、骨から石灰化ゼラチン担体を作製する新規技術を提供する。本プロセスにおいて、ＤＢＭではなく骨（皮質骨あるいは海綿骨など）が、出発材として使用されている。石灰化骨の使用により、結果生成されるゼラチンは骨再生プロセスで使用されるカルシウムおよびリン酸塩イオンを含有することが可能となる。さらに、当該プロセスは、一連の抽出ステップで実施され、高品質ヒトゼラチンの分離を可能にする。酸、熱および超音波攪拌を組み合わせることで、骨は骨塩を含有するゼラチン溶液に可溶されることができる。これらのプロセスは化学的および熱的にコラーゲンをゼラチン断片に分解するだけでなく、リン酸カルシウム骨塩を溶解する。骨塩を含有するゼラチン溶液に骨を溶解するために、種々のプロセスを任意で使用してもよい。例えば、熱、酸、超音波処理、塩基、塩、および／または圧力を使用してもよい。一度中和されると、ゼラチン溶液は、コラーゲン断片、ならびにカルシウム、およびリン酸塩の可溶性塩を両方含有する。ゼラチン溶液を冷却すると、粒子状ＤＢＭの効果的な担体となる石灰化ゲルができる。外科手術部位にＤＢＭ移植片を効果的に送達かつ維持するだけではなく、石灰化ゲルは再石灰化に必要なカルシウムおよびリン酸塩イオンの源を、骨再生部位に提供する。

特に、本発明は、骨から石灰化担体を形成する方法を提供し、該方法から生成される石灰化担体にさらに着目する。本発明は、生成方法に関わりなく、カルシウムおよびリン酸塩を含む石灰化担体をさらに提供する。非限定例として、カルシウムおよびリン酸塩は、カルシウムおよびリン酸塩の塩の形態として使用されてもよい。

本発明は、骨製品を生成する方法をさらに提供し、それには、１つ以上の骨移植材および１つ以上の石灰化担体が含まれる。骨移植材は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、自家移植骨、同種移植皮質骨、同種移植海綿骨、リン酸カルシウムおよびポリマー骨移植補填材などの合成骨移植片、骨髄細胞、骨芽細胞あるいは間葉系幹細胞などの細胞物質、および／またはＢＭＰ、ＴＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦなどの成長因子を含むがこれに限定されない。これらの製品を作製する際に使用される骨移植材および石灰化担体は、皮質骨などの骨からそれぞれ独立して形成されてもよい。本発明は、１つ以上の骨移植材および１つ以上の石灰化担体を含む骨製品をさらに提供する。本発明に従う骨製品は、シート、パテ、ペースト、スポンジ、ゲル、ブロックなどの形態で提供されてもよいし、所望の形状に形成されてもよい。

本発明は、１つ以上の石灰化担体を含むキットをさらに提供する。これらのキットに含まれる石灰化担体は、本発明の方法に従い、骨から形成することができる。あるいは、１つ以上の担体は、カルシウムおよびリン酸塩を例えば塩の形態で含む石灰化担体を結果として生成するその他の方法を使用して形成することができる。

本発明に従うキットは、例えば、粉末あるいはその他乾燥形態から石灰化担体を再構成するための液体、担体を１つ以上の他の構成要素と混合するための容器、その中あるいはその上で石灰化担体を特定の形状に形成する器具（型枠あるいは鋳型など）、および／あるいは担体と混合するＤＢＭあるいはその他の骨移植構成要素など１つ以上の付加的構成要素をさらに含み、それにより、例えば使用者は使用を希望するＤＢＭと担体の比率を決定することができる。

本発明は、その上において、またはそれに組み込まれる石灰化担体あるいは骨移植製品を含む外科的インプラントまたは装置も提供する。本発明に従う骨移植製品、外科的インプラントあるいは装置を、それを必要とする患者に注入あるいは挿入するステップを含む、治療方法をさらに提供する。

発明の詳細な説明
本発明の局面、有利点およびその他の特性は、本発明の多様な非限定実施形態を開示する以下の詳細な説明で明らかとなるであろう。本発明の実施形態を説明するにあたり、明確性を持つために特定の専門用語が使用される。しかしながら、本発明は特定の専門用語に限定されることを意図しない。それぞれの要素は、類似する目的を達成するために類似する方法で実施される技術的等価物を全て含むことを理解する。さらに、本明細書に記載される引用は全て、それら全体で参照として組み込まれる。

本明細書で使用される「１つの（ａ）」あるいは「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味する場合もある。本明細書で使用される通り、「別の」は少なくとも２番目あるいはそれ以上を意味する場合がある。

本明細書で使用される用語「ゲル」および「ゼラチン」は、当該術分野で理解される通りに使用され、本明細書においてある程度相互互換的に使用される。用語「ゲル」は、「ゼラチン」の半固体形態を指し、「ゼラチン」は、動物組織のコラーゲンから形成される派生タンパク質である。用語「ゼラチン溶液」は、ゼラチンを含む液体あるいは半液体を指す。しかしながら、用語ゲルおよびゼラチンの使用は、例えば冷却時に非液体形態に転換することができる液体形態を除外することを意図しない。

用語「石灰化ゼラチン」、「石灰化ゼラチン担体」、「担体」および「石灰化担体組成物」は全て、本発明の方法（あるいは、本発明の方法に含まれることを意図する異なる方法）によって形成される担体か、本発明の方法によって形成される石灰化担体と同様の無機質特性を有する担体かにかかわらず、本発明に従う石灰化担体を含む組成物を含有することを意図する。本明細書で詳細に説明される通り、該担体あるいは組成物、および該担体あるいは組成物を含む骨製品は、石灰化担体、および任意の１つ以上の付加的な成分を含むが、それに限定されない。

