JP6400638B2 - タンパク質の機能を保存する方法及びタンパク質の保管方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許仮出願第60/935,494号明細書(2007年8月16日に出願)の優先権を主張し、その全体を援用する。
本発明は、米国エネルギー省、科学局、生物環境修復研究所(BER)、環境修復科学プログラムからの助成DE−FG02−04ER63918及び空軍科学研究局からの助成FA9559−07−1−0128によって資金提供された研究から一部なされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
極めて放射線耐性なデイノコックス科は、電離放射線(IR)(10kGy)、紫外線(UV)(1kJ/m2)及び乾燥(数年)への急性曝露に対して生き延びることができ、慢性IR(60Gy/時)の下で増殖できる、20種を越える様々な種から成り立つ。特に、デイノコックス・ラジオデュランスは、哺乳類細胞にとって細胞毒性で致命的な線量の1000倍を超えるγ線への曝露に対して生き延びることができる、極めて電離放射線(IR)耐性な細菌である。
本発明は、1種又は複数のプリンヌクレオシド及び1種又は複数の抗酸化物質を含有する組成物を用いた放射線防護の方法を提供する。これらの方法は、放射線の損傷効果からインビトロ及びインビボでタンパク質を保護するのに適している。
本発明者らは、D.ラジオデュランスのラジオ耐性を研究し、放射線防護特性を示す、超精製された、タンパク質を含まない、細胞抽出物を調製した。したがって、本発明は、D.ラジオデュランス細胞を含まない抽出物の放射線防護成分の発見とそのような成分を含有する人工組成物に一部基づく。
本発明は、1種又は複数のプリンヌクレオシド及び1種又は複数の抗酸化物質を含む組成物とタンパク質を接触させることによってタンパク質の機能を保存する方法を提供する。本発明の1つの実施形態は、例えば、γ線などの放射線の極限条件にタンパク質を曝露する場合、タンパク質の機能を保存する方法である。本発明の別の実施形態において、方法は、乾燥の間タンパク質の機能を保存する。
本発明はまた、放射線被曝の作用を治療又は予防する方法を提供する。方法は、1種又は複数のプリンヌクレオシド及び1種又は複数の抗酸化物質を含む治療剤で放射線被曝の作用を治療又は予防することを含む。
本発明の1つの実施形態は、放射線防護特性を示す、D.ラジオデュランスの細胞を含まない抽出物を調製する方法である。1つの実施形態において、方法は、例えば、遠心分離によりD.ラジオデュランスを採取し、D.ラジオデュランス培養を溶解して溶解物を作成し、D.ラジオデュランス溶解物を洗浄した後、上清溶液を作成するのに十分な時間と条件下で溶解物を遠心分離にかけるステップを有する。遠心分離後、上清溶液を、マイクロフィルター、好ましくは、3キロダルトンのマイクロフィルターに通して、適切な時間の期間煮沸する。1つの実施形態において、上清溶液は濾過の後約15から約45分間煮沸する。得たD.ラジオデュランス抽出物は、1種又は複数のプリンヌクレオシド及び1種又は複数の抗酸化物質を含有し、ブタノールに可溶で、煮沸に耐性があり、細胞を含まない。
D.ラジオデュランス由来のタンパク質を含まない抽出物の調製。D.ラジオデュランス(ATTC BAA−816)をTGYでOD600 0.9に培養し、遠心分離によって採取し、フレンチプレス処理によって溶解した。細胞を洗浄し、次いで、2回蒸留した脱イオン滅菌水(dH2O)に溶解した。溶解の前に、細胞密度をdH2Oで調整して、約50%の細胞内濃度を表わす溶解物を得た。粗細胞抽出物を20時間175,000×gで遠心分離にかけた。上清溶液を<3キロダルトンのマイクロコン遠心濾過機(Millrpore、USA)に通して、30分間煮沸した。クーマシー(Bradford)タンパク質試験を使用して、超精製された抽出物にタンパク質が実質的に存在しないことを確認し、抽出物を等分に小分けして−80℃で保管した。
D.ラジオデュランス由来のタンパク質を含まない抽出物の分析。D.ラジオデュランス抽出物をTOF MS及びクロマトグラフィーを用いて分析した。これらの技法を用いて、抽出物が、限定するわけではないが、ロイシン、アデニン、ウリジン及びアデノシンを含む、様々な化合物を含有することがわかった。先の分析は、これらの抽出物がまたマンガンを含有することを示した。アミノ酸、ロイシン、アラニン及びバリンが、放射線感受性細菌(データ示さず)と比較して、D.ラジオデュランス及びD.ゲオテルマリスで非常に高い。
哺乳動物細胞における放射線防護効果。ATCC(hFOB)からのヒト胎児骨芽1.19細胞株のアポトーシスをフローサイトメトリー試験を用いて、死及びアポトーシスマーカー(アネキシンV及びヨウ化プロピジウムPI)によって測定した。つまり、hFOB細胞を、10%ウシ胎児血清を有するDMEM−F12、2.5mMのL−グルタミン及び1%の抗生物質中で最高密集度まで培養した後、実験群をアデノシン(10mM)又はMnCl2(0.25m)M又はアデノシン及びMnCl2でIR前3時間から開始して6日間処理した。アポトーシス細胞死をアネキシンV及びPIでフローサイトメトリーによってIRの後6日で染色して、測定した。hFOB細胞もまた、IR後クローン生存試験のため接種した(1×103/ウェル、6−ウェルプレート)。コロニーを10日後に数えた。試験の結果を以下の表1に示す。
Claims (29)
- タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液を含む組成物とタンパク質を接触させることを含む、放射線に曝露されている間タンパク質の機能を保存する方法であって、
前記D.ラジオデュランス溶解物が3キロダルトンより大きい分子量を有する分子を含まない、方法(ヒトの体内においてタンパク質の機能を保存する方法を除く)。 - 前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が、アデノシン、ウリジン、β−プソイドウリジン、イノシン及びそれらの混合物からなる群から選択される1種又は複数のヌクレオシドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1種又は複数のヌクレオシドの濃度が、0.9から16.5mMのアデノシン及び/又はウリジンを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が、アラニン、バリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項1に記載の方法。
