KR102502572B1 - HbA1c 측정법 - Google Patents

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Abstract

효소법에 의한 전혈 시료의 HbA1c 측정에서의 공존 물질의 영향을 회피하는 방법이 제공된다. 효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율 측정 방법으로서, 헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과, 헤모글로빈 A1c 농도를 광학적으로 측정하는 제2 공정을 가지며, 상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 제2 파장에서 측정한 결과를 이용하여 보정하는 방법.

Description

HbA1c 측정법
본 발명은 HbA1c 측정 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 자동 분석 장치를 이용한 HbA1c 측정 방법에 관한 것이다.
헤모글로빈 A1c(HbA1c)는 HbA0의 β쇄 N 말단이 당화된 것으로서, 헤모글로빈의 대부분을 차지하는 HbA0의 당화 산물이다. HbA1c의 헤모글로빈 전체량에 대한 존재 비율은 피험 개체에서의 채혈 시점으로부터 과거 1 내지 2개월의 평균적인 혈당값을 반영하기 때문에, 당뇨병의 혈당 조절 상태의 지표로서 임상에서의 진단, 치료법 선택에 널리 이용되고 있다.
HbA1c의 존재 비율은 NGSP %에서는 헤모글로빈 농도(μmol/L)에 대한 헤모글로빈 A1c 농도(μmol/L)의 비율(%)로서 IFCC값에서는 헤모글로빈 1mol에 대한 헤모글로빈 A1c(mmol)의 비율(mmol/mol)로서 산출된다. 이하, 본 명세서에서 산출된 HbA1c 존재 비율을 총칭하여 HbA1c %라고 하는 수가 있다. HbA1c %를 산출하기 위한 HbA1c 측정 방법으로서 HPLC법, 면역 응집법, 전기 영동법, 효소법이 보고되어 있다. 이들 중 효소법은 최근 실용화된 방법으로 임상 검사 분야에서 사용되는 자동 분석 장치에 적용 가능하며, 또한 마찬가지로 자동 분석 장치로의 적용이 가능한 면역 응집법과 비교하여 시약에 의한 자동 분석 장치(특히 반응 셀)의 오염이 적다는 장점을 가지고 있다.
HbA1c %를 측정하기 위한 시료로서 전혈에서 분리한 혈구를 사용하는 경우와 전혈을 사용하는 경우가 있는데, 효소법에 대해서는 전혈을 시료로 했을 경우의 보고는 있지만, 아직 기술 축적이 충분하지 않다.
Clin.Chem.,50(1), 166-174(2004)
본 발명자들은 효소법에서 전혈을 시료로 했을 경우에 대하여 검토를 하였는데, 시료 중의 공존 물질의 영향을 강하게 받아 오차가 발생하는 경우가 있다는 것을 경험하였다. 본 발명은 상기 사정에 비추어 이루어진 것으로, 전혈을 시료로 하는 효소법에 의한 HbA1c %의 측정에 있어서의 공존 물질의 영향을 회피하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율 (HbA1c %)의 측정 방법으로서,
헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과,
헤모글로빈 A1c 농도를 광학적으로 측정하는 제2 공정을 가지며,
상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 하기를 만족하는 제2 파장에서 측정한 결과를 이용하여 보정하는 방법을 제공한다:
480nm보다 긴 파장이며,
100μmol/L 헤모글로빈 생리식염수액의 480nm에서의 흡광도에 대해 1/10 이하의 흡광도를 부여하는 파장이며,
지방 입자 농도와 흡광도 사이에 상관 관계가 있는 파장임.
일 실시 형태에서, 본 발명은 효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율 (HbA1c %)의 측정 방법으로서,
헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과,
헤모글로빈 A1c 농도를 광학적으로 측정하는 제2 공정을 가지며,
상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 450nm 내지 610nm으로부터 선택된 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 690nm 내지 900nm으로부터 선택된 제2 파장에서 측정한 결과를 이용하여 보정하는,
방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율(HbA1c %)을 측정하는 방법으로서,
헤모글로빈 농도는 제1 공정에서 광학적으로 측정되고,
헤모글로빈 A1c 농도는 제2 공정에서 광학적으로 측정되며,
상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 450nm 내지 610nm으로부터 선택된 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 690nm 내지 900nm으로부터 선택된 제2 파장에서 측정한 지질 입자의 농도 정보 및 헤모글로빈의 농도 정보를 이용하여 보정하는,
방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 자동 분석 장치를 이용한 전혈 시료의 HbA1c 측정법에서 시료 유래 색소(예를 들어 유미에 의한 불투명함)에 기인하는 오차의 보정이 가능해진다. 또한 본 발명에 따르면, 전혈을 시료로 하여 효소법에 의해 HbA1c %를 측정할 때, 시약의 조성을 변경하지 않고 자동 분석 장치 측에서 시료 중의 공존 물질의 영향을 회피할 수 있다. 본 발명에 따르면, 전혈을 시료로 하여 효소법에 의해 HbA1c %를 측정할 때, 특수 검체(예를 들어 유미 검체)라도 정확한 HbA1c %의 측정을 용이하게 할 수 있다.