骨移植材に適切な担体を開発するにあたり、担体は有利に、患者の移植部位にＤＢＭなどの物質を効果的に送達かつ維持することが可能な生体適合性ゲルであってもよい。担体は、数週間以内に部位に容易に吸収されるべきで、ＤＢＭの成長因子構成要素などの物質の生物活性を妨害するべきではない。

本発明は、ヒト骨から石灰化ゼラチン担体を得、骨移植片を作製する方法を含む。担体のための出発材として脱灰骨を使用するプロセスから作製される従来のゲルは、自家移植片および同種移植片など典型的な骨移植片に見られる天然無機質成分が欠如している。本プロセスで皮質あるいは海綿骨を使用することで、本ゼラチンは無機質成分を有することができる。移植の観点から見ると、新しい組織を形成する局部細胞は、発達した骨を形成するために再石灰化をしなければならない。従って、骨塩の源を部位に提供することは、再石灰化プロセスを助長するに有益となる。さらに、本プロセスの熱はゼラチンの溶解を促進するため、本プロセスは熱を使用しないプロセスよりも有利である。従って、本プロセスでは、より質の高いゼラチンが生成される。さらに、ゼラチンを作製する本プロセスは、抽出中ゼラチン溶液が継続して分解されるのを防止する２つ以上の抽出ステップを使用することができる。特定の実施形態において、ゼラチン溶液の熱および酸性状態に触れることを制限することで、分解プロセスは制御可能となり、より品質の高いゼラチンを抽出することができる。それにより、本発明の製品は、より高い粘着性および最良の移植封じ込め特性を有することができる。

それに応じて、本発明は、ＤＢＭ骨製品を作製する方法を提供し、その方法には、骨ロットを第１の部分および第２の部分に分離するステップ、乾燥脱灰骨基質を作製するために第１の部分を処理するステップ、第２の部分から石灰化ゼラチン溶液を抽出するステップ、抽出した石灰化ゼラチン溶液を中和するステップ、石灰化ゼラチン溶液を凍結乾燥石灰化ゼラチンに転換するステップ、凍結乾燥ゼラチンを水と混合させて特定濃度のゼラチン溶液を生成するステップ、および、乾燥脱灰骨基質を石灰化ゼラチンと混合してＤＢＭ骨製品を作製するステップを含む。抽出プロセスは、例えば、骨ロットの第２の部分を高められた温度、酸、超音波処理、塩基、塩、および／または圧力のうち少なくとも１つ以上にさらす１つ以上のステップを含んでもよい。さらに、石灰化ゼラチン溶液を石灰化ゼラチンに転換するステップは、固体ゲルの形成を円滑にするための冷却プロセスを含んでもよい。特定の実施形態によると、石灰化ゼラチンが固体あるいは粉末形態にある間に、ＤＢＭを石灰化ゼラチンと混合してもよい。

本発明の方法は、ＤＢＭ骨製品を凍結乾燥させるステップをさらに含んでもよい。これらの実施形態によると、該方法は凍結乾燥骨基質製品に再び水分を加えるするステップをさらに含んでもよい。

本発明に従うＤＢＭ骨製品を作製する方法の特定の実施形態によると、ＤＢＭ製品は、図１に図示される通りに作製されることができる。これらの実施形態によると、移植用提供骨の単一ロットは、図１のフローチャートに図示される通りに処理される。特に、図１は、図１の左側に示されるＤＢＭの作製、および図１の右側に示される石灰化ゼラチン担体の調製に使用される、凍結乾燥、未加工皮質骨（２）のロットの分割を説明しているが、それらは、多様なＤＢＭあるいは骨移植製品を形成するために、異なる多数の方法で本発明に従い混合することができる。

皮質骨ロット（２）は、ゼラチン産出量に応じた比率で、重量によって分割することができる。例えば、ＤＢＭ骨と担体骨の比率は、重量で約４０：６０から９５：５の範囲で設定可能である（すなわち、図１の左側に示されるＤＢＭを生成するために使用される皮質骨の重量と、図１の右側に示されるゼラチン担体を生成するために使用される皮質骨の重量の比率）。比率は、元来の骨ロットの比率である。特定の実施形態によると、分割は約８０：２０から９５：５、あるいは９０：１０であってもよい。実際の比率は、石灰化ゼラチンプロセスによるゼラチン産出量に依存する。

例示的な９０：１０の比率を用いると、皮質骨ロットの９０％（すなわち、ＤＢＭの生成に使用される、骨ロットの第１の部分）は、標準脱灰技術による脱灰プロセス（４）で処理することができる。例えば、ステップ（４）で、粉砕した皮質骨を、約２〜５時間０．５Ｎ塩化水素酸（ＨＣｌ）溶液など酸性溶液に浸漬することができる。これは、例えば約室温で実施することができる。さらなる例として、脱灰プロセスにおいて、酸抽出は、コラーゲンを変性させることのない温度で実施することができる。石灰化抽出物はその後廃棄されるゆえに、用語「脱灰」と称される。皮質骨から無機質が溶解した後、脱灰骨基質粒子が残存する。ＤＢＭはその後中和化ステップ（６）を受けるが、このステップにおいてＤＢＭは水および／または食塩水で洗浄され、緩衝剤でｐＨ値７になるまで処理されることで中和することができる。浸水したＤＢＭはその後凍結乾燥ステップ（８）に移行し、そこでＤＢＭは凍結乾燥され、乾燥した粒子状の形態に転換される。

