JP5916147B2

JP5916147B2 - プリンおよびピリミジンヌクレオシド、ペプチドおよびマンガンを含有する組成物ならびにそれらの使用

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Publication number: JP5916147B2
Application number: JP2013508274A
Authority: JP
Inventors: マイケル，ジェイ．ダリー，; エレナ，ケー．ガイダマコヴァ，
Original assignee: ザヘンリーエム．ジャクソンファウンデーションフォーザアドヴァンスメントオブミリタリーメディシンインコーポレイテッド
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2031-04-29
Also published as: JP2017222687A; CA3012801A1; AU2011248517A1; US20160222343A1; EP2566484A4; US9758760B2; AU2016203411B2; US20130209508A1; WO2011139881A3; WO2011139881A2; US9234168B2; EP2566484A2; BR112012027740B1; JP2016106104A; CN102946888B; JP6422898B2; JP2013525456A; CA2797716A1; CN102946888A; EP2566484B1

Description

（関連出願）
本出願は、米国特許仮出願第６１／３２９，３８１号（２０１０年４月２９日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に対する優先権を主張する。
（政府支援）

本発明は、一部は、米国エネルギー省科学局、生物学および環境改善研究（ＢＥＲ）局、環境改善科学プログラムからの助成金ＤＥ−ＦＧ０２−０４ＥＲ６３９１８により、ならびに空軍科学研究局からの助成金ＦＡ９５５９−０７−１−０１２８により資金提供された研究からなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

本発明は、微生物に対するワクチンの生産方法であって、放射線防護用組成物の存在下で微生物を培養し、回収しおよび／または懸濁すること、そして微生物を複製不能にさせるのに十分な放射線の線量で微生物を照射することを包含する方法を提供する。本発明の方法に用いられる放射線防護用組成物は、リン酸マンガンまたは重炭酸マンガン緩衝液の混合物中に少なくとも１つのデカペプチドを含む。本発明は、培養中の細菌を電離放射線（ＩＲ）に耐性にさせる方法であって、放射線防護用組成物の存在下で細菌を培養することを包含する方法も提供する。

極度放射線耐性デイノコッカス科は、電離放射線（ＩＲ）（１０ｋＧｙ）、紫外線（ＵＶ）（１ｋｊ／ｍ^２）および乾燥（年）への急性曝露を生き延び得る；そして長期ＩＲ（６０Ｇｙ／時間）下で増殖し得る２０より多くの異なる種で構成される。特に、デイノコッカス・ラディオデュランスは、哺乳動物細胞に対して細胞傷害性および致死性である線量を１０００係数超えるガンマ線への曝露を生き延び得る極度電離放射線（ＩＲ）耐性細菌である。

極度耐性細菌、例えばデイノコッカス・ラディオデュランス（D.radiodurans）に関して、高線量のＩＲ後の生存は、照射中の酸化からのタンパク質の防護によるものであり、その結果、感受性細菌よりもはるかに高い回復中効率で酵素修復系が残存し、機能する（この場合、細胞タンパク質はカルボニル化に高度に感受性である）。科学雑誌に発表された報告（Daly et al. (2004), Accumulation of Mn(II) in Deinococcusradiodurans facilitates gamma-radiation resistance, Science 306: 925-1084）では、細胞内マンガン（ＩＩ）は、電離放射線への曝露中に、タンパク質を防護する（しかしＤＮＡを防護しない）ことにより放射線耐性を助長するのに関与した；そしてPLoS Biologyに発表された第二の報告（Daly et al. (2007)Protein oxidation implicated as the primary determinant of bacterialradioresistance, PLoS Biology 5(4)e92）では、放射線耐性は、非酵素機序により媒介される照射中のタンパク質防護と正の相関を示した。

デイノコッカス・ラディオデュランスと違って、ほとんどのタンパク質は、放射線耐性でない。同様に、ほとんどの細胞は、真核生物であれ、原核生物であれ、または哺乳動物（例えばヒト）であれ、放射線耐性でない。このようなものとして、放射線への曝露は、タンパク質の構造および／または機能に相当な損害を与えている。例えば電離放射線は、動物の多くの異なる種において、そしてヒト身体のほとんどすべての部分において、癌を誘導する（引き起こす）ことが示されている。

ヒトにおいて、放射線への有意の過剰曝露は、放射線中毒（「放射線病」または「creepingdose」とも呼ばれる）を生じ得る。当該用語は、一般的に、短期間での高線量の放射線により引き起こされる急性問題に言及するために用いられるが、しかしこれは、低レベル放射線への長期曝露でも起きている。「放射線病」に対する臨床名は、ＣＤＣによると急性放射線症候と記載される。慢性放射線症候は、存在するが、しかし非常に稀である；これは、初期ラジウム線源製造現場における、ならびにソビエト核計画の初期段階における従業者の間で観察されている。短期曝露は、急性放射線症候を生じ得る；慢性放射線症候は、長期の高レベル曝露を要する。

ヒトは、ごく普通に、電子機器および携帯電話からの放射線、ならびに自然バックグラウンド放射線を含めて、日常生活で放射線に遭遇する。放射性元素にごく接近している個体、例えば核施設の従業員または軍隊の成員は、特に、高線量の放射線に遭遇すると思われる。さらに、放射線は、Ｘ線のような診断試験および癌を処置するための放射線治療に用いられる。

ヒトを処置するために適している放射線防護剤は一般に非常に少数であり、現存するもの（例えばアミフォスチン）は、細胞傷害性であり、重篤な副作用（例えば、意識喪失、速くまたは不規則な呼吸、掻痒、悪心および嘔吐）を有する。

放射線への曝露が大きい場合、非毒性であり、タンパク質機能を保存し、そして特にヒト使用に適している放射線防護剤に対する有意の必要性が存在する。

本発明は、微生物に対するワクチンの生産方法であって、放射線防護用組成物の存在下で微生物を培養し、回収しおよび／または懸濁すること、そして微生物を複製不能にさせるのに十分な放射線の線量で微生物を照射することを包含する方法を提供する。本発明のワクチン製造方法に用いられる放射線防護用組成物は、マンガン含有緩衝液中に少なくとも１つのデカペプチドを含む。

本発明は、培養中の細菌を電離放射線（ＩＲ）に耐性にさせる方法であって、放射線防護用組成物の存在下で細菌を培養することを包含する方法も提供する。本発明のＩＲ耐性方法に用いられる放射線防護用組成物は、少なくとも１つのヌクレオシド、リン酸塩、少なくとも１つの酸化防止剤およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。

