CN102526712B

CN102526712B - Sod-tat融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用

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Publication number: CN102526712B
Application number: CN201210007101.2A
Authority: CN
Inventors: 潘剑茹; 刘树滔; 饶平凡; 郑光进
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102526712A

Abstract

本发明涉及融合蛋白领域，更具体地涉及一种SOD-TAT融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用。所述SOD-TAT融合蛋白的制备方法为：采用基因重组技术，根据Genbank中人铜锌超氧化物歧化酶的基因序列，将跨膜肽TAT融合到SOD的C端，形成一个新蛋白SOD-TAT，构建融合SOD和TAT的表达质粒，在毕赤酵母中得到高效表达，最后通过离子交换从毕赤酵母的发酵液中提取高纯度的SOD-TAT融合蛋白；所述SOD-TAT融合蛋白用于制备防治放射损伤药物。SOD-TAT不仅可消除细胞外的自由基，还可消除细胞内的自由基，此外，SOD-TAT还可以跨越血脑屏障，其放射防护效果的深度和广度远远强于现有临床使用的放射防护剂。

Description

SOD-TAT融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白领域，更具体地涉及一种SOD-TAT融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，癌症与心脑血管疾病和意外事故一起，构成当今世界所有国家三大死亡原因。据世界卫生组织((WHO)和美国临床肿瘤协会(ASCO)统计，每年全球总计约有1000多万人患上癌症，大约760万人死于各种类型的癌症。

放射治疗是杀灭肿瘤的行之有效的手段，承担着2/3肿瘤病人的治疗。但因放疗产生的自由基引起的辐射损伤副作用大，严重削弱了机体局部和整体的抵抗力，患者往往会因为这些副作用的发生而被迫中断放疗。所以肿瘤放疗副作用的防治将直接影响着放疗能否持续，是决定最终能否彻底根治肿瘤的主要因素之一，日益受到人们的关注和重视。此外，随着核技术在军用和民用领域的广泛应用，使得各国各种核与辐射事故时有发生，例如2011年3月份由地震引发的日本福岛核电站事故以及1986年4月苏联乌克兰加盟共和国切尔诺贝利核电站事故等，军队的核武器作业人员、核潜艇乘员，医疗与工业用放射源的操作人员等时刻都有受到核辐射威胁的可能，一旦发生核事故，就可能造成急性放射病。

放射通过细胞内外水分子均裂直接产生的活性氧自由基和通过诱发巨噬细胞呼吸爆发等作用间接产生的活性氧自由基，使组织细胞的氧化还原平衡破坏，产生氧化胁迫，直接损伤蛋白质、核酸、脂质等生物大分子，或扰乱细胞的信号传导途径，对组织细胞造成可逆或不可逆的损伤。虽然自由基的寿命极短（平均10^-5s），但由于自由基的链式反应的存在，使得自由基在相互转换过程中，细胞和机体的自由基和自由基反应以及自由基反应的有害产物，在较长时间内保持高水平，而这些自由基会随着血液和淋巴液的循环而遍布周身，对局部肿瘤以外的其它正常组织和器官造成损伤。从而产生了一系列的临床放疗副作用^[1-3]。

截至目前，在现有的抗氧化型放射防护剂中，已经应用于临床的放射防护剂有阿米福汀和超氧化物歧化酶（SOD）。阿米福汀又名WR-2721，是人工合成的巯基类合成物，99年被批准用于头颈癌放疗引起的口干，但其价格昂贵，国产注射液每支（0.4 mg）售价高，且具有较大的毒性，会使大部分患者出现头晕、恶心、呕吐、等不良反应^[4]。SOD是一种十分重要的胞内酶，它能催化体内不同来源的超氧阴离子（O₂ ^-）生成氧气（O₂）和过氧化氢（H₂O₂），过氧化氢可在过氧化物酶或过氧化氢酶的作用下进一步生成水（H₂O）和氧气，有保护生化系统免受超氧阴离子自由基毒性的作用^[5]。早在70年代中期，人们就发现了Cu, Zn-SOD的防辐射作用^[6]，但SOD在体内的半衰期较短，一般只有7-10分钟^[5]，这大大影响了SOD的药用效果。

目前，国内外主要采取的方法包括对SOD分子进行修饰，如对SOD氨基酸残基进行化学修饰、用水溶性的大分子（如聚乙二醇^[7]，牛血清白蛋白^[8]等）对SOD进行共价修饰，构建SOD脂质体等^[9]。经修饰的SOD虽然能延长其在血液中的半衰期，但由于超氧自由基产于组织中、细胞内，仅仅提高SOD在血中的水平只能去除部分自由基，仍属于治标不治本。此外，Epperly等证明气管内注射Mn-SOD 质粒-脂质体和Mn-SOD腺病毒基因治疗可以减弱肺损伤、提高小鼠生存率^[10–12]。Rabbani和康等也证明,过表达EC-SOD的转基因小鼠似乎可防止放射引起的慢性肺损伤^[13,14]。但这些方法都无法应用到人类身上。