乾燥ＤＢＭを形成するために骨を処理する間、生物活性成長因子が活性を維持できるように注意が必要である。骨および結果生成されるＤＢＭを高温にさらすことを最小限に抑えることで実施される。図１の左側に図示される技術は、当業者には公知である脱灰技術を含むことができ、図１に記載される特定の技術あるいは本願に記載される技術に限定されないことに注目すべきである。

皮質骨ロットの残１０％（すなわち、ゼラチンなどの担体を生成するために使用される皮質骨ロットの第２の部分）は、石灰化ゼラチンを生成するために処理することができる。このプロセスでは、ゼラチンは抽出プロセス（１０）で骨から除去される。抽出プロセス（１０）は、皮質骨ロットの第２の部分を、熱、酸、超音波処理、塩基、および／または圧力の１つ以上にさらすステップを含むことができる。例えば、骨は、ＨＣｌなどＤＢＭの処理に使用されるものよりも高濃度の酸性溶液に入れられ、骨塩を溶解し、コラーゲン分子をゼラチンに完全に変性するために、沸騰点近くまで加熱される。さらに、粒子を超音波攪拌し、ゼラチン抽出プロセスを加速するために、超音波処理を使用してもよい。ゼラチン抽出プロセスにおいて、無機質は溶解するが、高温度はコラーゲンを変性させることもする。さらに、抽出プロセスで酸が使用される実施形態においては、酸抽出溶液（無機質を含有する）は、除去および廃棄されることがない。これが、ゲルの一部となる。

抽出プロセスは、複数の抽出ステップを含んでもよい。そうすることで高品質の石灰化ゼラチン溶液が生成され、該溶液はその後中和ステップ（１２）に従い中和され、石灰化ゼラチンに転換されることができる。図１に図示される実施形態によれば、中和したゼラチン溶液は、凍結乾燥ステップ（１４）に移行することができる。凍結乾燥ゼラチンは、再構成ステップ（１６）を経ることができ、ここでゼラチンは特定濃度のゼラチン溶液を生成するために、水あるいはその他の溶媒によって再構成される。典型的に、再構成されたゼラチン溶液は、１〜１０％範囲のゼラチン溶液である。

図１に図示される実施形態によると、石灰化ゼラチン溶液は冷凍ステップ（１８）に移行することができ、ここで溶液は、（中和ステップ１２の直後、あるいは再構成ステップ１６の直後に）冷却され固体ゲルを形成する。

抽出、中和および／または石灰化ゼラチンへの転換を実施する特定の技術は、下記に記載される、皮質骨から石灰化担体を作製する本発明に従う方法を含むが、これに限定されない。異なる方法が使用され得るが、それも本発明の範囲内に留まる。例えば、該方法は、（ＤＢＭからではなく）骨から石灰化担体を形成する方法、および／またはカルシウムおよびリン酸塩を含む石灰化担体を形成する方法を含むことができる。さらに、本発明は、カルシウムおよびリン酸塩を一般のゼラチンに添加することで、石灰化ゼラチン担体を形成する方法を含む。

ＤＢＭおよび／またはその他の骨移植材は、ゲルと混合され、多様な骨移植製品を作製することができる（２０）。図１に記載される例において、ゲルおよびＤＢＭを混合することで生成される製品は例えば、成型可能パテの形態、押し出し成型されるゲル、あるいは凍結乾燥シートあるいはブロック形態、あるいはＤＢＭの使用が有利に用いられる任意の形態であることが可能である。限定しない例示的実施例として、ＤＢＭおよびゼラチンの混合物は、ＤＢＭパテを形成するためにステップ２２で処理されてもよい。

本発明は、骨から石灰化担体を形成する方法にさらに着目する。骨の処理は、例えば、抽出されるゼラチン溶液を生成するために、熱、酸、超音波処理、塩基、塩、および／または圧力の少なくとも１つにさらすことによる抽出ステップ、および中和された溶液を生成するために、抽出されたゼラチン溶液を中和するステップを含んでもよい。該処理は、凍結乾燥石灰化担体を形成するための、中和された溶液を凍結乾燥するステップをさらに含むことができる。これらのステップは非限定的であり、付加的ステップを含むこともあり、および／または本明細書に特に記載され、図面に図示されるステップの順序とは異なる順序で実施される場合もある。例えば、骨から石灰化ゼラチンを抽出するステップは、多くの要因に左右される場合がある。本発明のプロセスにおいて、酸あるいは塩基濃度、酸あるいは塩基と骨の比率、抽出温度、抽出時間、超音波処理の時間、およびその他の可変要素は全て、石灰化ゼラチンの最終用量および品質に影響する可能性がある。本開示内容を読む当業者は、石灰化ゼラチンの所望する用量および品質に応じて、所望する製品に従い本発明の方法を微調整することができるであろう。

本発明の方法は、１つ以上の抽出ゼラチン溶液を生成するために、１つ以上の付加的抽出ステップを実施し、任意で中和ステップ前に、１つ以上の抽出ゼラチン溶液を混合させるステップをさらに含んでもよい。該方法は、液体石灰化担体を形成するために、凍結乾燥した石灰化担体を液体で再構成するステップをさらに含んでもよい。該方法は、固体あるいは半固体の石灰化担体を形成するために、液体の石灰化担体を約室温あるいはそれ以下まで冷却するステップをさらに含んでもよい。