デイノコッカス・ラディオデュランス限外濾過物中の化合物はタンパク質を防護するが、しかしシュードモナス・プチダ（ＰＰ）、大腸菌（ＥＣ）および高度高熱菌（サーマス・サーモフィルス）（ＴＴ）からの限外濾過物からの化合物は防護しない、ということを示す。タンパク質無含有限外濾過デイノコッカス・ラディオデュランス（ＤＲ）細胞抽出物は、in vitroでの電離放射線（ＩＲ）誘導性タンパク質酸化を防止するが、しかし放射線感受性細菌であるシュードモナス・プチダ（ＰＰ）、大腸菌（ＥＣ）および高度高熱菌（サーマス・サーモフィルス）（ＴＴ）からの抽出物は防止しなかった。精製大腸菌タンパク質を、照射中にＰＰ−、ＥＣ−、ＴＴ−、またはＤＲ−限外濾過抽出物中でインキュベートして、タンパク質カルボニル検定に付した。クーマシー染色ポリアクリルアミド変性ゲル；カルボニルウエスタンブロット：タンパク質酸化および防護を明示する（シグナルなし）。シュードモナス・プチダ（ＰＰ）、大腸菌（ＥＣ）および高度高熱菌（サーマス・サーモフィルス）（ＴＴ）からの限外濾過物と比較したデイノコッカス・ラディオデュランス（ＤＲ）の組成物を示す。短期ＩＲに曝露され、種々の補足物：ＴＧＹ、標準富ペプチド増殖培地；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＵＭｎＰ、３ｍＭウリジン／１μＭＭｎ^２＋／１３ｍＭＰｉＢ（リン酸塩緩衝液）の存在下で増殖された大腸菌の生存曲線を示す。電離放射線に対する耐性におけるペプチドの役割を示す。（Ａ）デイノコッカス・ラディオデュランスにおけるアミノ酸のサイトゾル分布および濃度：「無ＩＲ」氷上で２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中に保持され、次いで洗浄され、２５ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４（３２℃）中に０または３０分間保持された非照射対照細胞。「＋ＩＲ」氷上で２５ｍＭリン酸塩ム緩衝液、ｐＨ７．４中で７ｋＧｙに照射され、次いで洗浄され、２５ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４（３２℃）中に０または３０分間保持された細胞。細胞を回収し、２０％ＴＣＡ中に再懸濁して、溶解した。中和上清のアリコートを、遊離アミノ酸およびペプチド由来アミノ酸含量に関して分析した。（Ｂ）デカペプチド（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ；１２６１Ｄａ）によるＢａｍＨＩの放射線防護。（Ｃ）リン酸カリウム緩衝液（ＰｉＢ）、ｐＨ７．４または重炭酸ナトリウム（ＨＣＯ_３）、ｐＨ７．４中のＭｎ^２＋およびロイシン（Ｌｅｕ）、ウリジン（Ｕ）またはデカペプチド（ＤＰ）によるグルタミンシンターゼ（ＧＳ）の放射線防護。マンガン複合体を用いた照射ワクチン調製のためのアプローチを示す。（Ａ）Ｍｎ^２＋複合体（Ｍｎ−ｐｅｐ−Ｐｉ）：３ｍＭ（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ）（配列番号１）１ｍＭＭｎＣｌ、２５ｍＭオルトホスフェート（Ｐｉ）緩衝液（ｐＨ７．４）で処置した（右）または処置しない（左）照射バクテリオファージλから、ＤＮＡを調製した。指示ガンマ線線量（０ないし４０ｋＧｙ）で、ＤＮＡ（４８．５ｋｂｐゲノム）をバクテリオファージλから精製し、慣用的アガロースゲル電気泳動に付して、次に、放射能標識λＤＮＡプローブでサザンブロッティング処理した。結論：Ｍｎ^２＋複合体は、ウイルス中にパッケージされたＤＮＡを有意に防護しない。（Ｂ）パネルＡで試験したものと同一バクテリオファージλ調製物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてウイルスタンパク質を分離することにより、タンパク質完全性に関して試験した。結論：Ｍｎ^２＋複合体の非存在下（左）で照射されたウイルス中のタンパク質は、漸進的に破壊された。これに対比して、Ｍｎ^２＋複合体を含有した（右）ウイルス試料中のタンパク質は、４０ｋＧｙという高い線量による影響を受けなかった。（Ｃ）ウイルスＤＮＡを消失させた（パネルＡ）、そしてウイルスを完全に非感染性にさせた（示されていない）用量である４０，０００Ｇｙで、ウイルスタンパク質は完全に免疫原性のままであった。これを、ウエスタン分析により試験して、非照射λファージに対してウサギ中で生じた抗体でλタンパク質を攻撃誘発した。注：Ｍｎ^２＋複合体の存在下で４０，０００Ｇｙに曝露されたλファージに対して生じた抗体でプローブされた等価ウエスタンに関して、免疫原性に関する同一陽性結果を得た。これに対比して、Ｍｎ^２＋複合体の非存在下で４０，０００Ｇｙに曝露されたλファージは、ネイティブバクテリオファージλに関して有意の特異性を有するウサギ中の抗体を産生しなかった。（Ｄ）および（Ｅ）：Ｍｎ^２＋複合体で処置した（Ｅ）または非処置の（Ｄ）λファージ照射後の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）。（Ｆ）および（Ｇ）：Ｍｎ^２＋複合体で処置した（Ｇ）または非処置の（Ｆ）λファージ照射（４０ｋＧｙ）後のＴＥＭ。Ｍｎ^２＋複合体の存在下では、４０ｋＧｙに曝露されたλファージウイルス粒子は損傷を受けなかった。黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を用いて試験したマウスからの表およびグラフデータを示す。これらのデータは、照射組成物中のマンガン複合体の存在が処置マウスにおけるより大きな免疫応答を付与した、ということを示す。

本発明人等はデイノコッカス・ラディオデュランスの放射線耐性を試験して、放射線防護特性を示す超精製タンパク質無含有細胞抽出物を調製した。したがって、本発明は、一部は、デイノコッカス・ラディオデュランス細胞無含有抽出物の放射線防護構成成分ならびにこのような構成成分を含有する人工組成物の発見に基づいている。

特に、出願人等は、デイノコッカス・ラディオデュランス超精製およびタンパク質無含有細胞抽出物がガンマ線に曝露されたタンパク質について極度に放射線防護性である、ということを示した。アデノシン、ウリジンおよびペプチドは、放射線感受性細菌の限外濾過物中より高濃度でデイノコッカス・ラディオデュランス限外濾過物中に蓄積される。in vitroの、線量＞１０，０００Ｇｙでのヌクレオシドは、タンパク質について高度に防護性で、電離放射線（ＩＲ）誘導性タンパク質カルボニル化を防止し、そしてＭｎ（ＩＩ）の存在下で酵素機能を保存することが示された。アデノシン、マンガン、ペプチドおよびリン酸塩の放射線防護用組成物が開発された。意外にも、デイノコッカス・ラディオデュランス抽出物は、他の十分に確立された放射線防護化合物より大きな効力を有する培養ヒトＴ細胞に関する強力な放射線防護剤であることが示されていた。

本発明は、合成またはデイノコッカス・ラディオデュランス（ＤＲ）由来の放射線防護用組成物、ならびに放射線損害からタンパク質および／または細胞を防護するためのこれらの組成物の使用方法を提供する。これらの組成物は、組成物における、ならびに被験体、例えばヒトにおける、または細胞培養における放射線損傷を防止するために有用である。本発明の組成物は、マンガン、少なくとも１つの酸化防止剤ペプチドを含実、あるいはそれらは、マンガンおよび個々のアミノ酸のコレクションを含む。付加的実施形態では、組成物は、少なくとも１つのヌクレオシドも含み得る。本明細書中で用いる場合、「放射線防護用組成物（radioprotective composition）」または「放射線防護組成物（radiationprotective composition）」という用語は、本明細書中に記載される方法に従って調製されるＤＲ限外濾過抽出物を意味し得るし、あるいはそれは、マンガンおよび少なくとも１つの酸化防止剤ペプチドまたは個々のアミノ酸のコレクションを含む合成組成物を意味し得る。ＤＲ限外濾過抽出物が用いられる場合、この抽出物は、本明細書中に記載され、開示される化合物のいずれかを補足され得る。例えば、ＤＲ限外濾過物は、本明細書中に開示される方法に従って調製され得るし、例えば付加的Ｍｎ^２＋またはペプチドが抽出物に付加され得る。

放射線防護用組成物は、さらに、ロイシン、アラニンおよび／またはバリンを含有する。ロイシンは、Ｍｎ（ＩＩ）の存在下で過酸化水素を掃去するのに強く関与し、そしてウリジンおよびアデノシンを含むより大きな細胞内複合体の構成成分であり得る。強力なin vitro証拠は、アデノシンおよびマンガンおよびリン酸塩間の相乗作用を示す。アデノシンおよびマンガンおよびリン酸塩または重炭酸塩緩衝液の化学量論は、アポトーシス検定のために最適化され得る。