도 1은, 인트라리피드를 포함하는 시료를 효소법에 의해 측정했을 경우의 헤모글로빈 농도 측정에서의 반응 시간 코스(왼쪽 도면)와 헤모글로빈 A1c 농도 측정에서의 반응 시간 코스(오른쪽 도면)를 나타내는 도면이다.
도 2는, 인트라리피드를 포함하는 시료의 400nm 내지 900nm에서의 흡수 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 왼쪽 도면은 400nm 내지 900nm 범위의 측정 결과이며, 오른쪽 도면은 650nm 내지 900nm의 범위에 대하여 확대한 도면이다.
도 3은, 제2 파장(884nm)에서의 인트라리피드의 흡광도와 가성의 고수치화분 (僞高値化分) 헤모글로빈 농도와의 관계를 나타내는 도면이다.
도 4는, 시료의 헤모글로빈 농도와 실시예 2에서 측정된 HbA1c %와의 관계를 나타내는 도면이다. 왼쪽 도면의 X축은 헤모글로빈 농도, Y축은 HbA1c %(Y축)이며, 오른쪽 도면의 X축은 헤모글로빈 농도, Y축은 보정 전의 HbA1c에 대한 보정 후의 HbA1c %의 바이어스(보정 후-보정 전)이다.
도 5는, 제2 파장(884nm)에서의 헤모글로빈 농도와 흡광도 변화와의 관계를 나타내는 도면이다.
도 6는, 실제 검체를 이용한 본 발명의 방법에 의한 HbA1c % 측정값에 대하여 헤모글로빈 농도 보정 없음의 경우와 보정 있음의 경우와의 관계를 나타내는 도면이다. 왼쪽 도면의 X축은 보정 전의 HbA1c %, Y축은 보정 후의 HbA1c %이며, 오른쪽 도면의 X축은 보정 후의 HbA1c %, Y축은 보정 없음의 HbA1c %에 대한 보정 있음의 HbA1c %의 바이어스 (보정 있음-보정 없음)이다.
자동 분석 장치를 이용한 효소법에 의한 HbA1c %의 측정 방법은, 크게 헤모글로빈을 광학적으로 측정하는 제1 공정, HbA1c를 광학적으로 측정하는 제2 공정, 제2 공정의 측정값을 제1 공정의 측정값으로 나누는 연산 공정으로 이루어진다. 이 측정 방법을 전혈 시료로 실시하는 경우, 혈액 중의 유미 등의 공존 물질의 영향에 의한 측정 오차를 발생시킬 수 있다. 본 발명자는 그 측정 오차를 보정할 수 있는 HbA1c %의 측정 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하고, 본 발명을 설명한다.
[실시 형태 1]
효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율 (HbA1c %)의 측정 방법으로서,
헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과,
헤모글로빈 A1c 농도를 광학적으로 측정하는 제2 공정을 가지며,
상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 하기를 만족하는 제2 파장에서 측정한 결과를 이용하여 보정하는,
방법:
- 480nm보다 긴 파장이며,
- 100μmol/L 헤모글로빈 생리식염수액의 480nm에서의 흡광도에 대하여 1/10 이하의 흡광도를 부여하는 파장이며,
- 지방 입자 농도와 흡광도 사이에 상관 관계가 있는 파장임.
[실시 형태 2]
효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율 (HbA1c %)의 측정 방법으로서,
헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과,
헤모글로빈 A1c 농도를 광학적으로 측정하는 제2 공정을 가지며,
상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 450nm 내지 610nm으로부터 선택된 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 690nm 내지 900nm으로부터 선택된 제2 파장에서 측정한 결과를 이용하여 보정하는,
방법.
[실시 형태 3]
효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율 (HbA1c %)을 측정하는 방법으로서,
헤모글로빈 농도는 제1 공정에서 광학적으로 측정되고,
헤모글로빈 A1c 농도는 제2 공정에서 광학적으로 측정되며,
상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 450nm 내지 610nm으로부터 선택된 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 690nm 내지 900nm으로부터 선택된 제2 파장에서 측정한 지질 입자의 농도 정보 및 헤모글로빈의 농도 정보를 이용하여 보정하는,
방법.
