JP7028778B2 - HbA1cの測定法 - Google Patents
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Description
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンA1c濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンA1c濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してHbA1c%を算出する際に、第1の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、以下を満たす第2の波長で測定した結果を用いて補正する、
480nmより長波長であり、
100μmol/Lヘモグロビン生理食塩水液の480nmにおける吸光度に対して1/10以下の吸光度を与える波長であり、
脂肪粒子濃度と吸光度の間に相関関係がある波長である、
方法を提供する。
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンA1c濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンA1c濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してHbA1c%を算出する際に、450nm~610nmから選択された第1の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、690nm~900nmから選択された第2の波長で測定した結果を用いて補正する、
方法を提供する。
ヘモグロビン濃度は第一工程で光学的に測定され、
ヘモグロビンA1c濃度は第二工程で光学的に測定され、
該第二工程で測定したヘモグロビンA1c濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してHbA1c%を算出する際に、450nm~610nmから選択された第1の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、690nm~900nmから選択された第2の波長で測定した脂質粒子の濃度情報及びヘモグロビンの濃度情報を用いて補正する、
方法を提供する。
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンA1c濃度の比率(HbA1c%)の測定方法であって、
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンA1c濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンA1c濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してHbA1c%を算出する際に、第1の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、以下を満たす第2の波長で測定した結果を用いて補正する、
480nmより長波長であり、
100μmol/Lヘモグロビン生理食塩水液の480nmにおける吸光度に対して1/10以下の吸光度を与える波長であり、
脂肪粒子濃度と吸光度の間に相関関係がある波長である、
方法。
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンA1c濃度の比率(HbA1c%)の測定方法であって、
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンA1c濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンA1c濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してHbA1c%を算出する際に、450nm~610nmから選択された第1の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、690nm~900nmから選択された第2の波長で測定した結果を用いて補正する、
方法。
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンA1c濃度の比率(HbA1c%)を測定する方法であって、