出願人等は、アデノシン単独およびＭｎ（ＩＩ）単独が哺乳動物細胞株に関して、ならびに細菌細胞培養に関してin vivoで放射線防護性である、ということを示した。

特定の理論に縛られずに考えると、プリンヌクレオシド（例えばアデノシン）、ピリミジンヌクレオシド（例えばウリジン）およびペプチド酸化防止剤（例えばマンガン−ペプチド）を含む組成物は、タンパク質の活性部位および表面を隠すことにより、放射線防護剤として作用する。プリンヌクレオシド、例えばアデノシン（ならびに任意に、ピリミジンヌクレオシドであるウリジン、およびペプチドと組合される）は、細胞内に蓄積時にその放射線防護作用を仲介し、これが、放射線誘導性タンパク質酸化を抑制し、そしてＭｎ（ＩＩ）の存在下で、酵素機能を保存する。アデノシンは、タンパク質を防護し、したがって、ＲＯＳの小集団を掃去すると思われる。

さらに、如何なる特定の理論にも縛られることなく考えると、好気性または嫌気性照射条件下で、スーパーオキシドが照射中に細胞中に生成されるが、これはスーパーオキシドが容易に膜を通り抜けないためである。スーパーオキシドはＤＮＡと反応しないが、しかしスーパーオキシドは、曝露２Ｆｅ−２Ｓまたは４Ｆｅ−４Ｓクラスターを有する酵素を損傷し、不活性化してＦｅ（ＩＩ）を放出し、例えばシステイン（これに限定されない）のようなある曝露アミノ酸も損傷する。細胞中の鉄に伴う問題は、それが結合されず、「遊離」している場合、過酸化水素の存在下でフェントン反応を引き起こして、ヒドロキシルラジカルを生成するという点である。したがって、ヒドロキシルラジカルの生成のためだけでなく、Ｆｅ依存性酵素からのＦｅの損失は、それらが操作する生化学的経路の不全をもたらすため、結合Ｆｅ（ＩＩ）を遊離する状態は極度に危険である。当該出願の方法は、これらの危険状態に対して最適に防護する。

別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様のまたは等価の任意の方法および物質が、本発明の実施または試験に用いられ得るが、しかし好ましい方法および物質が記載されている。

本明細書中で用いる場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、明らかに別記しない限り、少なくとも１つを意味する。「約」という用語は、別記しない限り、当該用語により修飾されている値より１０％以下で大きいかまたは小さい値を指す。例えば「約５％（ｗ／ｗ）」という用語は、４．５％（ｗ／ｗ）〜５．５％（ｗ／ｗ）の範囲を意味する。

本発明は、タンパク質機能またはタンパク質免疫原性を保存する方法であって、タンパク質を本発明の組成物と接触させることを包含する方法を提供する。本発明の一実施形態は、例えばガンマ線といったような過激な状態に曝露される場合、タンパク質機能を保存する方法である。本発明の別の実施形態では、当該方法は、乾燥中にタンパク質機能を保存する。

タンパク質機能を保存する方法は、タンパク質が高線量の放射線に、例えば１０ｋＧｙを超える、例えば１７．５ｋＧｙの線量に曝露される場合、放射線防護を提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞培養またはウイルス調製物におけるタンパク質機能またはタンパク質免疫原性の防護方法であって、本明細書中に記載される放射線防護用組成物のうちのいずれかを用いて、細胞を培養し、回収し、および／または懸濁することを包含する方法を提供する。ウイルス調製物は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡゲノムに関するものであり得る。細胞培養は、原核生物または真核生物性であり得る。一実施形態では、細胞培養は細菌性である。別の実施形態では、細胞培養は哺乳動物性である。さらに別の実施形態では、細胞培養はウイルスを増殖させる目的のための培養である。

任意のヌクレオシドは、存在する場合、放射線防護用組成物中に用いられ得る。適切なヌクレオシドとしては、アデノシン、ウリジン、β−擬似ウリジン、イノシンおよびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、１つの（Ｎ３）Ｈ基により分離される２つのカルボニル酸素基（Ｃ＝Ｏ）を含有するヌクレオシドも用いられ得る。一実施形態では、ヌクレオシドはアデノシンまたはウリジンである。一実施形態では、組成物はアデノシンを含有する。本発明の他の実施形態では、組成物はウリジンを含有する。組成物中のヌクレオシドの量は、その使用に関して変わる。当業者は、適切な量を決定し得る。本発明のいくつかの実施形態では、ヌクレオシドの量は、約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲である。一実施形態では、１つ以上のヌクレオシドの濃度は、約１ｍＭ〜約１５ｍＭのアデノシンおよび／またはウリジンを含む。

種々の酸化防止剤が組成物中に用いられ得るし、または存在し得る。適切な酸化防止剤としては、マンガン、ビタミンＥおよびリン酸マンガン、Ｍｎ−ペプチド、Ｍｎ−アミノ酸（例えばロイシン）、Ｍｎ−ＴＲＩＳ、Ｍｎ−メラニン、Ｍｎ−カフェイン、Ｍｎ−リボース、Ｍｎ−トレハロース、Ｍｎ−ジピコリン酸、Ｍｎ−リン酸塩およびＭｎ−重炭酸塩が挙げられる。本発明の一実施形態では、酸化防止剤はマンガンである。別の実施形態では、酸化防止剤はＭｎＣｌ_２である。さらに別の実施形態では、酸化防止剤はビタミンＥおよび／またはアスピリンである。組成物中の酸化防止剤の量は、その使用に際して変わる。当業者は、適切な量を決定し得る。一実施形態では、組成物は約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭの酸化防止剤を含有する。別の実施形態では、組成物は、約０．０１ｍＭ〜約１２．５ｍＭを含有する。

本発明の一実施形態では、一酸化防止剤は、混合物として提供され得るリン酸マンガンである。一実施形態では、混合物は、マンガンの溶液およびリン酸塩の溶液を混合することにより生成される。組成物中の酸化防止剤の量は、その使用に関して変わる。当業者は、適切な量を決定し得る。一実施形態では、組成物は、約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭのマンガン（Ｍｎ（ＩＩ））イオンを含む。さらに具体的実施形態では、組成物は、リン酸塩緩衝液中の約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭのマンガン（Ｍｎ（ＩＩ））イオンを含む。さらに具体的実施形態では、組成物は、約１ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度でリン酸塩緩衝液を含む。一具体的実施形態では、混合物は、Ｍｎ（ＩＩ）の１ｍＭ溶液および２５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）の溶液である。

組成物は、細胞防護特性を示す１つ以上のアミノ酸を含有する。本発明の一実施形態では、組成物はさらに、アスパラギン、グルタミン、セリン、ヒスチジン、グリシン、トレオニン、アルギニン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、イソロイシン、リシン、オルニチン、ロイシン、バリンおよびアラニンからなる群から選択される少なくとも１つまたはそれ以上のアミノ酸を含有する。別の実施形態では、アミノ酸はロイシンである。代替的実施形態では、アミノ酸はグリシンである。別の実施形態では、組成物は少なくともロイシンおよびアラニンを含む。別の実施形態では、組成物はプロリンを含有しない。さらに別の実施形態では、別のアミノ酸の存在に対して測定した場合、組成物は１０％以下のプロリンを含有する。例えば１２の異なるアミノ酸の等混合物は、この実施形態では、１個以下のプロリン残基を含有する。

個々のアミノ酸に代わるものとして、または個々のアミノ酸の存在に加えて、組成物およびこれらの組成物を用いる方法は、少なくとも１つの小ペプチド、例えばデカペプチド（これに限定されない）を含み得る。本明細書中で用いる場合、「小ペプチド」は、約２５以下の残基長の小型の直鎖のアミノ酸を意味する。一実施形態では、本発明の組成物または方法に用いられる小ペプチドは、約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２アミノ酸長である。ペプチドの実際の配列は、本発明の組成物および方法にとっては重要ではなく、したがって、任意の無作為ペプチド鎖で十分である。例えば、一実施形態では、組成物およびこれらの組成物を用いる方法は、少なくとも１つの小ペプチドを含み得るが、この場合、小ペプチドは、配列番号１：Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、小ペプチドはプロリン残基を含有しない。別の実施形態では、ペプチドは、他のアミノ酸と比較して、１０％未満のプロリンを含有する。例えば、この具体的実施形態では、１２−ｍｅｒは１つ以下のプロリン残基を含有する。

さらなる実施形態では、小ペプチドは、各々独立して、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号１のアミノ酸配列と１００％未満同一である小ペプチドは、その変異体であるとみなされる。