본 발명에 따른 HbA1c %의 측정 방법은, 기본적으로는 시료 중의 헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과, 상기 시료 중의 HbA1c 농도를 광학적으로 측정하는 제2 공정과, 상기 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 HbA1c 농도의 비율(HbA1c %)을 산출하는 공정을 포함한다. 상기 제1 공정에서, 상기 시료의 광학적 측정은 제1 파장의 광과 제2 파장의 광을 각각 이용하여 흡광도를 측정함으로써 이루어진다. 상기 제1 파장에서 측정된 헤모글로빈 농도는 상기 제2 파장에서의 측정값을 이용하여 보정된다. 상기 보정된 헤모글로빈 농도가 상기 HbA1c % 산출 공정에서 사용된다. 즉, 상기 HbA1c % 산출 공정에서는 상기 제2 공정에서 측정된 HbA1c 농도를 상기 보정된 헤모글로빈 농도로 나눔으로써 HbA1c %를 산출한다. 본 발명의 HbA1c % 측정 방법에서는 분모가 되는 헤모글로빈 농도에 상기 보정된 헤모글로빈 농도를 이용함으로써 시료 중의 유미 등의 공존 물질에 기인하는 측정 오차를 보정하여 고정밀도로 HbA1c %가 측정된다.
자동 분석 장치의 대부분은 제1 공정의 헤모글로빈 농도의 측정 시, 시료 중의 공존 물질(유미 등)의 영향을 회피하기 위한 기구를 가지고 있지 않다. 한편, 본 발명의 방법을 각종 자동 분석 장치에 적용했을 경우, 공존 물질의 영향을 배제한 HbA1c %의 측정 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하는 "시료" 또는 "검체"로서는, 전혈, 전혈에서 분리된 적혈구, 전혈에서 분리되고, 추가로 세정된 적혈구 등을 들 수 있다. 본 발명의 방법은 혈액 중의 공존 물질(유미 등)의 영향을 회피할 수 있으므로 시료로서 전혈을 문제없이 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "유미 검체"란, 포함되는 지방 입자에 의해 유백색을 띠고 있는 검체(혈청 등)를 말한다. 식사로서 섭취되는 지방의 대부분은 중성 지방으로, 혈액 중에 흡수된 후, 리포 단백 리파아제 등의 효소에 의해 분해되고, 지방산 등으로 대사된다. 식후에 시간을 두지 않고 채혈했을 경우는, 지방이 그다지 분해되지 않고 혈액에 남아 있고, 그 지방분이 하얗게 보이기 때문에 검체가 백탁되어 보인다. 이 백탁은 지질 대사의 이상을 수반하는 개체에서 채취된 검체에서는, 식사 시간에 관계없이 현저하다. 혈액 중의 중성 지방에는 식사에서 흡수되어 혈액 속으로 들어간 것(주로 카이로미크론)과 간에서 합성된 것(주로 VLDL)이 있다. 유미 검체의 백탁 원인의 대부분은 식후 일과성으로 증가하는 카이로미크론이다.
본 명세서에서 "지방 입자"란, 임상 검사 등의 분야에서의 통상의 의미라면 좋지만, 바람직하게는 상기 유미 검체에 포함되는 지방 성분에 의해 구성된 입자(예를 들어, 카이로미크론 또는 VLDL)를 말한다. 또는 임상에서 환자의 에너지 보급을 위해 수액에 첨가되는 지방 유제(예를 들어, 인트라리피드, 인트라리포스 등)에 포함되는 대두 유래의 지질(레시틴 등)도 본 명세서에서의 지방 입자에 포함될 수 있다.
본 발명 방법의 제2 공정에서의 HbA1c 농도의 광학적 측정은 기본적으로는 지금까지 자동 분석 장치로 이루어져 온 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 제2 공정은, 이른바 발색제를 사용하여 이루어지기 때문에 사용하는 발색제에 따라 광학적 측정에서의 파장이 정해진다. 제2 공정은 헤모글로빈의 공존 하에 실시되므로 헤모글로빈의 흡수 파장과의 중복이 적은 480nm보다 긴 파장측에서 행하는 것이 바람직하다. 적합한 파장을 예시하면 550nm 내지 750nm의 파장을 들 수 있다.
본 명세서에서 "HbA1c %"란, 임상에서 일반적으로 사용되는 시료 중의 헤모글로빈 A1c 농도와 헤모글로빈 농도의 비율(%)을 의미한다. HbA1c %로서는, NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program)값으로서 정해지는 값, IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) 값으로서 정해지는 값, JDS(Japanese Diabetes Society)값으로서 정해지는 값 등이 있으며, 특별히 언급이 없는 경우, 본 명세서에서의 "HbA1c %"란, 이러한 값의 총칭을 의미한다(개개의 값의 상호 관계에 대해서는 비특허문헌 1을 참조하기 바란다). 본 발명의 방법에서의 HbA1c %의 산출은 NGSP, IFCC, JDS 등의 기준에 따라 행하면 된다.