在药物治疗的研究过程中，人们发现某些药物之所以没有达到疗效，并不是药物没有治疗的效果，而是药物根本就没有到达其作用组织或细胞靶位。由于组织和细胞的选择透过性，药物不能通过细胞膜到达细胞内的作用部位与目标分子相结合，从而丧失疗效。

既然自由基是由于水分子的电离辐射和巨噬细胞呼吸爆发等作用产生的，不仅存在于细胞外，细胞内的量也不少，只清除细胞外的自由基，自然无法根治放射损伤。因此，SOD虽是人所尽知的自由基清除剂，但受其大小及其它特性的严格限制，无法透过细胞膜，无论采取现有的口服还是注射的给药方式，都很难被非破坏性地导入活细胞中，无论如何修饰，用量多大，其放射防护效应都达不到人们的期望值。

Tat (trans-activator transcription)蛋白转导域（Protein transduction domain，PTD）的发现，带来了设想成真的曙光。Tat的核心序列由YGRKKRRQRRR 11个氨基酸组成。这11个氨基酸组成的TAT跨膜肽不但自身可以跨膜进入细胞而且能把与它通过化学法交联或基因工程法融合的其它超过50种的蛋白和其它外源药物带入细胞，甚至可以穿越血脑屏障，进入脑组织，更为重要的是很多的外源高分子蛋白仍然保持其生物活性^[15] 。

我们采用基因重组技术，根据Genbank中人铜锌超氧化物歧化酶（hCu, Zn-SOD）的基因序列，构建了融合SOD和TAT的表达质粒，并在毕赤酵母中得到高效表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种SOD-TAT融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用，以弥补单纯SOD的不足。

本发明采取的技术方案如下：

本发明所述SOD-TAT融合蛋白的制备方法为：采用基因重组技术，根据Genbank中人铜锌超氧化物歧化酶的基因序列，将跨膜肽TAT融合SOD的C端，形成一个新蛋白SOD-TAT，构建融合SOD和TAT的表达质粒，在毕赤酵母中得到高效表达，最后从毕赤酵母的发酵液中提取SOD-TAT融合蛋白；所述SOD-TAT融合蛋白用于制备防治放射损伤药物。

所述SOD-TAT融合蛋白的使用浓度为2000-8000 U/ml；将无菌过滤过的SOD-TAT融合蛋白以无菌的PBS或生理盐水稀释至使用浓度。所述药物的给用方式为注射或口服。

使用方法为放射前3h进行肌肉注射或静脉注射。

本发明的创新点：

（1）本发明证实SOD-TAT可使大分子量的SOD跨膜深入细胞内部，彻底消除细胞内、外的自由基，既治标又治本。

（2）本发明证实SOD-TAT不仅能跨膜深入细胞内部，还能跨越血脑屏障，到达脑组织。

本发明药物的具体用途：

（1）可用于预防或减弱癌症患者因放疗引起的副作用，如放射性肺损伤、放射性造血系统损伤以及放射性肝损伤等。

（2）可用于医疗与工业用放射源的操作人员等日常预防放射损伤，例如检修核工业设备时和抢救辐射事故病人。

（3）可用于宇航人员预防太空的宇宙射线伤害。

本发明药物的药理作用：

本发明通过基因工程技术，使人源的SOD的C端连接上一段具有跨膜功能的短肽TAT，形成SOD-TAT融合蛋白，TAT使SOD可跨膜进入细胞，因此，SOD-TAT不仅可消除细胞外的自由基，还可消除细胞内的自由基，此外，SOD-TAT还可以跨越血脑屏障，其放射防护效果的深度和广度远远强于现有临床使用的放射防护剂。

附图说明

图1 SOD-TAT对L-02细胞克隆形成能力的保护效果；

图2 SOD-TAT对受照鼠体重增长率的保护效果；

图3 SOD-TAT对受照鼠肺羟脯氨酸含量的影响；与正常组相比，^## P < 0.01；与放射对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。

具体实施方式

实施例1：对正常细胞的放射防护作用

（一）、SOD-TAT对L-02细胞克隆形成能力的保护效果

1、细胞株

人正常肝细胞L-02细胞株，购自中科院上海细胞所。

2、操作

取对数生长期细胞，消化，制备细胞悬液，细胞分散充分，使单个细胞百分率大于90%；准确计数好后用含10% 血清的细胞培养液充分混匀，分装到规格相同的培养瓶，正常组未给药未放射，其他各组均用2 Gy X射线进行照射，放射对照组放射前未给药，SOD-TAT（构建融合SOD和TAT的表达质粒，在毕赤酵母中得到高效表达，最后通过离子交换从毕赤酵母的发酵液中提取高纯度的SOD-TAT融合蛋白）作用组放射前3 h分别加入SOD-TAT，天然SOD组放射前3 h分别加入天然SOD，阿米福汀组放射前0.5 h加入阿米福汀，使之终浓度为4 μg/ml阿米福汀，细胞与直线加速器源物距为1m，单次放射。照射后准确分装到直径3cm小培养皿中，每个小培养皿细胞悬液量为4 ml，每个剂量点设三个平行。小培养皿放在大培养皿中置于37 ℃含5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养14d。取出小培养皿，倒掉上清，将其倒扣在滤纸上，晾干，加甲醇固定10 min，弃固定液，加适量吉姆萨染料溶液铺满染色5 min，倒掉染料液，用镊子夹住小培养皿在自来水中轻轻地充分清洗一次，弃尽自来水后倒扣在滤纸上晾干。肉眼计数细胞数大于50个的集落数。