図２は、本発明に従う、骨から石灰化担体を形成する方法の非限定的な実施形態を説明するフローチャートである。図２に図示される実施形態によると、骨からゼラチン溶液を抽出するために、皮質骨は酸、熱、および／または超音波処理に触れ、その後石灰化担体を形成するためにさらに処理され得る。図２に図示される実施形態において、抽出プロセスのステップ（１０４）に従い、皮質骨（１０２）は酸性溶液に浸漬される。酸性溶液は、塩化水素酸、硫酸、クエン酸、酢酸、および硝酸など１つ以上の酸を含むが、これに限定されない。図２に図示されている特定の実施形態によると、塩化水素酸が使用される。酸性溶液の濃度は、約０．５Ｍから約１０Ｍの範囲内にある。特定の実施形態に従い、濃度は約１．０Ｍから約３．０Ｍであることができる。骨の酸に対する比率は、結果生成されるゼラチンの品質にも影響を与える場合がある。酸１ｍｌ中約１ｇから酸２０ｍｌ中約１ｇの範囲であることができる。特定の実施形態によると、その範囲は約１：２．５ｇ／ｍｌから約１：５ｇ／ｍｌである。

これらの実施形態において、骨を酸性溶液に浸漬した後、あるいは酸を骨に添加した後、骨は加熱され、骨塩を溶解し、骨のコラーゲン成分をゼラチンに分解する処理を加速する。特定の実施形態によれば、酸は、骨の添加前に加熱されてもよい。コラーゲンを熱分解するための加熱は、約４０℃から約１００℃の範囲であればよい。特定の実施形態によると、その範囲は約６０℃から約８５℃である。

超音波処理ステップ（１０６）は、粒子を超音波攪拌するために使用され、ゼラチン抽出プロセスにおいて、コラーゲンの分解を加速させる。特に高められた温度において、酸で骨を超音波処理すると、コラーゲンをより小さな断片に機械的攪拌することが可能となる。攪拌、均質化、粉砕、あるいは製粉などの機械的攪拌もまた、骨を物理的に分解するために使用され得る。図２に図示される例において、超音波処理は、抽出プロセスを一貫して継続的に、あるいは特定の間隔で、使用されてもよい。さらに、抽出時間は、抽出ステップの効果を向上させるために調整され得る。例えば、抽出時間は、最短で３０分の抽出サイクルから２４時間の抽出サイクルの範囲内で可能である。特定の実施形態によると、約２から４時間の抽出サイクルが使用される。

一定期間を経た後、第１の抽出物あるいは抽出溶液（１１６）が除去される、分離ステップ（１０８）が実施される。分離処理は、例えば、傾斜分離、ろ過、あるいは遠心分離抽出技術により実施される。水分を含んだ残渣が溶液から分離されるならば、どの技術を使用してもよい。第１の抽出物が除去された後に残存する残渣は、新鮮な酸を残渣に添加するステップ（１１０）、超音波処理ステップ（１１２）および分離ステップ（１１４）を含むステップでさらに処理され、処理済み残渣から第２の抽出物あるいは抽出溶液を除去（１１８）する。さらなる抽出ステップ（１２０）は、必要に応じて、あるいは骨が本質的に完全に溶解されるまで、残存する残渣に施すことができる。

抽出プロセスが完了すると、抽出溶液（１１６および１１８）は混合して単一の溶液とすることができる（１２２）。中和ステップ（１２４）は、ゼラチン溶液を生成するため、緩衝、透析、および限外ろ過を含むが、これに限定されない技術を使用して実施することができる。特定の実施形態によれば、水酸化カルシウム塩基を、中和処理に使用することができる。その他の実施形態によれば、１０，０００〜１５，０００Ｄａの分子量を遮断する透析管を使用してもよい。別法として、それぞれの抽出溶液は、抽出直後、別々に中和されてもよい。抽出物は、ゼラチン断片がさらに分解するのを防止するために、中和前に任意で凍結（独立してあるいは混合して）されてもよい。

結果として生成された中和ゼラチン溶液の濃度に応じて、担体は３２から５０°Ｆ、すなわち２から１０°Ｃの温度まで冷却されるとゲル化する。図３は、本方法により得られるゼラチンが、通常のＤＢＭ由来ゼラチンとは明白に異なることを示す。図３に示される通り、石灰化ゼラチンと通常のゼラチンには明白な差異がある。標準あるいは特定のゼラチン濃度は、石灰化ゼラチン溶液を凍結乾燥し、実質的に石灰化ゲルを分離させる凍結乾燥ステップ（１２６）によって得ることができる。一度石灰化ゲルが凍結乾燥されると、再構成（水分の再追加）ステップ（１２８）を実施することができ、そこでは、標準ゼラチン溶液を生成するために、乾燥された石灰化ゲルは、水あるいは特定の濃度を有するその他の溶媒を用いて再構成し得る。標準溶液はその後、冷却ステップ（１３０）で冷却され、ゲルを形成する。水中でのゼラチン濃度を利用して、結果として生成されるゲルの特性を調整することができる。例えば、ゼラチンの濃度が高いほど、より強力なゲルが生成可能である。特定の実施形態によると、ゼラチン濃度約２〜１０％ｇ／ｍが使用され、ＤＢＭ粒子のゲル担体を作製することができる。ゲルはその後さらに処理され（１３２）、ＤＢＭ担体など、多様な石灰化担体を形成する。