본 발명이 적용 가능한 효소법은 특별히 한정되지 않고, 공지의 방법을 사용할 수 있다. 특이성이 높은 측정 방법으로서 바람직한 효소법의 예로서는, 제1 반응에서 HbA1cβ쇄 N 말단의 당화 디펩티드를 프로테아제에 의해 소화, 절단함과 동시에 소정의 파장에 의해 헤모글로빈 농도를 구하고, 제2 반응에서 상기 당화 디펩티드에 특이적인 산화 효소를 작용시키고, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제의 존재 하에 발색제를 발색시켜 비색 정량하는 방법을 들 수 있다. 효소법에 근거하는 HbA1c %의 측정용 시약은 체외 진단용 의약품으로서 판매되고 있으며, 이들을 사용할 수 있다. 또한 본 발명에서 사용되는 효소법에는 이미 보고되어 있는 효소법에서의 각종 수식, 개변도 적절하게 채용할 수 있다.
헤모글로빈 농도의 측정에 있어서 메트화 등 공지의 방법에 의해 헤모글로빈을 일정한 구조로 하여 흡광도를 안정화시키는 처치를 행하여도 좋다. 또한 HbA1c 농도의 측정에 있어서, 프로테아제에 의한 소화, 절단 시, 계면활성제 등을 공존시킴으로써, HbA1c β쇄보다 당화 디펩티드가 소화, 절단되기 쉽게 하는 처치를 행하여도 좋다.
본 명세서에서 "제1 파장"이란, 헤모글로빈을 측정하기 위한 파장을 의미하며, 바람직하게는 본 발명 방법의 제1 공정에서의 헤모글로빈 농도의 광학적 측정에 사용하는 제1 광 파장이다. 당해 제1 파장은 450nm 내지 610nm의 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.
본 명세서에서 "제2 파장"이란, 제1 파장에서 측정한 겉보기 헤모글로빈 농도를 참 헤모글로빈 농도로 보정하기 위한 파장을 의미하며, 바람직하게는 본 발명 방법의 제1 공정에서의 광학적 측정에 사용하는 제2 광 파장이다. 제2 파장은 690nm 내지 900nm의 범위에서 적절하게 선택할 수 있다. 다른 관점에서, 제2 파장은 480nm보다 긴 파장이며, 100μmol/L 헤모글로빈 생리식염수액의 480nm에서의 흡광도에 대하여 1/10 이하의 흡광도를 부여하는 파장이며, 지방 입자 농도와 흡광도 사이에 상관 관계가 있는 파장으로부터 선택할 수 있다. 본 발명 방법에 있어서, 제1 공정에서의 상기 제2 파장에 의한 측정은 상기 제1 파장에 의한 측정 이후, 이전, 또는 병행하여 행할 수 있다.
본 명세서에서 "제1 파장", "제2 파장" 이라는 말에서의 "파장"이란, 모두 주 파장을 말하고, 백그라운드 보정의 목적 등으로 측정하는 이른바 '부 파장"을 의미하지 않는다.
본 명세서에서 "항목 간 연산"이란, 각각 독립적으로 측정된 헤모글로빈 A1c 측정값과 헤모글로빈의 측정값을 관련짓는 것을 말하며, 자동 분석 장치의 연산 기능에 의해 연산시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 보정된 헤모글로빈 농도의 산출은 상기 제1 공정에서의 제1 및 제2 파장에 의한 측정값의 취득으로부터 HbA1c % 계산까지 사이에 행하면 좋다. 예를 들어, 상기 제1 공정에서 제1 및 제2 파장에 의한 측정값의 취득 후 즉시 행하여도 좋고, 제2 공정과 병행하여 행하여도 좋으며, 또는 HbA1c % 산출 직전에 행하여도 좋다.
본 발명에 따른 상기 보정된 헤모글로빈 농도 산출 절차를 설명한다. 상기 보정 절차는 기본적으로 유미 검체(지방 입자를 포함하는 검체)와 동일한 성상을 부여하는 지방 유제 또는 측정계의 성능 평가용 방해 물질 시약을 포함하는 시료를 이용한 시험에 의해 설명 또는 구축할 수 있다. 지방 유제로서는 인트라리피드, 인트라리포스를 들 수 있고, 측정계의 성능 평가용 시약으로는 간섭 체크 A를 들 수 있으나, 이것으로 한정되지 않는다.
헤모글로빈을 측정하기 위한 제1 파장에 의한 상기 시료의 측정에서 지질 입자에 의한 흡수가 헤모글로빈에 의한 흡수에 가산되고, 시료 전체의 흡광도가 상승한다. 이에 따라 제1 파장에서 측정한 헤모글로빈 농도는 참 헤모글로빈 농도에 대하여 고수치화(僞高値化)된다.
제1 파장에서의 흡광도에 의해 산출된, 지질 입자를 포함하는 시료의 헤모글로빈 농도(겉보기 헤모글로빈 농도)와 지질 입자를 포함하지 않는 시료의 헤모글로빈 농도(참 헤모글로빈 농도)의 차이로부터, 지질 입자가 헤모글로빈으로서 측정된 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도(가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도: Xlipid)가 구해진다. Xlipid는 지질 입자에 기인하는 제1 파장에 의한 헤모글로빈 농도 측정값의 상승분이다.