小ペプチドの量は、変化する。種々の因子、例えば被験体、放射線曝露持続期間、放射線曝露の量等によって、適切な量を当業者は決定し得る。本発明のいくつかの実施形態では、小ペプチドの量は、約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲である。一実施形態では、１つ以上の小ペプチドの濃度は、約１ｍＭ〜約１５ｍＭの配列番号１のペプチドまたはその変異体を含む。他の実施形態では、１つ以上の小ペプチドの濃度は、約１５ｍＭ以下、約１４ｍＭ以下、約１３ｍＭ以下、約１２ｍＭ以下、約１１ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約９ｍＭ以下、約８ｍＭ以下、約７ｍＭ以下、約６ｍＭ以下、約５ｍＭ以下、約４ｍＭ以下、約３ｍＭ以下、約２ｍＭ以下、約１ｍＭ以下、約０．５ｍＭ以下の配列番号１のペプチドを含む。もちろん、１つ以上の小ペプチドの濃度は、列挙された濃度のいずれかの間、例えば約１５ｍＭ〜約１４ｍＭ、約１４ｍＭ〜約１３ｍＭ、約１３ｍＭ〜約１２ｍＭ、約１２ｍＭ〜約１１ｍＭ、約１１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約９ｍＭ、約９ｍＭ〜約８ｍＭ、約８ｍＭ〜約７ｍＭ、約７ｍＭ〜約６ｍＭ、約６ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ〜約４ｍＭ、約４ｍＭ〜約３ｍＭ、約３ｍＭ〜約２ｍＭ、約２ｍＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約０．５ｍＭ等の配列番号１のペプチドまたはその変異体であり得る。

参照アミノ酸配列、例えば配列番号１と、少なくとも、例えば約９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であるが、但し、アミノ酸配列は参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり約５つまでの修飾を含む、ということを意味すると理解される。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るためには、参照配列の約１０％までのアミノ酸残基が欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換され得るし、あるいは参照配列中の総アミノ酸の約１０％までの多数のアミノ酸が参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの修飾は、参照アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端位置で、あるいはその末端位置間のどこでも起こり、参照配列中のアミノ酸の間に独立して、あるいは参照配列内に１つ以上の連続群で差し込まれ得る。

本明細書中で用いる場合、「同一性」は、参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した場合のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の測定値である。概して、配列は、最高次数整合が得られるよう、整列される。「同一性」それ自体は、当該技術分野で認められた息を有し、公表された技法を用いて算定され得る（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford UniversityPress, New York (1988)；Biocomputing: Informatics AndGenome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., andGriffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；vonHeinje, G., Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987)；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., MStockton Press, New York (1991)参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するにはいくつかの方法があるが、「同一性」という用語は、当業者に周知である（Carillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48: 1073 (1988)）。２つの配列間の同一性または類似性を確定するために一般に用いられる方法としては、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, SanDiego (1994)およびCarillo, H. & Lipton, D., Siam JApplied Math 48: 1073 (1988)に開示された方法が挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータープログラムも、同一性および類似性を算定する方法およびアルゴリズムを含有し得る。２つの配列間の同一性および類似性を確定するためのコンピュータープログラム方法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215: 403 (1990)）およびＦＡＳＴＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。同一性および類似性を確定するための方法の例は、Michaels, G. and Garian, R., Current Protocols in Protein Science,Vol 1, John Wiley & Sons, Inc. (2000)（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）で考察されている。

本発明の一実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の同一性を確定するために用いられるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。本発明の別の実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の同一性を確定するために用いられるアルゴリズムはＦＡＳＴＤＢであり、これは、Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990))（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）のアルゴリズムを基礎にしている。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントにおいて、問合わせ配列および参照配列はアミノ配列である。配列アラインメントの結果は、同一性％で示す。同一性％を算定するためにアミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに用いられ得るパラメーターとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：マトリックス＝ＰＡＭ、ｋ組＝２、不整合ペナルティー＝１、連結ペナルティー＝２０、無作為化群長＝０、カットオフ・スコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または被験体アミノ配列の長さ（どちらか短い方）。

Ｎ末端またはＣ末端付加または欠失のために（しかし内部付加または欠失のためではなく）、参照配列が問合わせ配列より短いかまたは長い場合、手動補正がなされ得るが、これは、同一性％を算定する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが参照配列のＮ末端およびＣ末端切頭化または付加を説明しないためである。参照配列に比してＮ−またはＣ末端で切頭化される問合わせ配列に関しては、整合／整列されない参照配列に対してＮ−およびＣ末端にある問合わせ配列の残基の数を算定することにより、問合わせ配列の総塩基の％として、同一性％が補正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果は、整合／アラインメントを確定する。次いで、特定パラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより算定される同一性％からアラインメントパーセンテージが差し引かれて、最終同一性％スコアに到達する。この補正スコアは、アラインメントが互いに「対応する」方法ならびに同一性パーセンテージを確定する目的のために用いられ得る。問合わせ配列のＮ−またはＣ末端を通り越して伸びる参照配列の残基が、同一性％スコアを手動で調整する目的のために検討され得る。すなわち、比較配列のＮ−またはＣ末端を伴って整合／整列されない残基は、同一性％スコアまたはアラインメント番号付けを手動で調整する場合に計数され得る。

例えば、９０アミノ酸残基問合わせ配列は、１００残基参照配列とともに整列されて、同一性％を確定する。欠失は、問合わせ配列のＮ末端で生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端での最初の１０残基の整合／アラインメントを示さない。１０の非対合残基は、参照配列の１０％を表し（整合されないＮ−およびＣ末端での残基の数／参照配列中の残基の総数）、そこで１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより算定される同一性％スコアから差し引かれる。残りの９０の残基が完全に整合される場合（１００％アラインメント）、最終同一性％は９０％である（１００％アラインメント−１０％非整合オーバーハング）。別の例では、９０残基問合わせ配列は１００参照配列と比較されるが、但し、欠失は内部欠失である。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより算定される同一性％は、手動で補正されないが、これは、問合わせを伴う整合／整列されない被験体配列のＮ−またはＣ末端に残基が存在しないためである。さらに別の例では、１１０アミノ酸問合わせ配列は、１００残基参照配列とともに整列されて、同一性％を確定する。問合わせにおける付加は問合わせ配列のＮ末端で生じ、したがってＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端での最初の１０残基の整合／アラインメントを示し得ない。問合わせ配列の残りの１００アミノ酸残基が参照配列の全長との９５％同一性を有する場合、問合わせのＮ末端付加は無視され、参照配列に対する問合わせの同一性％は９５％である。

一実施形態では、組成物は、アデノシン、ウリジン、ロイシン、アデニンおよびマンガンを含む。別の実施形態では、組成物は、約１〜約１５ｍＭアデノシンおよび約１〜約１２．５ｍＭＭｎＣｌ_２を含む。別の実施形態では、組成物は、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含有するデイノコッカス・ラディオデュランス抽出物を含む。

本発明の方法の使用により、任意のタンパク質機能が保存され得る。本発明の好ましい実施形態では、タンパク質は酵素である。本発明の開示の方法は、紫外線および老化に関連するタンパク質酸化を防止するのに特に有用である。さらに、当該方法は、乾燥中のタンパク質機能も保存し、したがって、乾燥血液製品および酵素ベースの薬剤（乾燥保存される）の保存寿命を増大するのに役立つ。

本発明の方法は、放射線への曝露中に、タンパク質機能（例えば、酵素活性）を最適に保存する。本発明の一実施形態は、タンパク質（例えば酵素）を、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含む組成物と接触させることを包含する保存方法である。

本発明の別の実施形態は、微生物および酵素由来燃料電池の耐久性および寿命を増大する方法であって、燃料電池の構成成分を、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含む組成物と接触させることを包含する方法である。