石灰化ゼラチン担体は、例えばステップ１２６で生成される未構構成の凍結乾燥形態、例えば１２８で生成される再構成された液体形態、例えばステップ１８で生成される冷却ゲル形態、あるいは例えばステップ２２で生成される石灰化ゼラチンＤＢＭ担体、を含むがこれに限定されない多様な形状で保存、販売、あるいは使用することができる。

石灰化ゼラチン担体は、多様なＤＢＭ製品を製造するために使用されてもよい。例えば、ＤＢＭパテは、乾燥ＤＢＭ粒子を石灰化ゲルと混合することで作製することができる。特定の実施形態によると、ゲルのＤＢＭ濃度は約３０〜３５重量％であることができる。シリンジから押し出し成型可能なパテ（ＤＢＭゲルあるいはペーストと称されることが多い）は、ＤＢＭ成分を減少し、ゼラチン成分を増加することで作製することができる。特定の実施形態によると、押し出し成型可能なＤＢＭパテは、約２５〜３０重量％のＤＢＭ濃度を用いることで形成することが可能である。

ＤＢＭシートおよびブロックも、石灰化ゼラチン／ＤＢＭ混合物から形成可能である。この形態において、ＤＢＭパテあるいはゲルなどのＤＢＭ製品は、所望する形状に成型した後、水分を除去するために凍結乾燥してもよい。結果生成されるＤＢＭスポンジは、付加的な液体を吸収することができる。これらのスポンジは、例えば、外科医により、滅菌水、滅菌食塩水、血液、多血小板血漿、成長因子溶液、骨髄穿刺液、および／または細胞懸濁液（間葉性幹細胞、骨芽細胞、など）を含むがこれに限定されない液体とともに、骨製品を挿入することで、再び水分を加えられることを目的とする。

本発明は、凍結乾燥粉末形態、再構築液体形態、パテ、ゲル、ブロック、シート、スポンジ、あるいは当業者が想到するその他の形態など固定あるいは半固体の石灰化担体に成型され得る、あるいは実際に成型される石灰化担体を含む多様な形態を有する、石灰化担体をさらに提供する。それに応じて、本発明の方法は、所望する形態および／または形状を得る１つ以上のステップをさらに含むことができる。例えば、該方法は、液体の石灰化担体を、シート、パテ、ペースト、ブロック、およびゲルから成る群から選択される固体あるいは半固体の石灰化担体に形成するステップを含み、任意で成型された固体あるいは半固体の石灰化担体を形成するために液体の石灰化担体を形成するステップをさらに含むこともできる。

本発明に従う石灰化担体は、本発明の方法により形成される担体であり、あるいは本発明と同様に、ＤＢＭからではなく骨から直接的に製造される石灰化担体、および／またはカルシウムおよびリン酸塩などカルシウムおよびリン酸塩イオンを含む石灰化担体を形成する、その他の方法を含む変更された方法により形成されてもよい。従って、本発明は、ゼラチンおよびカルシウムとリン酸塩を含む石灰化担体も提供する。

本発明に従う石灰化担体は、ＤＢＭなどの運搬される構成要素、および／または、その他の生物活性成分、および／または増粘剤などの、１つ以上の付加的構成成分、を含むことができる。従って、本発明は、ＤＢＭ、および本明細書に開示される方法により生成される担体などの石灰化担体を含む骨製品をさらに提供する。ＤＢＭおよび石灰化担体は、例えば製品の使用用途により、骨製品あるいは骨製品の個別部分で一体的に混合されていてもよい。

石灰化担体あるいは本発明の骨製品に添加され得る１つ以上の付加的構成要素は、骨移植に有益であると当業者に明らかである任意の構成要素を含んでもよい。例えば、１つ以上の生物活性成分を本発明の石灰化担体に添加することは有益である可能性があり、これは組成物の結合組織修復能力に関連がある場合も、ない場合もある。適切な活性成分は、ＤＢＭならびに残渣、骨形成タンパク質および骨形成タンパク質（ＣＤＭＰｓ）に由来する軟骨など関連タンパク質を含有する不溶性抽出製品を含む。組成物に添加され得る他の活性成分は、皮質あるいは海綿骨細片および骨塩などの骨由来物質、骨形成化学物質（例、Ｌ−アルギニン）、骨形成ペプチド（例、ＯＳＡ）、骨形成成長因子（例、トランスフォーミング成長因子−ベータ［ＴＧＦ−β］、インシュリン様成長因子［ＩＧＦ］、血小板由来成長因子［ＰＤＧＦ］、血管上皮成長因子［ＶＥＧＦ］、繊維芽細胞成長因子［ＦＧＦ］）、および組み換えＢＭＰ（例、ｒＢＭＰ−２、ｒＢＭＰ−７）、フィブロネクチン、および血液由来タンパク質を含む。適切な組み合わせで添加されると、これらの活性成分は、骨修復、軟骨修復、靭帯および腱修復、半月板修復、および他の筋骨格への応用を助ける。

ＤＢＭなどの送達されるべき製品は、得られる結果に応じて、石灰化担体を製造するプロセスにおいて、複数あるステップのいずれにおいてでも石灰化担体に添加することができる。例えば、最終製品において、ＤＢＭが石灰化担体に一体的に混合されることを所望する場合、ＤＢＭは、担体が最終形態および形状に完成する前に、凍結乾燥あるいは液体状態で石灰化担体に添加されてもよい。例えば、ＤＢＭおよび石灰化担体が、それぞれ、ブロックの個別部分など、最終製品の個別部分を形成することが所望される場合、ＤＢＭは代わりに固体あるいは半固体形態で石灰化担体に添加されてもよい。さらに、石灰化ゼラチンを、ＤＢＭを含有しない骨移植材の担体として使用してもよい。ゼラチンは、自家移植片、同種皮質細片、同種海綿細片、合成骨移植粒子、成長因子（ＢＭＰ、ＴＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなど）、および／または細胞（骨髄細胞、幹細胞、骨細胞、軟骨細胞）などの物質の担体として使用してもよい。