ヘモグロビン濃度は第一工程で光学的に測定され、
ヘモグロビンA1c濃度は第二工程で光学的に測定され、
該第二工程で測定したヘモグロビンA1c濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してHbA1c%を算出する際に、450nm~610nmから選択された第1の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、690nm~900nmから選択された第2の波長で測定した脂質粒子の濃度情報及びヘモグロビンの濃度情報を用いて補正する、
方法。
[式A]:Xlipid=a1Ylipid-b1(a1は傾き、b1は切片である)
[式B]:補正されたヘモグロビン濃度=みかけのヘモグロビン濃度-偽高値化分ヘモグロビン濃度=みかけのヘモグロビン濃度-(a1Ylipid-b1)
HbA1c%(NGSP%)=HbA1c濃度/補正されたヘモグロビン濃度*91.5+2.15
[式C]:YHb=a2XHb-b2(a2は傾き、b2は切片である)
この関係式により、試料のヘモグロビン濃度に依存した第2の波長による吸光度の変化分が求められる。
[式D]:補正された脂肪粒子の吸光度Ylipid offset=第2の波長による試料の吸光度-第2の波長におけるヘモグロビン濃度に依存した吸光度の変化分=第2の波長における試料の吸光度-YHb
[式E]:偽高値化分ヘモグロビン濃度2:Xlipid-2=補正された脂肪粒子の吸光度Ylipid offset *a1=(第2の波長における試料の吸光度-XHb*a2)*a1
ここで[式A]における切片b1は、[式E]中の「-XHb*a2*a1」で表されるヘモグロビン濃度によって変動する数値であることが理解される。
[式F]補正されたヘモグロビン濃度2=みかけのヘモグロビン濃度-偽高値化分ヘモグロビン濃度2:Xlipid-2=みかけのヘモグロビン濃度-(第2の波長における試料の吸光度-XHb*a2)*a1
HbA1c%(NGSP%)=HbA1c濃度/補正されたヘモグロビン濃度2*91.5+2.15
脂肪乳剤のHbA1c%に与える影響を確認した。
(1)試料:EDTA採血した全血をプールして使用した。以下、プール全血ということがある。
(2)測定試薬とキャリブレータ:
<前処理液>
10mM 亜硝酸ナトリウム
<プロテアーゼ含有基質試薬(R1)>
以下の成分を含む50mM
リン酸ナトリウム緩衝液 pH7.0
1.5% アンヒトール20BS(花王社)
2.0 mg/mL プロチンPC10F(大和化成工業社)
0.01% アジ化ナトリウム(キシダ化学社製)
50μM DA-67(10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業社)
<発色試薬(R2)>
以下の成分を含む50mM
リン酸ナトリウム緩衝液 pH7.0
10U/mL フルクトシルペプチドオキシダーゼ(キッコーマン社)
1U/mL パーオキシダーゼ(東洋紡社)
<キャリブレータ>
ノルディアNHbA1cキャリブレータ(積水メディカル社)を使用した。
(3)脂肪乳剤:イントラリピッド(フレゼニウス カービ社)を使用した。
(1)試験試料の調製:プール全血に対して表1の終濃度になるようイントラリピッドを添加し、試験試料を調製した。
(2)試験試料の測定:自動分析装置JCA-BM9130(日本電子社)を用い、以下の測定パラメータにより試験試料を測定し、HbA1c%を測定した。
また、各試験試料毎に、ヘモグロビン濃度測定、ヘモグロビンA1c濃度測定における反応タイムコースを確認した。
[HbA1c,Hb]
分析方法:EPA
計算方法:MSTD
測定波長(副/主):HbA1c 805/658、Hb 805/478
主DET.Pl-P.m-P.n:HbA1c 0-95-98、Hb 0-44-47
副DET.P.p-P.r:HbA1c 44-47、Hb 0-0
反応時間:10分
血球測定時:
希釈検体量(全血量):4.0μL
希釈液量(希釈液):110μL
キャリブレータ測定時:
希釈検体量(キャリブレータ):25μL
希釈液量(希釈液):15μL
反応検体量(Sample量):6.4μL
第1試薬量(R1):60μL、第2試薬量:0μL、
第3試薬量(R2):20μL、第4試薬量:0μL
(1)各測定値の変動