この方法は、多数のタンパク質、例えばＦｅ−Ｓ複合体（代謝酵素）（これらに限定されない）の機能、ならびにレドックス活性（４Ｆｅ−４Ｓ）クラスターによって決まる酵素的修復機能を保存するのに適切であり得る。例示的タンパク質としては、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に関連したタンパク質群、生合成要求を低減し、ＲＯＳの産生を抑圧し得る輸送タンパク質前駆体、ＲＯＳに対して防御するタンパク質、損傷分子（非ＤＮＡ）の修復およびレドックス調節ならびにＭｎおよびＦｅ依存性系に関与するタンパク質が挙げられる。他の例示的タンパク質は、Ghosal et al. (2005), FEMS Microbiology Reviews 29: 361-375（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に列挙されている。

本発明は、微生物に対するワクチンの生産方法であって、本発明の放射線防護用組成物の存在下で微生物を培養し、回収しおよび／または懸濁すること、そして微生物を複製不能にさせるのに十分な放射線の線量で微生物を照射することを包含する方法も提供する。一実施形態では、放射線防護用組成物は、合成性である。別の実施形態では、放射線防護用組成物はＤＲ限外濾過抽出物である。

ワクチン調製の方法は、当該技術分野で周知である。本明細書中で提供される方法は、これらの周知のワクチン調製方法に適用され得るし、あるいはそれらは別々に、そして伝統的ワクチン調製方法とは独立して用いられ得る。例えば、本発明の一実施形態は、ワクチンが調製されるべき微生物を遺伝子工学処理しないワクチン調製方法を提供する。本明細書中に開示される方法は、極度線量の放射線中で、微生物内のタンパク質の三次元構造ならびに微生物上の細胞表面マーカーが保存されるよう、放射線防護用組成物の存在下で、正常野生型微生物を培養、回収および／または懸濁させる。微生物が複製できないよう、放射線の線量は微生物のゲノムを消失させるように意図される。放射線線量投与後、複製不能細胞は収集され、そして正常ワクチン準備技術を用いてワクチン調製が実行され得る。照射微生物を含むワクチンの動物への投与が免疫原性応答を生じるよう、本発明の防護用組成物は、微生物の免疫原性タンパク質の少なくとも一断片を保存する。したがって、本発明のワクチン調製方法は、慣例的細胞培養技法を用いて実行され得る。本発明の方法を用いてワクチンが調製され得る微生物としては、細菌およびウイルスが挙げられる。細菌およびウイルスに関する標準細胞培養技法は、当該技術分野で周知である。

もちろん、本発明のワクチン調製方法は、特定の型の放射線に限定されないが、但し、用いられる型および線量は微生物を複製不能にさせ得る。放射線の例としては、紫外線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、Ｘ線および中性子線が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、放射線の線量は少なくとも約２０ｋＧｙである。放射線の線量は細菌混合物に関しては２５，０００Ｇｙ（２５ｋＧｙ）を上回り、ウイルス混合物に関する放射線の線量は４０，０００Ｇｙ（４０ｋＧｙ）を上回り得る。

本発明は、培養中の細菌を電離放射線（ＩＲ）に対して耐性にさせる方法であって、本発明の放射線防護用組成物の存在下で細菌を培養することを包含する方法も提供する。本発明のＩＲ耐性方法に用いられる放射線防護用組成物は、少なくとも１つのヌクレオシド、リン酸塩、少なくとも１つの酸化防止剤および非代謝化ヒドロキシルラジカル掃去剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（これに限定されない）を含む。

本発明は、放射線曝露の作用を処置するかまたは防止する方法も提供する。当該方法は、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含む治療薬で放射線曝露の作用を処置するかまたは防止することを包含する。

本発明の一実施形態では、放射線曝露はＵＶ曝露による。本発明の別の実施形態では、放射線曝露は電離放射線による。本発明の別の実施形態では、放射線曝露は長期的である。

本明細書中で用いる場合、「治療薬」という用語は、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含む組成物、ならびに他の製薬上許容可能な構成成分、例えば製薬上許容可能な担体を含有する処方物を包含する。

本明細書中で用いる場合、「放射線曝露」という用語は、損害を引き起こすのに十分な線量および期間での任意の放射線への曝露を意味する。放射線曝露としては、紫外線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、Ｘ線および中性子線への曝露が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、本発明は、放射線治療の副作用を処置するかまたは防止する方法を提供する。本明細書中で用いる場合、「放射線治療」という用語は、癌細胞を殺し、腫瘍を縮小するためのある型のエネルギー（例えば電離放射線）の使用を指す。「放射線治療」という用語は、外部放射線治療（例えば、術中放射線治療および予防的頭蓋照射（ＰＣ））、内部放射線治療（間質放射線治療、腔内放射線治療または管腔内放射線治療）、全身放射線治療、定位的（または定位固定）放射線外科手術、三次元（３Ｄ）等角放射線治療、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）（これらに限定されない）を含めたすべての型の放射線治療を包含する。さらに、「放射線治療」という用語は、種々の放射線源、例えばＸ線、ガンマ線、粒子ビーム、陽子ビーム治療および高エネルギー光子線（これらに限定されない）を用いる放射線治療も包含する。放射線治療は、種々の癌、例えば固形腫瘍（例えば脳、乳房、頚部、喉頭、肺、膵臓、前立腺、皮膚、脊椎、胃、子宮の癌、または柔組織肉腫）を処置するために用いられる。放射線治療は、白血病およびリンパ腫（すなわち、それぞれ血液形成細胞およびリンパ系の癌）、ならびに皮膚、頚部、甲状腺の癌を処置するためにも用いられる。

本明細書中で用いる場合、「放射線治療の副作用」という用語は、放射線治療を受けている被験体が経験する任意の副作用を指す。このような副作用としては、倦怠および皮膚反応、貧血、負傷または出血の危険増大、受精能低減、口の渇き、食欲および体重低下、抜け毛等が挙げられるが、これらに限定されない。

「処置を必要とする被験体」は、潜在的に命の危険があるか、あるいは動物の健康を損ねるかまたは寿命を短くする細菌感染を有する動物である。動物は、魚、鳥または哺乳動物であり得る。例示的哺乳動物としては、ヒト、家畜化動物（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌおよびネコ）、ならびに例えば動物園における展示動物が挙げられる。好ましい一実施形態では、被験体はヒトである。

「処置する」、「処置」および「治療」という用語は、本明細書中で用いる場合、治癒的治療、予防的治療および防止的治療を指す。

本明細書中で用いる場合、別記しない限り、組成物という用語は、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含有する薬学的組成物および機能性食品組成物（これらに限定されない）を包含するよう意図される。組成物は、疾患の診断、治癒、緩和、処置または防止における、あるいはヒト身体の構造または任意の機能に影響を及ぼすための、薬理学的活性または他の直接作用を欠く「不活性成分」または「化合物」である１つ以上の「賦形剤」も含有し得る。

「製薬上許容可能な」構成成分は、合理的利益／危険比に対応する過度の副作用（例えば、毒性、刺激およびアレルギー反応）を伴わずにヒト、動物および／または植物に関して用いるのに適切であるものである。

治療薬は、任意のヌクレオシドを含有し得る。適切なヌクレオシドとしては、アデノシン、ウリジン、β−擬似ウリジン、イノシンおよびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ヌクレオシドはアデノシンおよび／またはウリジンである。一実施形態では、治療薬はアデノシンを含有する。本発明の他の実施形態では、治療薬はウリジンを含有する。

治療薬は、本明細書中に開示された種々の適切な酸化防止剤を含有し得る。例えば適切な酸化防止剤としては、マンガン、ビタミンＥおよびリン酸マンガン、Ｍｎ−ペプチド、Ｍｎ−アミノ酸（例えばロイシン）、Ｍｎ−ＴＲＩＳ、Ｍｎ−メラニン、Ｍｎ−カフェイン、Ｍｎ−リボース、Ｍｎ−トレハロース、Ｍｎ−ジピコリン酸、Ｍｎ−リン酸塩およびＭｎ−重炭酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、治療薬の酸化防止剤はマンガンである。別の実施形態では、酸化防止剤はＭｎＣｌ_２である。さらに別の実施形態では、酸化防止剤は１つ以上のペプチドである。