한편, 다른 농도의 지질 입자를 포함하는 복수의 시료를 제2 파장에서 측정하여 지질 입자의 농도에 의존한 흡광도의 변화를 조사하고, 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도 (Xlipid)와 제2 파장에서의 지질 입자의 흡광도(Ylipid)와의 관계식(회귀식) [식 A]를 구한다.
[식 A]: X lipid = a1Ylipid - b1 (a1은 기울기, b1은 절편이다)
상기 [식 A]를 이용하여, 이하의 [식 B]에 의해, 겉보기 헤모글로빈 농도가 참 헤모글로빈 농도로 보정된다.
[식 B]: 보정된 헤모글로빈 농도 = 겉보기 헤모글로빈 농도 - 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도 = 겉보기 헤모글로빈 농도 - (a1Ylipid - b1)
상기 보정된 헤모글로빈 농도를 사용하고, NGSP %이면 이하에 의해 HbA1c %를 산출할 수 있다.
HbA1c % (NGSP %) = HbA1c 농도/보정된 헤모글로빈 농도 * 91.5 + 2.15
본 발명의 HbA1c % 산출 방법의 다른 양태를 설명한다.
제2 파장은 헤모글로빈에 의한 흡수가 제로인 파장이 최적이지만, 감도 문제로 인해 헤모글로빈의 농도에 따라 흡수를 실질적으로 제로로 할 수 없는 경우가 있다. 그런 경우에는, 이하에 의해, 제2 파장에서의 측정값에 미치는 헤모글로빈 농도의 영향을 보정할 수 있다.
시료의 헤모글로빈 농도(XHb)와 제2 파장에 의한 상기 시료의 흡광도의 변화분 (YHb)과의 관계식(회귀식) [식 C]를 구한다.
[식 C]: YHb = a2XHb - b2 (a2 는 기울기, b2는 절편이다)
이 관계식에 의해 시료의 헤모글로빈 농도에 의존한 제2 파장에 의한 흡광도의 변화분이 구해진다.
상기 [식 C]를 이용하고, 이하에 의해, 제2 파장에서의 헤모글로빈 농도의 영향을 배제한 지방 입자 농도에 유래하는 흡광도(보정된 지방 입자의 흡광도: Ylipid offset)이 구해진다.
[식 D]: 보정된 지방 입자의 흡광도 Ylipid offset = 제2 파장에 의한 시료의 흡광도 - 제2 파장에서의 헤모글로빈 농도에 의존한 흡광도의 변화분 = 제2 파장에서의 시료의 흡광도 - YHb
상기 보정된 지방 입자의 흡광도 Ylipid offset을 이용하여 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도 Xlipid를 추가로 보정하고, 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도 2: Xlipid-2를 산출한다.
[식 E]: 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도 2: Xlipid -2 = 보정된 지방 입자의 흡광도 Ylipid offset * a1 = (제2 파장에서의 시료의 흡광도 - XHb * a2) * a1
여기에서 [식 A]에서의 절편 b1은 [식 E] 중의 "-XHb * a2 * a1"로 표시되는 헤모글로빈 농도에 따라 변동하는 수치라는 것이 이해된다.
상기 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도 2: Xlipid -2를 이용하고, 보정된 헤모글로빈 농도를 추가로 보정하여, 보정된 헤모글로빈 농도 2를 산출한다.
[식 F] 보정된 헤모글로빈 농도 2 = 겉보기 헤모글로빈 농도 - 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도 2: Xlipid -2 = 겉보기 헤모글로빈 농도 - (제2 파장에서의 시료 흡광도 - XHb * a2) * a1
상기 보정된 헤모글로빈 농도 2를 사용하고, NGSP %이면, 이하에 의해 HbA1c %를 산출할 수 있다.
HbA1c % (NGSP %) = HbA1c 농도/보정된 헤모글로빈 농도 2 * 91.5 + 2.15
본 발명은 동일한 반응조 내에서 헤모글로빈과 HbA1c를 연속적으로 측정하는 방법에 적합하게 사용할 수 있지만, 제1 공정과 제2 공정을 별도의 반응조 내에서 행하여도 좋다. 예를 들어, 하나의 조에서는 제1 공정만을 행하여 헤모글로빈을 측정하고, 이것과는 다른 조에서는 제1 공정의 시약을 첨가하지만 헤모글로빈은 측정하지 않고, 계속해서 제2 공정을 행하여 HbA1c를 측정하는 경우에도 이용할 수 있는 것은 당업자라면 당연히 이해한다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[참고예 1]
지방 유제의 HbA1c %에 미치는 영향을 확인하였다.
1. 재료
(1) 시료: EDTA 채혈한 전혈을 수집하여 사용하였다. 이하, 수집 전혈(pooled whole blood)이라고 하는 수가 있다.