克隆接种率PE(plating efficiency)=(正常组克隆数/接种细胞数)×100%。存活分数(surviving fraction ，SF)=处理后克隆数/(接种细胞数×PE) ×100%。

3、统计分析：采用excel 2003中的Student's t-检验。

4、结果

由图1 可以看出，天然SOD给药剂量在2000 U/ml以上才开始对受照L-02细胞的克隆形成能力有保护作用，其最高可使受照L-02细胞的克隆形成能力提高33.3%，现有临床用药阿米福汀使受照L-02细胞的克隆形成能力提高42.6%，SOD-TAT给药剂量在250 U/ml的低剂量就对受照L-02细胞的克隆形成能力有保护作用，预给药4000、6000和8000 U/ml SOD-TAT可使受照L-02细胞的克隆形成能力分别提高55.6%，63.3%和63.3%，其保护效果比阿米福汀好的多。

实施例2：对胸腔放射小鼠放射性肺损伤的防护作用

1实验动物

雄性C57BL/6小鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司繁殖，清洁级。体重为18-21 g。自由饮水和进食，饲料为专用辐照料。定时排风。照射前饲养三天无异常。实验动物质量合格证号为SCXK(沪)2007-0005，动物实验条件合格证号为SYXK（军）2007-031。

2、照射条件和实验分组

将试验用C57BL/6小鼠随机分为4组：正常对照组（未给药未放射）、放射对照组（只放射未给药）、阿米福汀组（150 mg/kg）（放射前30 min注射）、SOD-TAT组（6000 U/ml）（放射前3 h注射）。X射线6 MeV（IEC 61217）胸腔一次性照射，剂量率300 mU/min，12 Gy，源皮距为100 cm。照射后普通喂养5 m。

3、检测指标

3.1小鼠体重变化

小鼠放射前称一次原始体重，放射后，每个月称一次小鼠体重，计算体重增长率。

3.2肺纤维化程度（羟脯氨酸含量）

用颈椎脱臼法处置小鼠，称重后，摘取小鼠的左肺，以生理盐水制成10%匀浆，用用南京建成的试剂盒测定羟脯氨酸含量。

3.3 肺抗氧化指标分析

处置动物后，取右肺，以生理盐水制成10%匀浆，用南京建成的试剂盒测定SOD、GSH、T-AOC和总蛋白。

4、统计分析：采用excel 2003中的Student's t-检验。

5、结果

由图2可以看出，与正常对照组相比，放射对照组小鼠体重的月增长率降低。与放射对照组相比，预给药阿米福汀使受照鼠体重的月增长率基本无保护作用，预给药SOD-TAT则可提高受照鼠体重的月增长率。

由图3可以看出，与正常对照组相比，放射对照组小鼠肺羟脯氨酸含量显著上升，与放射对照组相比，预给药阿米福汀使受照鼠的肺羟脯氨酸含量降低了17.00%（P<0.05），预给药SOD-TAT使受照鼠的肺羟脯氨酸含量降低了20.08% （P<0.01）。

表 1 SOD-TAT对受照鼠肺抗氧化体系的保护效果

与正常组相比，^# P < 0.05，^## P < 0.01；与放射对照组相比，*P < 0.05, **P < 0.01.

由表1可以看出，与正常对照组相比，放射对照组小鼠经12 Gy放射后肺SOD、GSH-Px和T-AOC活力均显著下降。与放射对照组相比，预给药阿米福汀使受照鼠SOD、GSH-Px和T-AOC活力分别提高了16.45% （P<0.01）、10.33%（无显著性）和10.19%（P<0.05）；预给药SOD-TAT可使受照鼠三个指标分别提高33.77%（P<0.01）、23.01%（P<0.01）和13.81%（P<0.05）。

参考文献

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Claims

1.SOD-TAT融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用，其特征在于：所述SOD-TAT融合蛋白的制备方法为：采用基因重组技术，根据Genbank中人铜锌超氧化物歧化酶的基因序列，将跨膜肽TAT融合SOD的C端，形成一个新蛋白SOD-TAT，构建融合SOD和TAT的表达质粒，在毕赤酵母中得到高效表达，最后从毕赤酵母的发酵液中提取SOD-TAT融合蛋白；所述SOD-TAT融合蛋白用于制备防治放射损伤药物；SOD-TAT融合蛋白的使用浓度为2000-8000 U/ml；将无菌过滤过的SOD-TAT融合蛋白以无菌的PBS或生理盐水稀释至使用浓度。

2.根据权利要求1所述的SOD-TAT融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用，其特征在于：所述药物的给用方式为注射或口服。