- マンガン、MnCl2及びリン酸マンガンからなる群から選択される1種又は複数の抗酸化物質をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1種又は複数の抗酸化物質の濃度が、0.9から13.75mMのマンガンを含む、
請求項5に記載の方法。 - D.ラジオデュランス培養物を遠心分離によって採取するステップ;
D.ラジオデュランス培養物を水に溶解してD.ラジオデュランス溶解物を作成するステップ;
D.ラジオデュランス溶解物を洗浄するステップ;
上清溶液を作成するのに十分な時間及び条件下でD.ラジオデュランス溶解物を遠心分離するステップ;
3キロダルトン未満のフィルターに上清溶液を通すステップ;及び
上清溶液を13.5から49.5分間煮沸するステップ
を含む方法によって、前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が生成され、
前記タンパク質を含まない、D.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液は、煮沸に耐性であり、細胞を含まない、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記放射線が、紫外線、α線、β線、γ線、X線及び中性子線からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 機能を保存する対象となる前記タンパク質が酵素である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 機能を保存する対象となる前記タンパク質の3次元形態を保存する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液を含む組成物とタンパク質を接触させることを含む、放射線に曝露されている間タンパク質の保管方法であって、
前記D.ラジオデュランス溶解物が3キロダルトンより大きい分子量を有する分子を含まない、方法。 - 前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が、アデノシン、ウリジン、β−プソイドウリジン、イノシン及びそれらの混合物からなる群から選択される1種又は複数のヌクレオシドを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記1種又は複数のヌクレオシドの濃度が、0.9から16.5mMのアデノシン及び/又はウリジンを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が、アラニン、バリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項11に記載の方法。
- マンガン、MnCl2及びリン酸マンガンからなる群から選択される1種又は複数の抗酸化物質をさらに含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1種又は複数の抗酸化物質の濃度が、0.9から13.75mMのマンガンを含む、
請求項15に記載の方法。 - D.ラジオデュランス培養物を遠心分離によって採取するステップ;
D.ラジオデュランス培養物を水に溶解してD.ラジオデュランス溶解物を作成するステップ;
D.ラジオデュランス溶解物を洗浄するステップ;
上清溶液を作成するのに十分な時間及び条件下でD.ラジオデュランス溶解物を遠心分離するステップ;
3キロダルトン未満のフィルターに上清溶液を通すステップ;及び
上清溶液を13.5から49.5分間煮沸するステップ
を含む方法によって、前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が生成され、
前記タンパク質を含まない、D.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液は、煮沸に耐性であり、細胞を含まない、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記放射線が、紫外線、α線、β線、γ線、X線及び中性子線からなる群から選択される、請求項11〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 保管する対象となる前記タンパク質が酵素である、請求項11〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 保管する対象となる前記タンパク質の3次元形態を保存する、請求項11〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線に曝露されている間タンパク質の機能を保存するための組成物であって、
前記組成物が、タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液を含み、
前記D.ラジオデュランス溶解物が3キロダルトンより大きい分子量を有する分子を含まない、組成物。 - 前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が、アデノシン、ウリジン、β−プソイドウリジン、イノシン及びそれらの混合物からなる群から選択される1種又は複数のヌクレオシドを含む、請求項21に記載の組成物。
- 前記1種又は複数のヌクレオシドの濃度が、0.9から16.5mMのアデノシン及び/又はウリジンを含む、請求項22に記載の組成物。
- 前記タンパク質を含まないD.ラジオデュランス溶解物の水性の限外濾過液が、アラニン、バリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項21に記載の組成物。
- マンガン、MnCl2及びリン酸マンガンからなる群から選択される1種又は複数の抗酸化物質をさらに含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1種又は複数の抗酸化物質の濃度が、0.9から13.75mMのマンガンを含む、
請求項25に記載の組成物。 - 前記放射線が、紫外線、α線、β線、γ線、X線及び中性子線からなる群から選択される、請求項21〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- 機能を保存する対象となる前記タンパク質が酵素である、請求項21〜27のいずれか一項に記載の組成物。
- 機能を保存する対象となる前記タンパク質の3次元形態を保存する、請求項21〜28のいずれか一項に記載の組成物。
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