(2) 측정 시약과 캘리브레이터:
<전처리액>
10mM 아질산 나트륨
<프로테아제 함유 기질 시약 (R1)>
이하의 성분을 포함하는 50mM
인산 나트륨 완충액 pH 7.0
1.5% 암피톨 20BS (카오사)
2.0 mg/mL 프로틴 PC10F (야마토 화학 공업사)
0.01 % 아지드화 나트륨 (키시다 화학사제)
50μM DA-67 (10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진나트륨, 와코 준야쿠 공업사)
<발색 시약 (R2)>
이하의 성분을 포함하는 50mM
인산 나트륨 완충액 pH 7.0
10U/mL 프룩토실펩티드옥시다아제(기코만사)
1U/mL 퍼옥시다아제(도요보사)
<캘리브레이터>
노르디아 NHbA1c 캘리브레이터(세키스이 메디컬사)를 사용하였다.
(3) 지방 유제: 인트라리피드(프레지니우스 카비사)를 사용하였다.
2. 조작
(1) 시험 시료의 조제: 수집 전혈에 대하여 표 1의 최종 농도가 되도록 인트라리피드를 첨가하여 시험 시료를 조제하였다.
(2) 시험 시료의 측정:자동 분석 장치 JCA-BM9130 (니혼덴시사)을 이용하고, 이하의 측정 파라미터에 의해 시험 시료를 측정하여 HbA1c %를 측정하였다.
또한 각 시험 시료마다 헤모글로빈 농도 측정, 헤모글로빈 A1c 농도 측정에서의 반응 시간 코스를 확인하였다.
파라미터 :
[HbA1c, Hb]
분석 방법: EPA
계산 방법: MSTD
측정 파장 (부/주): HbA1c 805/658, Hb 805/478
주 DET. Pl-P. m-P. n: HbA1c 0-95-98, Hb 0-44-47
부 DET. P. p-P. r: HbA1c 44-47, Hb 0-0
반응 시간: 10분
혈구 측정시:
희석 검체량 (전혈량): 4.0μL
희석액량 (희석액): 110μL
캘리브레이터 측정시:
희석 검체량 (캘리브레이터): 25μL
희석액량 (희석액): 15μL
반응 검체량 (Sample 량): 6.4μL
제1 시약량 (R1): 60μL, 제2 시약량: 0μL,
제3 시약량 (R2): 20μL, 제4 시약량: 0μL
3. 결과
(1) 각 측정값의 변동
시험 시료 중의 인트라리피드의 농도에 의존한 헤모글로빈 농도 측정값의 증가와 HbA1c %의 저하가 확인되었다. 그 한편, HbA1c 농도 측정값은 거의 일정하였다 (이상, 표 1). 이상으로부터, HbA1c %의 저하는 HbA1c % 산출 시의 분모가 되는 헤모글로빈 농도 측정값의 증가에 기인하는 것으로 생각되었다.
[표 1]
Figure 112019013561213-pct00001
(2) 반응 시간 코스의 확인
각 시험 시료마다의 헤모글로빈 농도 측정, HbA1c 농도 측정에서의 반응 시간 코스를 도 1에 나타냈다. 모든 시험 시료에 대하여 헤모글로빈 농도 측정(도 1 왼쪽) 및 HbA1c 농도 측정(도 1 오른쪽)에서의 인트라리피드의 농도에 의존한 흡광도의 증가가 확인되었다. 본 참고예에서 사용한 자동 분석 장치 JCA-BM9130과 같은 일반적인 자동 분석 장치에 의한 헤모글로빈 농도 측정에서는, 검출된 흡광도 그 자체가 헤모글로빈 농도의 산출에 사용된다. 그 때문에 본 시험에서는 인트라리피드에 유래하는 흡광도의 증가가 그대로 헤모글로빈의 흡광도에 가산된 결과, 표 1과 같이 헤모글로빈 농도 측정값이 가성으로 고수치화된 것으로 추정되었다. 한편, 본 참고예에서 사용한 자동 분석 장치에 의한 HbA1c 농도 측정에서는 HbA1c 농도의 산출에 이용하는 흡광도로서 발색 시약 첨가 직전의 주 파장이나 부 파장에서의 측정값에 의한 보정이 이루어진 흡광도를 이용하기 때문에 발색 시약의 발색에 의한 흡광도의 증가분만이 HbA1c 농도의 산출에 사용된다. 그 때문에 본 시험에서의 HbA1c 농도 측정에서는, 헤모글로빈 농도 측정과 같은 가성의 고수치화가 관찰되지 않은 것으로 추정되었다.
[참고예 2]
시험 시료의 흡수 스펙트럼 분석(도 2) 결과, 헤모글로빈 및 발색 시약의 발색 시에서의 흡수가 적으며, 또한, 인트라리피드의 농도와 상관하는 흡수 파장으로서 약 690nm 내지 약 900nm 범위의 파장이 발견되었다. 이 중에서 884nm를 선택하고 표 1에서 관찰된 것과 같은 인트라리피드에 유래하는 헤모글로빈 농도의 가성 고수치화와의 상관 관계를 확인하였다.