試験試料中のイントラリピッドの濃度に依存したヘモグロビン濃度測定値の増加とHbA1c%の低下が確認された。その一方、HbA1c濃度測定値は、ほぼ一定であった(以上、表1)。以上より、HbA1c%の低下は、HbA1c%算出の際の分母となるヘモグロビン濃度測定値の増加に起因すると考えられた。
各試験試料毎のヘモグロビン濃度測定、HbA1c濃度測定における反応タイムコースを図1に示した。全ての試験試料について、ヘモグロビン濃度測定(図1左)及びHbA1c濃度測定(図1右)における、イントラリピッドの濃度に依存した吸光度の増加が確認された。本参考例で使用した自動分析装置JCA-BM9130のような一般的な自動分析装置によるヘモグロビン濃度測定では、検出された吸光度それ自体がヘモグロビン濃度の算出に用いられる。そのため、本試験では、イントラリピッドに由来する吸光度の増加がそのままヘモグロビンの吸光度に上乗せされた結果、表1のようにヘモグロビン濃度測定値が偽高値化したものと推定された。一方、本参考例で使用した自動分析装置によるHbA1c濃度測定では、HbA1c濃度の算出に用いる吸光度として発色試薬添加直前の主波長や副波長での測定値による補正が行われた吸光度を用いるため、発色試薬の発色による吸光度の増加分のみがHbA1c濃度の算出に用いられる。そのため本試験でのHbA1c濃度測定では、ヘモグロビン濃度測定のような偽高値化が観察されなかったものと推定された。
試験試料の吸収スペクトル解析(図2)の結果、ヘモグロビン及び発色試薬の発色時における吸収が少なく、かつイントラリピッドの濃度と相関する吸収波長として約690nm~約900nmの範囲の波長が見出された。この中から884nmを選択し、表1で観察されたようなイントラリピッドに由来するヘモグロビン濃度の偽高値化との相関関係を確認した。
884nmにおけるイントラリピッドの吸光度を(X)とし、表1のイントラリピッド各濃度の478nmにおけるヘモグロビン濃度測定値と884nmにおけるイントラリピッド無添加試験試料のヘモグロビン濃度測定値の差を偽高値化によるヘモグロビン濃度上昇分(偽高値化分ヘモグロビン濃度:Y)とし、両者の相関係数(R2)及び回帰式(Y=aX-b)を求めた。
相関係数:R2=0.9836で、回帰式:Y=1427.6X-4.7512[式A1]が得られ、偽高値化分ヘモグロビン濃度がイントラリピッドに起因することが確認された(図3)。
884nmでの測定により得られた偽高値化分ヘモグロビン濃度の回帰式を利用して、ヘモグロビン濃度の補正を検討した。
参考例2で得られた回帰式[式A1]より[式B1]を導き、[式B1]により478nmでのヘモグロビン濃度測定値(みかけのヘモグロビン濃度)の補正を行い、補正後のヘモグロビン濃度を用いてHbA1c%を算出した。
[式B1]
補正後のヘモグロビン濃度
=みかけのヘモグロビン濃度-偽高値化分ヘモグロビン濃度
=みかけのヘモグロビン濃度-(884nmでの吸光度*1400-5)
なお、1400は回帰式の傾きを簡略化した数値であり、-5は切片を簡略化した数値である。
2.結果
[式B1]により求めた補正後のヘモグロビン濃度で算出したHbA1c%はイントラリピッド無添加の値と近似し、イントラリピッドの濃度に依存した値の低下も観察されなかった(表2)。
実施例1により、イントラリピッド添加によるヘモグロビン濃度の偽高値化を補正できることが確認されたが、イントラリピッド添加試料におけるHbA1c%の若干の低値化が認められた。これは、884nmにおけるヘモグロビンの吸収がゼロではないことが影響していると考えられたため、この影響を確認した。
(1)試料:パネル検体(洗浄血球)(積水メディカル社)3種類(レベル1、3、5)〔HbA1c値:5.0%(レベル1);8.0%(レベル3);11.8%(レベル5)〕
(2)前処理液:参考例1に記載の前処理液を使用した。
各パネル検体を前処理液で7倍及び80倍に希釈したヘモグロビン濃度調整液を調製し、両液を適宜に混合して、HbA1c%は一定でヘモグロビン濃度の異なる測定試料を各レベルについてそれぞれ11種類調製した。希釈検体量(血球量)を2.0μLとした以外は、参考例1と同様の手順を使用して測定試料のHbA1c%を測定した。ヘモグロビン濃度の補正は、実施例1と同様に[式B1]により行った。
[式B1]による補正前と補正後でHbA1c%が一致せず、ヘモグロビン濃度に依存して両者の差が拡大した(図4)。
ヘモグロビン濃度に依存した884nmでの吸光度の変動の補正を検討した。
実施例2で使用した884nmで測定した各パネル検体のヘモグロビン濃度を(x)、884nmにおける該各パネル検体の吸光度の変化分を(y)とし、両者の相関係数(R2)及び回帰式(y=ax-b)を求めた。