上述の通り、例えば、パテおよびゲルを含む本発明に従うＤＢＭ製品は、（例えば、皮質および海綿骨細片を含む）骨細片、合成移植顆粒、および自家移植組織など、他の移植材と任意で混合することができる。担体あるいは骨製品の粘着性、硬度、形状および他の物理的特性に影響を与えるような、他の構成要素が、例えば、担体あるいは骨製品の形状の作製を助けるために添加されてもよい。例えば、１つ以上の増粘剤を、本発明の担体あるいはＤＢＭ骨製品に添加してもよい。構成要素は、石灰化担体あるいは骨製品の製造プロセスの各段階、あるいは骨製品の形成後、骨製品の表面上などに添加してもよい。

本発明に従う１つ以上の増粘剤は、活性成分あるいは生物不活性物質であってもよい。適切な増粘剤は、例えば、コラーゲン、骨塩、本発明の不溶性抽出製品、ハイドロキシアパタイト、リン酸３カルシウム、２相リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、生物活性ガラス、および天然あるいは合成ポリマーを含む。ＤＢＭ、および／または逆相媒体を、タンパク質を添加して、あるいは添加しないで、増粘剤として使用してもよい。逆相媒体は、組成物に逆相特性を与えるに十分な量のＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）の水性混合物であってもよく、例えば約２０〜４０％ｗ／ｗ、あるいは約２３〜３２％ｗ／ｗ、あるいは約２５％ｗ／ｗあるいは３５％ｗ／ｗのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７と水の混合物ある。他の逆相媒体には、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７の派生物の水性混合物が含まれる。

組成物の生物学、生理化学および生物分解特性は、化学物質（例、グルタルアルデヒドあるいはホルムアルデヒド）あるいは放射能（例、ガンマあるいは電子ビーム）などの公知の架橋剤により変更することができる。例えば、電子ビーム（Ｅ−ビーム）放射を、５から５０ｋＧｒａｙの線量で湿性のあるいは乾燥した物質を放射線にさらすために使用してもよい。

本発明により製造される製品あるいは組成物は、複数の異なる方法で使用することができる。本発明に従うＤＢＭ製品は、例えば、骨あるいは軟骨欠損部位、軟骨修復部位、あるいはその他の筋骨格部位に、各部位内、各部位上、あるいは各部位近辺に、注入あるいは挿入する用途で調製することができる。注入あるいは挿入方法は重要ではないが、注入の場合には例えばシリンジを介して、挿入の場合には骨あるいは軟骨欠損部位にアクセスできるよう外科的開口部を設ける方法がある。

特定の実施形態によると、本発明の担体あるいは製品を含む組成物は、凍結乾燥した海綿骨細片に適用してもよく、あるいは細片は組成物に浸漬してもよい。組成物でコーティングされた骨細片は乾燥してもよい。乾燥ステップは、凍結乾燥あるいはオーブン乾燥などを含む従来の乾燥プロセスのいずれかにより実施することができる。コーティングされた骨細片は、骨欠損部位、軟骨修復部位、あるいはその他の筋骨格部位に、各部位内、各部位上、あるいは各部位近辺に、外科的インプラントとしてあるいは外科的インプラント内に使用してもよい。また、コーティングは、より大きな骨片、人工インプラント、あるいはその他のいかなる種の外科的インプラントにも適用してよい。

または、乾燥した水溶性抽出製品あるいは濃縮物を、アルコール水溶液あるいは他の揮発性溶液と混合し、所望する形状に鋳造した後、スポンジ様物質を形成するため乾燥させることができる。例えば、エタノールなどの炭素数１〜６のアルコールを使用してもよい。さらに、溶液の１から２０体積％のアルコールを使用してもよい。結果生成される組成物は、他の物質を添加し、あるいは添加せず、シートあるいはその他の形状に鋳造されてもよい。シートあるいはその他の形状は乾燥される。乾燥処理は、凍結乾燥あるいは空気乾燥など、従来の方法のいずれによっても実施することができる。乾燥処理は、凍結乾燥で実施されることが望ましい。

特定の実施形態によると、上述のアルコール溶液で形成されたシートあるいは形状は、外科的インプラントとしてまたその一部として使用できる。シートを使用する場合、シートは、局部を覆う外被あるいは骨欠損部位に挿入されるパッチとして使用でき、例えば、骨欠損、軟骨欠損、骨髄固定ケージあるいは寛骨臼底に挿入される。

本発明に従う製品は、骨欠損部位、軟骨修復部位、あるいはその他の筋骨格部位に、各部位内、各部位上、あるいは各部位近辺に挿入される外科的インプラントあるいは装置のコーティング剤として使用することもできる。従って、本発明は、本発明に従う石灰化担体を含む、石灰化担体および／または骨製品あるいは組成物でコーティングされる外科的インプラントを含む外科的インプラントあるいは装置をさらに有する。