本発明の一実施形態では、重要な酸化防止剤は、近似ミリモル濃度で提供され得るリン酸マンガンである。別の実施形態では、酸化防止剤はＭｎＣｌ_２であり、リン酸塩が別個に付加される。リン酸塩は、オルトリン酸塩であり得るし、そうでないこともある。組成物中の酸化防止剤の量は、その使用に際して変わる。当業者は、適切な量を決定し得る。一実施形態では、組成物は約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭのマンガン（Ｍｎ（ＩＩ））イオンおよび約１ｍＭ〜約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液を含有する。

治療薬中のヌクレオシドおよび酸化防止剤の量は、変化する。被験体、放射線曝露持続期間、放射線曝露量等によって、当業者は適切な量を決定し得る。本発明のいくつかの実施形態では、ヌクレオシドの量は、約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲である。一実施形態では、１つ以上のヌクレオシドの濃度は、約１ｍＭ〜約１５ｍＭのアデノシンおよび／またはウリジンを含む。別の実施形態では、酸化防止剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲である。別の実施形態では、治療薬は約約０．０１ｍＭ〜約１２．５ｍＭを含有する。

治療薬はさらに、細胞防護特性を示す１つ以上のアミノ酸を含有し得る。本発明の一実施形態では、治療薬はさらに、ロイシン、バリンおよびアラニンからなる群から選択される少なくとも１つまたはそれ以上のアミノ酸を含有する。別の実施形態では、アミノ酸はロイシンである。別の実施形態では、アミノ酸はグリシンである。

一実施形態では、治療薬は、アデノシン、ウリジン、ロイシン、アデニンおよびマンガンを含む。代替的実施形態では、治療薬は、約１ｍＭ〜約１５ｍＭアデノシンおよび約１ｍＭ〜約１２．５ｍＭＭｎＣｌ_２を含む。別の実施形態では、組成物は、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含有するデイノコッカス・ラディオデュランス抽出物を含む。

本発明のさらに別の実施形態では、治療薬は、１つ以上のヌクレオシド（例えば、アデノシン、ウリジン、β−擬似ウリジン、イノシンおよびそれらの混合物）、１つ以上の酸化防止剤（例えば、マンガン、ペプチドおよびビタミンＥ）、ならびに任意に、ロイシン、バリンおよびアラニンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含むヒト使用に適した組成物である。一実施形態では、ヒト使用に適した組成物は、アデノシンおよびマンガンを含む。

本発明の代替的一実施形態では、治療薬は、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含有するデイノコッカス・ラディオデュランス抽出物である。

放射線曝露の作用を処置し、または防止するための方法は、それを必要とする被験体への、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含む治療薬の投与を包含する。

一実施形態は、放射線治療の副作用を防止する方法であって、それを必要とする被験体への、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含むデイノコッカス・ラディオデュランス抽出物の投与を包含する方法である。

本発明の別の実施形態は、放射線治療の副作用を防止する方法であって、それを必要とする被験体への、１つ以上のヌクレオシド、酸化防止剤ならびに、任意に、アラニン、バリンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸を含む組成物の投与を包含する方法である。好ましくは、１つ以上のヌクレオシドはアデノシンおよび／またはウリジンであって、これは、約１ｍＭ〜約１５ｍＭのアデノシンおよび／またはウリジンの量で存在し得る。１つ以上のヌクレオシドは、アデノシン、ウリジン、β−擬似ウリジン、イノシンおよびそれらの混合物からなる群からも選択され得る。酸化防止剤は、マンガン（例えば、約１ｍＭ〜約１２．５ｍＭ）であり得る。一実施形態では、酸化防止剤はＭｎＣｌ_２である。別の実施形態では、酸化防止剤は１つ以上のペプチドである。別の実施形態では、組成物は、アデノシン、ウリジン、ロイシン、アデニンおよびマンガンを含む。

当該出願の方法は、特に有益である。十分に確立された放射線防護剤（例えばアミフォスチン）と比較して、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤（例えばアデノシン、ウリジン、ペプチドおよびＭｎ）を含む組成物は、相対的に非毒性である。

本発明の方法は、偶発的にまたは故意に電離放射線に曝露された軍隊従業者および一般市民の曝露前および後処置のために特に適している。

当該方法は、例えば原子力施設において、長期宇宙飛行中に、または国際宇宙ステーションで、有意慢性レベルの放射線に曝露される個体に対して予防的にも用いられ得る。

「安全且つ有効量」は、本発明の方法で用いられる場合、合理的利益／危険比と同等の過度の副作用（例えば毒性、刺激またはアレルギー反応）を伴わずに所望の治療的応答を生じるのに十分である構成成分の量を指す。「治療的有効量」とは、所望の治療的応答を生じるのに有効な構成成分の量、例えば細菌細胞分裂の速度を遅くするために、あるいは細菌細胞分裂の停止を引き起こすために、あるいは細菌の死を引き起こすかまたは集団増殖の速度を低減するために有効な量を意味する。具体的安全且つ有効量または治療的有効量は、処置されている特定症状、被験体の身体状態、処置されている被験体の種類、処置持続期間、併存治療（あれば）の性質、ならびに用いられる具体的処方物および化合物またはその誘導体の構造といったような因子に伴って変化する。

適用手段としては、直接的、間接的、担体および特殊手段または手段の任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ファージの直接的適用は、鼻噴霧、鼻滴下、鼻軟膏、鼻洗浄、鼻注射、鼻タンポン、気管支噴霧または吸入器、あるいは、咽頭ロゼンジの使用により、または口腔洗浄液またはうがい液の使用により、または鼻孔、鼻梁、または顔面に適用される軟膏の使用により、あるいはこれらの任意の組合せにより間接的に、ならびに同様の適用方法によりなされ得る。ファージが投与される形態としては、ロゼンジ、トローチ、キャンディ、注射剤、チューインガム、錠剤、粉末、噴霧剤、液体、軟膏およびエーロゾルが挙げられるが、これらに限定されない。

治療薬は鼻噴霧剤中にも入れられ得るが、この場合、鼻噴霧剤は担体である。鼻噴霧剤は、長時間作用性または時限放出噴霧剤であり得るし、当該技術分野で周知の手段により製造され得る。吸入剤も用いられ得るので、治療薬はさらに肺を含めて気管支に到達し得る。

治療薬は、液体形態で、または凍結乾燥状態でこれらの物質に付加され得が、この場合、それが唾液のような体液に出会うと、可溶化される。酵素も、ミセルまたはリポソーム中に存在し得る。

これらの方法は任意の哺乳動物種、例えば農場動物、例えばウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびウシ（これらに限定されない）に用いられ得るが、組成物の好ましい使用はヒトのためである。

組成物の有効投与速度および量は、一部は、組成物が治療的に用いられるか、予防的使用か、放射線へのレシピエントの曝露持続時間、放射線の種類、個体のサイズおよび体重等によって決まる。組成物の使用に関する持続時間も、その使用が予防目的（この場合、使用は時間単位、日単位または週単位、短時間の間であり得る）か、あるいは使用が治療目的（この場合、有用性が数時間、数日または数週間および／または１日単位で、あるいは１日の間の時限期間で継続し得るよう、組成物の使用のより強力なレジメンが必要とされる）かによって決まる。用いられる任意の剤形は、最小時間量の間に最小数の単位を提供すべきである。有効量または投与量のファージを提供すると思われるファージの活性単位の濃度は、鼻および経口通路の湿潤または湿気環境中の流体約１００単位／ｍｌ〜約１００，０００単位／ｍｌの範囲、おそらくは、約１００単位／ｍｌ〜約１０，０００単位／ｍｌの範囲であり得る。さらに具体的には、放射線への時間曝露は、活性放射線防護組成物単位／ｍｌの所望の濃度に影響を及ぼし得る。「長期」または「遅延」放出担体として分類される担体（例えば、ある種の鼻噴霧剤またはロゼンジ）は、低濃度の組成物を、しかしより長い時間に亘って保有するかまたは提供するが、一方、「短期」または「迅速」放出担体（例えばうがい剤）は、高濃度の組成物／ｍｌを、しかし短時間の間、保有するかまたは提供する、ということに留意すべきである。さらに、特定組成物の治療的有効量を、被験体に関連する因子について十分に考察して当業者は決定し得る、と理解される。