2.結果
相関係数:R2=0.9844で、回帰式:y=3.82*10-5x-0[式C1]が得られた。884nmにおいてヘモグロビン濃度に依存した吸光度変化が存在することが再度確認された(図5)。
ヘモグロビン濃度に依存した884nmでの吸光度変化分を利用した、478nmにおけるヘモグロビン濃度測定値の補正を検討した。
実施例3で得られた回帰式[式C1]により、ヘモグロビン濃度に依存した884nmでの吸光度の変化分を求め、これを利用して884nmにおけるイントラリポス(大塚製薬工場社)による正味のヘモグロビン濃度上昇分を求める[式D1]を導き、次いで、[式D1]を利用した計算式([式E1])により、偽高値化分ヘモグロビン濃度の補正値を算出した。これらを踏まえ、最終的に、補正ヘモグロビン濃度を求める[式F1]を導いた。
[式C1]
ヘモグロビン濃度に依存した884nmでの吸光度の変化分=ヘモグロビン濃度x3.82*10-5
[式D1]
884nmにおけるイントラリポスによる正味の吸光度上昇分=884nmの吸光度-([式C1]で得られる値)
[式E1]
偽高値化分ヘモグロビン濃度の補正値=([式D1]で得られる値)*1400
[式F1]
補正ヘモグロビン濃度
=478nmより算出されるヘモグロビン濃度-([式E1]で得られる値)
=1.055*ヘモグロビン濃度-884nm吸光度*1400
[式F1]の妥当性を確認した。
(1)試料:プール全血を使用した。
(2)測定試薬とキャリブレータ:参考例1と同様の測定試薬、キャリブレータを使用した。
(3)脂肪乳剤類:イントラリピッド、イントラリポス(大塚製薬工場社)、干渉チェックAプラス乳び(シスメックス)を使用した。
(1)試験試料の調製:プール全血に対して表3a~3cの終濃度になるよう各脂肪乳剤類を添加し、試験試料を調製した。
(2)試験試料の測定:自動分析装置JCA-BM9130(日本電子社)を用い、以下の測定パラメータにより試験試料を測定し、HbA1c%を測定した。
[HbA1c,Hb]
分析方法:EPA
計算方法:MSTD
測定波長(副/主):HbA1c 805/658、Hb 805/478
主DET.Pl-P.m-P.n:HbA1c 0-95-98、Hb 0-44-47
副DET.P.p-P.r:HbA1c 44-47、Hb 0-0
反応時間:10分
血球測定時:
希釈検体量(血球量):4.0μL
希釈液量(希釈液):110μL
キャリブレータ測定時
希釈検体量(キャリブレータ):25μL
希釈液量(希釈液):15μL
反応検体量(Sample量):6.4μL
第1試薬量(R1):60μL、第2試薬量:0μL、
第3試薬量(R2):20μL、第4試薬量:0μL
分析方法:EPA
計算方法:ABS
測定波長(副/主):Hb なし/884nm
FV=1
主DET.Pl-P.m-P.n:Hb 0-44-47
副DET.P.p-P.r:Hb 0-0
反応時間:10分
血球測定時:
希釈検体量(血球量):4.0μL
希釈液量(希釈液):110μL
キャリブレータ測定時
希釈検体量(キャリブレータ):25μL
希釈液量(希釈液):15μL
反応検体量(Sample量):6.4μL
第1試薬量(R1):60μL、第2試薬量:0μL、
第3試薬量(R2):20μL、第4試薬量:0μL
*884nmのキャリブレーションには生理食塩水を使用する。
[補正Hb]
桁数:1 定性判定:しない
X:884nm Y:Hb
項目間演算式:1.055*Y-1400*X⇒[式F1]
[NGSP%]
桁数:2 定性判定:しない
X:HbA1c Y=補正Hb
項目間演算式:X/Y*91.5+2.15
各脂肪乳剤類添加の成績を表3a~3cに示した。[式F1]を用いて補正を行った場合、脂肪乳剤類の種類によらず、HbA1c%の偽高値化を補正できることが確認された。
[式F1]が884nm波長の代わりに751nm波長を用いた場合、及びNGSP%の代わりにIFCCに基づくHbA1c%測定においても有効であることを確認した。
(1)試料:プール全血を使用した。
(2)測定試薬とキャリブレータ:参考例1と同様の測定試薬、キャリブレータを使用した。
(3)脂肪乳剤類:イントラリピッドを使用した。
(1)試験試料の調製:プール全血に対して表4a~4bの終濃度になるよう各脂肪乳剤類を添加し、試験試料を調製した。
(2)試験試料の測定:自動分析装置JCA-BM9130(日本電子社)を用い、実施例5の測定パラメータを一部変更して試験試料を測定し、HbA1c%を測定した。