本発明は、本発明に従う石灰化担体を含むキットにさらに着目する。石灰化担体は、例えば、ゲル、パテ、ペースト、シート、ブロック、スポンジあるいはその他の形態など、粉末、液体、固体あるいは半固体形態で提供され得る。したがって、石灰化担体は、キットに、運搬される物質から独立して含まれることも、あるいは最終的な骨製品としてキットに含れるか、あるいは、キットに含まれる外科的インプラントあるいは装置のコーティングあるいは構成要素として含まれることがある。石灰化担体が、運搬される構成要素とは独立して含まれるキットの場合、キットは運搬される構成要素（ＤＢＭなど）をさらに含んでもよい。別々に運搬される担体および構成要素を含む該キットにより、使用者は、例えば使用を望むＤＢＭと担体の比率を決定することができる。

本発明に従うキットは、粉末形態から石灰化担体を再構成するための液体、スポンジ形態の骨製品に添加する液体、担体と１つ以上のその他の構成要素を混合するための容器、および／またはその中あるいはその上で担体を特定の形状に形成する器具（型枠あるいは鋳型など）の１つ以上を含むことができる。キットは、担体と混合する、あるいは担体に添加する、他の構成要素をさらに含むことができる。さらに、本発明に従うキットは、骨製品、外科的インプラントあるいは装置を患者に挿入することを助ける、１つ以上の器具あるいはその他の構成要素を含むことができる。

本発明は、さらに、患者の治療方法を含み、その方法には、骨に欠陥がある患者など治療を必要としている患者に、骨製品および／または骨製品（例えば、インプラントにコーティングされている製品）を含むインプラントを、本発明に従い提供することが含まれる。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示する。本明細書に記載される実施例は、例示を目的とするもので、いかなる意味においても、請求項に係る本発明の範囲を限定するものではない。熟練技術者には明白であるが、記載される本発明の範囲内で多くの変形および変更が可能であり、想到し得る。さらに、本発明の精神に逸脱することなく、当業者によって実施されることができる。

実施例
実施例１
この実施例では、本発明に従い、石灰化担体を形成する特定の方法に従う抽出プロセスを詳細に説明する。皮質骨は、約８５℃のオーブンで約１時間加熱され、約６０℃で約１時間超音波処理される。計約４時間の抽出時間に１度この処理が繰り返される。この時点で、抽出溶液は、傾斜分離、あるいはろ過などの技術を用い、残余骨から分離され、第１の抽出物が得られる。第１の抽出物は冷凍され、ゼラチン断片のさらなる分解を防ぎ、あるいは緩衝、透析、限外ろ過、あるいはその他の中和技術を用い、即座に中和することが可能である。

残余した骨は、コラーゲンが完全に溶解するまで、新鮮な酸を用いたさらなる抽出ステップが実施される。次の抽出ステップは、残余するコラーゲンを完全に溶解するため、抽出条件を変更して実施してもよい。第２の抽出処理は、残余した骨を新鮮な１ＮＨＣｌにオーブンで約１時間さらし、約６０℃で約１時間超音波処理するステップを含み、結果第２の抽出物が得られた。第２の抽出物は冷凍され、ゼラチン断片のさらなる分解を防ぐか、中和の前に第１の抽出物と混合されるか、あるいは緩衝、透析、限外ろ過、あるいは他の中和技術を用い、即座に中和することが可能である。抽出物は、以後の再構築のために凍結乾燥することができる。

実施例２
実施例１で得られた凍結乾燥した石灰化ゼラチンは、その後滅菌水と混合され、５％ゼラチン溶液を生成することができる。完全に溶解したら、ゼラチン溶液を４℃に設定されている冷蔵庫に置き、物質をゲル化させる。この時点で、３０％ＤＢＭと７０％ゼラチン（重量で）の混合物が形成され、鋳型可能ＤＢＭパテを形成することができる。均一に混合すると、ＤＢＭパテは室温で安定する。

本発明を特定の実施形態と共に説明したが、当業者には、種々の変更および変更態様が実施可能であることは明らかである。例えば、当業者は、温度、使用する酸、塩基、あるいは塩の用量および種類、超音波処理の量、抽出ステップ数などのプロセス条件に変更を加え、所望する製品を作製できる。従って、特異的に記載される以外にも、本発明は実施可能であることを理解されるであろう。従って、本発明の本実施形態は、いかなる意味においても、例示として考慮され、制限するものではない。

本発明の特定の実施形態に従い、皮質骨の単一ロットから石灰化ＤＢＭパテを作製する一般的なプロセスのフローチャートである。 本発明の特定の実施形態に従い、石灰化ゼラチン担体を作製するプロセスの詳細を示すフローチャートである。本発明の石灰化担体は、ＤＢＭおよび／または自家移植骨細片、同種移植皮質骨細片、同種移植海綿骨細片、合成骨移植片、成長因子（ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦなど）、細胞（幹細胞、骨髄細胞、骨芽細胞）、あるいは骨移植に使用されるその他の物質などを含む他の製品を運搬するために使用することができる。 標準および石灰化ゼラチン両方のゲルの写真である。

Claims (43)