好ましい有効用量の選択は、当業者に既知であるいくつかの因子の考察に基づいて、当業者により（例えば臨床試験を介して）決定され得る。このような因子としては、処置または防止されるべき疾患、関連症候、患者の体重、患者の免疫状態、ならびに投与される薬学的組成物の正確さを反映することが当業者に既知の他の因子が挙げられる。

処方物に用いられるべき精確な用量も投与経路によって決まり、そして開業医の判断ならびに各患者の環境によって決定されるべきである。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験系から得られる用量−応答曲線から推測され得る。

放射線曝露の作用の予防的および治療的処置および／または防止のために、ヌクレオシドおよび酸化防止剤を含む組成物は、直接的、間接的、担体および特殊手段または種団の任意の組合せによっても適用され得る。ファージの直接的適用は、鼻噴霧剤、鼻滴下剤、鼻軟膏、鼻洗浄剤、鼻注射剤、鼻タンポン、気管支噴霧または吸入器、あるいは、咽頭ロゼンジの使用により、または口腔洗浄液またはうがい液の使用により、または鼻孔、鼻梁、または顔面に適用される軟膏の使用により、あるいはこれらの任意の組合せにより間接的に、ならびに同様の適用方法によりなされ得る。ファージが投与される形態としては、ロゼンジ、トローチ、キャンディ、注射剤、チューインガム、錠剤、粉末、噴霧剤、液体、軟膏およびエーロゾルが挙げられるが、これらに限定されない。炭疽の治療的処置のためには、これらの担体または組成物を分配する手段がファージを気管支および肺に到達させるので、気管支噴霧剤およびエーロゾルが最も有益である。

本発明の組成物は、非経口的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮または頬経路により投与され得る。例えば、作用物質は、微小注入により損傷部位に局所的に投与され得る。代替的には、または共存的には、投与は経口経路により得る。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、共存処置の種類（あれば）、処置の頻度、ならびに所望の作用の性質によって決まる。

本発明の一実施形態では、当該方法は、製薬上許容可能な担体中の治療薬の投与を包含する。適切な担体およびそれらの処方物は、Remington‘s Pharmaceutical Sciences, 2005,Mack Publishing Co.に記載されている。典型的には、処方物を等張にさせるために、適切な量の製薬上許容可能な塩が処方物中に用いられる。製薬上許容可能な担体の例としては、液体、例えば生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、さらに好ましくは約７〜約７．５である。処方物は、凍結乾燥粉末も含み得る。さらに担体としては、徐放性調製物、例えば固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられるが、このマトリックスは造形品、例えば皮膜、リポソームまたは微小粒子の形態である。ある担体は、例えば投与経路ならびに投与されている前炎症性サイトカイン阻害剤の濃度によってより多く選択され得る、ということは当業者には明らかである。

当該方法は、タンパク質傷害により仲介される多数のレドックス関連型の細胞損傷に対する治療を提供し、創傷治癒を促すことが最適である。

本発明の一実施形態は、放射線防護特性を示すデイノコッカス・ラディオデュランス細胞無含有限外濾過抽出物の調製方法である。一実施形態では、当該方法は、例えば遠心分離によりデイノコッカス・ラディオデュランスを回収し、デイノコッカス・ラディオデュランス培養を溶解して溶解物を作り、デイノコッカス・ラディオデュランス溶解物を洗浄した後、上清を生じるのに十分な時間および条件下で溶解物を遠心分離することを包含する。遠心分離後、上清は、マイクロフィルター、好ましくは３キロダルトン・マイクロフィルターに通されて、適切な時間、煮沸される。一実施形態では、上清は、濾過後、約１５〜約４５分間煮沸される。その結果生じるデイノコッカス・ラディオデュランス抽出物は、１つ以上のヌクレオシドおよび１つ以上の酸化防止剤を含有し、ブタノール中に溶解し、煮沸に耐性で、細胞無含有である。

一実施形態では、抽出物はアデノシンおよびマンガンを含有する。別の実施形態では、抽出物はアデノシンおよび／またはウリジンマンガンを含有する。細胞抽出物は、さらに、ロイシン、アラニンおよび／またはバリンも含有し得る。一実施形態では、デイノコッカス・ラディオデュランス抽出物は、少なくともアデノシン、ウリジン、ロイシン、アデニンおよびマンガンを含有する。

さらに説明しなくても、前記の説明ならびに以下の例示的実施例を用いて、当業者は本発明を製造し、利用し得るし、特許請求される方法を実行し得る、と考えられる。したがって、以下の作業例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示しており、如何なる点でも残りの開示内容を限定するものではない。

実施例１ − デイノコッカス・ラディオデュランスからのタンパク質無含有抽出物の調製
デイノコッカス・ラディオデュランス（ＡＴＴＣＢＡＡ−８１６）を、ＴＧＹ中でＯＤ６０００．９に増殖させて、遠心分離により回収し、フレンチ加圧処理により溶解した。細胞を洗浄し、次いで、２回蒸留脱イオン滅菌水（ｄＨ_２Ｏ）中に溶解した。溶解前に、細胞水度をｄＨ_２Ｏで調整して、約５０％の細胞内濃度を示す溶解物を生じた。粗細胞抽出物を、１７５，０００×ｇで２０時間、遠心分離した。上清を＜３キロダルトンMicrocon遠心分離フィルター（Millipore, USA）に通して、３０分間煮沸した。クーマシー（Bradford）タンパク質検定を用いて、アリコート化され、マイナス８０℃で保存された超精製抽出物中のタンパク質の仮想的非存在を確証した。

実施例２ − デイノコッカス・ラディオデュランスからのタンパク質無含有抽出物の分析
限外濾過細胞抽出物を、デイノコッカス・ラディオデュランス（ＡＴＣＣＢＡＡ−８１６）、シュードモナス・プチダ（ＡＴＣＣ４７０５４）、大腸菌（ＭＧ１６５５）および高度高熱菌（サーマス・サーモフィルス）（ＡＴＣＣＢＡＡ−１６３）から調製した。M.E. Maguireは、野生型大腸菌（ＭＭ１９２５、菌株Ｋ１２）およびその同質遺伝子型ｍｎｔＨ突然変異体（ＭＭ２１１５）を提供した。デイノコッカス・ラディオデュランスｒｅｃＡ−（ｒｅｃ３０）および大腸菌ｒｅｃＡ−（ＤＨ１０Ｂ）は、当該技術分野で既知である。ジャーカットＴ細胞株は、ＡＴＣＣＴＩＢ−１５２であった。６００ｎｍで同一光学密度（０．９；対数期）に、ＴＧＹ培地中のバッチ培養として増殖された細菌から、ＤＲ−、ＰＰ−、ＥＣ−およびＴＴ−限外濾過物を調製した。大腸菌およびジャーカットＴ細胞放射線防護試験に用いられるＤＲ−限外濾過物の大規模生産のために、デイノコッカス・ラディオデュランスの高細胞密度増殖は、２０Ｌ発酵器中であった。フレンチ加圧機を通すことにより、細胞をばらばらにした。以下の順序で、細菌溶解物を、１２，０００×ｇ（４℃で１時間）で遠心分離し；上清を、タンパク質を基礎にして濃度に関して標準化して、１９０，０００×ｇ（４℃で４８時間）で超遠心分離し；そして超遠心分離上清を、３ｋＤａフィルターに通して濾過した。限外濾過物を４０分間煮沸し、５倍濃縮して、−８０℃で保存した。ＤＲ−、ＰＰ−、ＥＣ−およびＴＴ−限外濾過物の化学組成を、以下のように確定した：Perkin Elmerモデル４１００ＺＬ原子吸光光度計におけるＭｎおよびＦｅ；マラカイトグリーン検定による無機リン酸塩；ＨＰＬＣによる塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチド；基質としてのアゾカゼインを用いたプロテアーゼ活性；ならびにAgilent Technologiesにより実行されたようなプレカラム誘導体化によるアミノ酸。