なお、実施例5から変更したパラメータのみを以下に記載した。
[884nm]→[751nm]
測定波長(副/主):Hb なし/884nm→測定波長(副/主):Hb なし/751nm
[補正Hb]
桁数:1 定性判定:しない
X:751nm Y:Hb
項目間演算式:1.053*Y-896*X⇒751nm用[式F1]
[NGSP%]
桁数:2 定性判定:しない
X:HbA1c Y=補正Hb
項目間演算式:X/Y*91.5+2.15
[補正Hb]
桁数:1 定性判定:しない
X:751nm Y:Hb
項目間演算式:1.053*Y-896*X⇒751nm用[式F1]
[IFCC値]
桁数:2 定性判定:しない
X:HbA1c Y=補正Hb
項目間演算式:X/Y*1000+0
751nm用[式F1]を用いて補正を行ったところ、NGSP%の場合もIFCC値の場合も、イントラリピッドの影響を受けずにHbA1c%を算出することができた(表4a~4b)。
実検体を用い[式F1]の有効性を確認した。
(1)試料:EDTA採血した全血350例(TG値が基準範囲内であり、かつ目視で濁りを認めない)を使用した。
(2)測定試薬とキャリブレータ:参考例1と同様の測定試薬、キャリブレータを使用した。
(1)試料の測定:自動分析装置JCA-BM9130(日本電子社)を用い、実施例5に記載の測定パラメータにより試験試料を測定し、[式F1]を用いて478nmヘモグロビン濃度の補正を行い、HbA1c%を測定した。
[式F1]による補正前のHbA1c%を(x)、補正後のHbA1c%を(y)として相関性を確認した。結果、相関係数:R2=0.9999で、回帰式:y=0.993x+0.0199が得られ、実検体を測定した場合においても、本発明の方法が使用できることが確認された(図6)。
Claims (3)
- 酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンA1c濃度の比率を測定する方法であって、
前記試料が全血、全血より分離された赤血球、及び全血より分離され、さらに洗浄された赤血球から選択され、
前記ヘモグロビン濃度は第一工程で光学的に測定され、
前記ヘモグロビンA1c濃度は第二工程で550nm~750nmから選択された波長により光学的に測定され、
該第二工程で測定したヘモグロビンA1c濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してHbA1c%を算出する際に、450nm~610nmから選択された第1の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、690nm~900nmから選択された第2の波長で測定した脂質粒子の濃度情報及びヘモグロビンの濃度情報を用いて補正する、
方法。 - 補正されたヘモグロビン濃度が下記[式B]で表され、
[式B]:(補正されたヘモグロビン濃度)=(みかけのヘモグロビン濃度)-(偽高値化分ヘモグロビン濃度)
該みかけのヘモグロビン濃度は、前記第1の波長により測定したヘモグロビン濃度であり、
該偽高値化分ヘモグロビン濃度は、下記[式A]で決定されるXlipidで表され、
[式A]:Xlipid=a1*Ylipid-b1(a1は傾き、b1は切片である)
Xlipidは、前記第1の波長における吸光度より算出された、脂質粒子を含む試料のヘモグロビン濃度と脂質粒子を含まない試料のヘモグロビン濃度との差を表し、
Ylipidは、前記第2の波長における脂質粒子の吸光度を表す、
請求項1記載の方法。 - 補正されたヘモグロビン濃度が下記[式F]で表され、
[式F]:(補正されたヘモグロビン濃度)=(みかけのヘモグロビン濃度)-(偽高値化分ヘモグロビン濃度)
該みかけのヘモグロビン濃度は、前記第1の波長により測定したヘモグロビン濃度であり、
該偽高値化分ヘモグロビン濃度は、下記[式E]で決定されるXlipid-2で表され、
[式E]:Xlipid-2=(補正された脂肪粒子の吸光度Ylipid offset)*a1(a1は傾きである)
ここで、Ylipid offset=(第2の波長による試料の吸光度)-(第2の波長におけるヘモグロビン濃度に依存した吸光度の変化分YHb)
YHbは下記回帰式[式C]で決定される、
[式C]:YHb=a2*XHb-b2(a2は傾き、b2は切片、XHbは試料中のヘモグロビン濃度である)
請求項1記載の方法。
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