1. 조작
884nm에서의 인트라리피드의 흡광도를 (X)로 하고, 표 1의 인트라리피드의 각 농도의 478nm에서의 헤모글로빈 농도 측정값과 884nm에서의 인트라리피드 무첨가 시험 시료의 헤모글로빈 농도 측정값의 차이를 가성의 고수치화에 의한 헤모글로빈 농도 상승분(가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도: Y)으로 하여, 양자의 상관 계수 (R2) 및 회귀식(Y = aX - b)을 구하였다.
2. 결과
상관 계수: R2 = 0.9836이고, 회귀식: Y = 1427.6X - 4.7512 [식 A1]이 얻어져, 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도가 인트라리피드에 기인하는 것이 확인되었다(도 3).
[실시예 1]
884nm에서의 측정에 의해 얻어진 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도의 회귀식을 이용하여 헤모글로빈 농도의 보정을 검토하였다.
1. 조작
참고예 2에서 얻어진 회귀식 [식 A1]로부터 [식 B1]을 유도하고, [식 B1]에 의해 478nm에서의 헤모글로빈 농도 측정값(겉보기 헤모글로빈 농도)의 보정을 하고, 보정 후의 헤모글로빈 농도를 이용하여 HbA1c %를 산출하였다.
[식 B1]
보정 후의 헤모글로빈 농도
= 겉보기 헤모글로빈 농도 - 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도
= 겉보기 헤모글로빈 농도 - (884nm에서의 흡광도 * 1400 - 5)
또한, 1400은 회귀식의 기울기를 간략화한 수치이며, -5는 절편을 간략화한 수치이다.
2. 결과
[식 B1]에 의해 구한 보정 후의 헤모글로빈 농도로 산출한 HbA1c %는 인트라리피드 무첨가 값과 근사하고, 인트라리피드의 농도에 의존한 값의 저하도 관찰되지 않았다 (표 2).
[표 2]
Figure 112019013561213-pct00002
이상으로부터 884nm의 흡광도로부터 유도되는 [식 B1]을 이용하여 헤모글로빈 농도를 보정함으로써 인트라리피드 의한 헤모글로빈 농도의 가성의 고수치화를 보정할 수 있는 것으로 확인되었다.
[실시예 2]
실시예 1에 의해 인트라리피드 첨가에 의한 헤모글로빈 농도의 가성의 고수치화를 보정할 수 있는 것으로 확인되었지만, 인트라리피드 첨가 시료에서의 HbA1c %의 약간의 저수치화가 인정되었다. 이것은 884nm에서의 헤모글로빈의 흡수가 제로가 아닌 것이 영향을 주고 있다고 생각되었기 때문에 이 영향을 확인하였다.
1. 재료
(1) 시료: 패널 검체(세정 혈구) (세키스이 메디컬사) 3 종류(레벨 1, 3, 5) [HbA1c값: 5.0% (레벨 1); 8.0% (레벨 3); 11.8 % (레벨 5)]
(2) 전처리액: 참고예 1에 기재된 전처리액을 사용하였다.
2. 조작
각 패널 검체를 전처리액으로 7배 및 80배로 희석한 헤모글로빈 농도 조정액을 조제하고, 두 액을 적절하게 혼합하여 HbA1c %는 일정하고 헤모글로빈 농도가 다른 측정 시료를 각 레벨에 대하여 각각 11 종류 조제하였다. 희석 검체량(혈구량)을 2.0μL로 한 것 이외에는 참고예 1과 동일한 순서를 사용하여 측정 시료의 HbA1c %를 측정하였다. 헤모글로빈 농도의 보정은 실시예 1과 동일하게 [식 B1]에 의해 실시하였다.
3. 결과
[식 B1]에 의한 보정 전과 보정 후에서 HbA1c %가 일치하지 않고, 헤모글로빈 농도에 의존하여 양자의 차이가 확대되었다(도 4).
이상으로부터, 헤모글로빈 농도에 의존한 884nm에서의 흡광도의 변화가 존재하는 것이 확인되었다.
[실시예 3]
헤모글로빈 농도에 의존한 884nm에서의 흡광도 변화의 보정을 검토하였다.
1. 조작
실시예 2에서 사용한 884nm에서 측정한 각 패널 검체의 헤모글로빈 농도를 (x), 884nm에서의 상기 각 패널 검체의 흡광도의 변화분을 (y)로 하여, 양자의 상관 계수(R2) 및 회귀식 (y = ax - b)를 구하였다.