1. ゼラチン溶液を骨から抽出する工程、および
   中和された石灰化担体溶液を形成するために、抽出されたゼラチン溶液を中和する工程
   を含む、骨から石灰化担体を形成する方法。
2. 凍結乾燥した石灰化担体を形成するために、中和されたゼラチン溶液を凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
3. １つまたは複数の付加的な抽出されたゼラチン溶液を形成するために、１つまたは複数の付加的な抽出ステップを実施する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
4. 抽出する工程は、骨の超音波処理を含む、請求項１記載の方法。
5. 抽出する工程は、骨を酸で処理する工程を含む、請求項１記載の方法。
6. 抽出する工程は、約４０℃から約１００℃の間の温度で骨を加熱する工程を含む、請求項１記載の方法。
7. 液体の石灰化担体を形成するために、液体で凍結乾燥した石灰化担体を再構成する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
8. 固体あるいは半固体の石灰化担体を形成するために、液体の石灰化担体を約室温あるいは室温未満まで冷却する工程をさらに含む、請求項７記載の方法。
9. 脱灰骨基質を石灰化担体に添加する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
10. 脱灰骨基質を液体の石灰化担体に添加する工程をさらに含む、請求項７記載の方法。
11. 脱灰骨基質を固体あるいは半固体の石灰化担体に添加する工程をさらに含む、請求項８記載の方法。
12. 皮質骨細片、海綿骨細片、合成移植顆粒、および自家移植組織から成る群から選択される１つまたは複数の付加的構成要素を添加する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
13. 骨は、皮質骨あるいは海綿骨のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１記載の方法。
14. 請求項２記載の方法により生成される、石灰化担体。
15. 請求項７記載の方法により生成される、液体の石灰化担体。
16. 請求項８記載の方法により生成される、固体あるいは半固体の石灰化担体。
17. ゼラチンと、
    カルシウムおよびリン酸塩とを含む、
    石灰化担体。
18. 骨ゼラチン、ならびにカルシウム、およびリン酸塩を含む石灰化担体と、
    少なくとも１つの骨移植材とを含む、
    骨製品。
19. ゲル、パテ、ペースト、シート、スポンジ、およびブロックから成る群から選択される形態である、請求項１８記載の骨製品。
20. 少なくとも１つの骨移植材は、脱灰骨基質、自家移植骨、同種移植皮質骨、同種移植海綿骨、合成骨移植片、細胞、および成長因子から成る群から選択される、請求項１８記載の骨製品。
21. 少なくとも１つの骨移植材は、脱灰骨基質を含む、請求項１８記載の骨製品。
22. 少なくとも１つの骨移植材および石灰化担体は、一体的に混合されている、請求項１８記載の骨製品。
23. 少なくとも１つの骨移植材および石灰化担体は、ブロックの個別部分を形成している、請求項１８記載の骨製品。
24. 凍結乾燥形態である、請求項１８記載の骨製品。
25. 少なくとも１つの増粘剤をさらに含む、請求項１８記載の骨製品。
26. 骨から形成される１つまたは複数の石灰化担体を含む、キット。
27. ゼラチン、ならびにカルシウム、およびリン酸塩を含む、１つまたは複数の石灰化担体を含む、キット。
28. 石灰化担体は、粉末、液体、固体および半固体から成る群から選択される形態である、請求項２７記載のキット。
29. 石灰化担体は粉末の石灰化担体であり、キットは粉末の石灰化担体を再構成するための１つまたは複数の液体をさらに含む、請求項２７記載のキット。
30. 脱灰骨基質をさらに含む、請求項２７記載のキット。
31. 石灰化担体を脱灰骨基質と混合するための容器をさらに含む、請求項３０記載のキット。
32. 石灰化ゼラチン担体を成型する鋳型をさらに含む、請求項２７記載のキット。
33. 骨ロットを第１の部分と第２の部分に分離する工程、
    乾燥脱灰骨基質を作製するために、第１の部分を処理する工程、
    石灰化ゼラチン溶液を第２の部分から抽出する工程、
    石灰化ゼラチン溶液を石灰化ゼラチンに転換する工程、および
    脱灰骨基質製品を形成するために、乾燥脱灰骨基質を石灰化ゼラチンと混合する工程
    を含む、脱灰骨基質製品を作製する方法。
34. 抽出する工程は、骨ロットの第２の部分を、約４０℃から約１００℃の間の温度に曝露する工程を含む、請求項３３記載の方法。
35. 抽出する工程は、骨ロットの第２の部分を、酸および超音波処理に曝露する工程を含む、請求項３３記載の方法。
36. 複数の抽出ステップを含む、請求項３３記載の方法。
37. 脱灰骨基質製品は、ゲル、パテ、ペースト、スポンジ、シートおよびブロックから成る群から選択される形態である、請求項３３記載の方法。
38. 脱灰骨基質製品を凍結乾燥させる工程をさらに含む、請求項３３記載の方法。
39. 凍結乾燥した骨基質製品を再水和する工程をさらに含む、請求項３８記載の方法。
40. インプラントと、
    ゼラチン、ならびにカルシウム、およびリン酸塩を含む、１つまたは複数の石灰化担体と、
    脱灰骨基質、自家移植骨、同種移植皮質骨、同種移植海綿骨、合成骨移植片、細胞、および成長因子から成る群から選択される、少なくとも１つの移植材とを含む、
    外科的インプラント。
41. 治療を必要とする患者に、骨移植製品を提供する工程を含む、患者を治療する方法であって、
    該骨移植製品は、
    ゼラチン、ならびにカルシウム、およびリン酸塩とを含む、１つまたは複数の石灰化担体と、
    少なくとも１つの骨移植材とを含む、
    方法。
42. 少なくとも１つの骨移植材は、脱灰骨基質、自家移植骨、同種移植皮質骨、同種移植海綿骨、合成骨移植片、細胞、および成長因子から成る群から選択される、請求項４１記載の方法。
43. 提供する工程は、骨移植製品を患者に注入する工程を含む、請求項４１記載の方法。

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