実施例３ − 大腸菌における放射線防護作用
独立してならびに組合せて、Ｍｎ^２＋、リン酸塩、ウリジンおよびＤＭＳＯの放射線防護特性を、ＴＧＹ培地中で増殖された大腸菌を用いて確定した；ＴＧＹは、酵素抽出物を基礎にした富ペプチド培地であり、約２００ｎＭのＭｎを含有する。３ｋＧｙで、１μＭのＭｎ^２＋をＴＧＹに補足しても、大腸菌の耐性を増大しなかった；１３ｍＭリン酸塩をＴＧＹに補足すると、大腸菌の耐性は８００倍増大した；そして３ｍＭウリジンまたは３８４ｍＭ（３％）ＤＭＳＯをＴＧＹに補足すると、大腸菌の耐性は５０倍増大した。これらの作用物質を独立して適用された濃度で組合せた場合、３ｋＧｙに曝露された大腸菌の生存率は１０，０００倍増大した。

実施例４ − 再構成Ｍｎ^２＋ペプチド複合体：
極度放射線防護性Ｍｎ^２＋−デカペプチド−リン酸塩複合体は、デイノコッカス・ラディオデュランスから精製された数百のペプチドのうちのコンセンサスアミノ酸配列（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ）（配列番号１）を基礎にしている。Ｍｎ^２＋複合体を自発的に形成する混合物の組成物は、３ｍＭ（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ）（配列番号１）、１ｍＭＭｎＣｌ_２、２５ｍＭオルトリン酸塩（Ｐｉ）緩衝液（ｐＨ７．４）を含む。in vitroで再構成される場合、Ｍｎ^２＋複合体は、５０，０００Ｇｙに曝露された酵素の活性を保存した。デカペプチドを用いた試験は、それがデカペプチドのアミノ酸組成物であり、アミノ酸の特殊な配列でなく、これが、Ｍｎ^２＋およびオルトリン酸塩緩衝液と組合された場合、その放射線防護特性にとって重要である、ということを実証した。ペプチドは１０アミノ酸に限定される必要はないが、しかし代わりに、上記デカペプチド中に存在する特定アミノ酸で構成される必要がある。
実施例５ − 照射ワクチンの産生のための再構成デイノコッカス・ラディオデュランスＭｎ^２＋複合体の適用

本明細書中に記載される方法を用いる細菌照射を試験し、モデルバクテリオファージ・λウイルスを用いて４０，０００Ｇｙで立証した（図５）。Ｍｎ^２＋複合体（Ｍｎ−ｐｅｐ−Ｐｉ）：３ｍＭ（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ）（配列番号１）、１ｍＭＭｎＣｌ_２、２５ｍＭオルトリン酸塩（Ｐｉ）緩衝液（ｐＨ７．４）で処理されたまたは処理されない照射バクテリオファージλから、ＤＮＡを調製した。指示ガンマ線線量（０〜４０ｋＧｙ）で、ＤＮＡ（４８．５ｋｂｐゲノム）をバクテリオファージλから精製し、慣用的アガロースゲル電気泳動に付して、次に、放射能標識λＤＮＡプローブでサザンブロッティングに付した。図５Ａに示したように、Ｍｎ^２＋複合体は、ウイルス中に包装されたＤＮＡを有意に防護しない。

図５Ａで調べたものと同じバクテリオファージλ調製物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ウイルスタンパク質を分離することにより、タンパク質完全性に関して試験した。図５Ｂに示したように、Ｍｎ^２＋複合体の非存在下で照射されたウイルス中のタンパク質は、漸進的に破壊された。これに対比して、Ｍｎ^２＋複合体を含有するウイルス試料中のタンパク質は、４０ｋＧｙという高い線量により影響を及ぼされなかった。

ウイルスＤＮＡを消失させ（図５Ａ参照）、ウイルスを完全に非感染性にさせる線量である４０，０００Ｇｙで、ウイルスタンパク質は依然として十分に免疫原性であった。これはウエスタン分析により試験したが、これにより、λタンパク質は、非照射λファージに対してウサギにおいて産生された抗体で攻撃誘発された。Ｍｎ^２＋複合体の存在下で、４０，０００Ｇｙに曝露されたλファージに対して産生された抗体でプローブされた等価ウエスタンに関して、免疫原性に関する同一の陽性結果を得た。これに対比して、Ｍｎ^２＋複合体の非存在下で、４０，０００Ｇｙに曝露されたλファージは、ネイティブバクテリオファージλに関する有意の特異性を有するウサギにおいて抗体を生じなかった。

当該アプローチを、病原性黄色ブドウ球菌株に関しても首尾よく試験した（図６）。これに対比して、Ｍｎ^２＋複合体を伴わずに超致死線量のＩＲに曝露されたウイルスおよび細菌は、ウイルスエピトープ完全性の実質的損失および免疫原性の損失を生じた。

種々の具体的な物質、手法および実例を参照することにより本発明を記載し、例証してきたが、本発明は、その目的のために選択される物質および手法の特定の組合せに制限されるわけではない、と理解される。当業者に理解されるように、このような詳細の多数の変更が暗示され得る。当該明細書および実施例は単に例示とみなされるべきものであって、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲に示されている。本出願中で言及される参考文献、特許および特許出願はすべて、その記載内容が参照により本明細書中で援用される。

Claims

微生物に対するワクチンの生産方法であって、以下の：
ａ）放射線防護用組成物の存在下で微生物を培養し、回収しおよび／または懸濁すること、ここで、前記組成物は、マンガン、オルトリン酸塩および２５残基以下のアミノ酸を有する少なくとも１つのペプチドを含み、前記ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む；
ｂ）微生物を複製不能にさせるのに十分な放射線の線量で微生物を照射すること
を包含する方法。
前記放射線が、紫外線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、Ｘ線および中性子線からなる群から選択される請求項１記載の方法。
前記組成物がさらに、アデノシン、ウリジン、β−擬似ウリジン、イノシンおよびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む請求項１または２記載の方法。
前記少なくとも１つのヌクレオシドがアデノシンおよびウリジンである請求項３記載の方法。
前記少なくとも１つのヌクレオシドの濃度が０．９ｍＭ〜１６．５ｍＭである請求項４記載の方法。
マンガンの濃度が０．９ｍＭ〜１３．７５ｍＭである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
マンガンが、ＭｎＣｌ_２およびリン酸マンガンからなる群から選択される請求項６記載の方法。
前記組成物がさらに、アラニン、バリンおよびロイシンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物がさらに、デイノコッカス・ラディオデュランス（D. radiodurans）溶解物の限外濾過物を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記放射線線量が１８〜２２ｋＧｙである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物が細菌である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物がウイルスである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
培養中の細菌を電離放射線（ＩＲ）に耐性にさせる方法であって、放射線防護用組成物の存在下で細菌を培養すること、ここで、前記組成物は、少なくとも１つのヌクレオシド、マンガン、オルトリン酸塩、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および２５残基以下のアミノ酸を有する少なくとも１つのペプチドを含み、前記ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、を包含する方法。
前記少なくとも１つのヌクレオシドが、アデノシン、ウリジン、β−擬似ウリジン、イノシンおよびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１３記載の方法。
前記少なくとも１つのヌクレオシドがアデノシンおよびウリジンである請求項１３または１４に記載の方法。
前記少なくとも１つのヌクレオシドの濃度が０．９ｍＭ〜１６．５ｍＭである請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
マンガンの濃度が０．９ｍＭ〜１３．７５ｍＭである請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
マンガンが、ＭｎＣｌ_２およびリン酸マンガンからなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
前記組成物がさらに、アラニン、バリンおよびロイシンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物がさらに、デイノコッカス・ラディオデュランス（D. radiodurans）溶解物の限外濾過物を含む請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
前記細菌が大腸菌である請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。