2. 결과
상관 계수: R2 = 0.9844이고, 회귀식: y = 3.82 * 10-5x - 0 [식 C1]이 얻어졌다. 884nm에서 헤모글로빈 농도에 의존한 흡광도 변화가 존재하는 것이 다시 확인되었다(도 5).
[실시예 4]
헤모글로빈 농도에 의존한 884nm에서의 흡광도 변화분을 이용한 478nm에서의 헤모글로빈 농도 측정값의 보정을 검토하였다.
1. 조작
실시예 3에서 얻어진 회귀식 [식 C1]에 의해 헤모글로빈 농도에 의존한 884nm에서의 흡광도의 변화분을 구하고, 이것을 이용하여 884nm에서의 인트라 리포 스(오츠카 제약 공업사)에 의한 순 헤모글로빈 농도 상승분을 구하는 [식 D1]을 유도하고, 이어서, [식 D1]을 이용한 계산식 ([식 E1])에 의해 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도의 보정값을 산출하였다. 이를 근거로 최종적으로 보정 헤모글로빈 농도를 구하는 [식 F1]을 유도하였다.
2. 결과
[식 C1]
헤모글로빈 농도에 의존한 884nm에서의 흡광도의 변화분 = 헤모글로빈 농도 x 3.82 * 10-5
[식 D1]
884nm에서의 인트라리포스에 의한 순 흡광도 상승분 = 884nm의 흡광도 - ([식 C1]에서 얻어지는 값)
[식 E1]
가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도의 보정값 = ([식 D1]에서 얻어지는 값) * 1400
[식 F1]
보정 헤모글로빈 농도
= 478nm에서 산출되는 헤모글로빈 농도 - ([식 E1]에서 얻어지는 값) = 1.055 * 헤모글로빈 농도 - 884nm 흡광도 * 1400
[실시예 5]
[식 F1]의 타당성을 확인하였다.
1. 재료
(1) 시료: 수집 전혈을 사용하였다.
(2) 측정 시약과 캘리브레이터: 참고예 1과 동일한 측정 시약, 캘리브레이터를 사용하였다.
(3) 지방 유제류: 인트라리피드, 인트라리포스 (오츠카 제약 공업사), 간섭 체크 A 플러스 유미(시스멕스)를 사용하였다.
2. 조작
(1) 시험 시료의 조제: 수집 전혈에 대하여 표 3a 내지 3c의 최종 농도가 되도록 각 지방 유제류를 첨가하여 시험 시료를 조제하였다.
(2) 시험 시료의 측정: 자동 분석 장치 JCA-BM9130(니혼덴시사)를 이용하여 이하의 측정 파라미터에 의해 시험 시료를 측정하여, HbA1c %를 측정하였다.
파라미터 :
[HbA1c, Hb]
분석 방법: EPA
계산 방법: MSTD
측정 파장 (부/주): HbA1c 805/658, Hb 805/478
주 DET. Pl-P. m-P. n: HbA1c 0-95-98, Hb 0-44-47
부 DET. P. p-P. r: HbA1c 44-47, Hb 0-0
반응 시간: 10분
혈구 측정 시:
희석 검체량 (혈구량): 4.0μL
희석액량 (희석액): 110μL
캘리브레이터 측정 시
희석 검체량 (캘리브레이터): 25μL
희석액량 (희석액): 15μL
반응 검체량 (Sample 량): 6.4μL
제1 시약량 (R1): 60μL, 제2 시약량: 0μL,
제3 시약량 (R2): 20μL, 제4 시약량: 0μL
[884nm]
분석 방법: EPA
계산 방법: ABS
측정 파장 (부/주): Hb 없음/884nm
FV = 1
주 DET. Pl-P. m-P. n: Hb 0-44-47
부 DET. P. p-P. r: Hb 0-0
반응 시간: 10분
혈구 측정 시:
희석 검체량 (혈구량): 4.0μL
희석액량 (희석액): 110μL
캘리브레이터 측정 시
희석 검체량 (캘리브레이터): 25μL
희석액량 ( 희석액): 15μL
반응 검체량 (Sample 량): 6.4μL
제1 시약량 (R1): 60μL, 제2 시약량: 0μL,
제3 시약량 (R2): 20μL, 제4 시약량: 0μL
* 884nm의 캘리브레이션에는 생리 식염수를 사용한다.
항목 간 연산
[보정 Hb]
자릿수: 1 정성 판정: 하지 않음
X: 884nm Y: Hb
항목 간 연산식: 1.055 * Y - 1400 * X ⇒ [식 F1]
[NGSP %]
자릿수: 2 정성 판정: 하지 않음
X: HbA1c Y = 보정 Hb
항목 간 연산식: X/Y * 91.5 + 2.15
3. 결과
각 지방 유제류 첨가 성적을 표 3a 내지 3c에 나타냈다. [식 F1]을 이용하여 보정했을 경우, 지방 유제류의 종류에 관계없이 HbA1c %의 가성의 고수치화를 보정할 수 있는 것으로 확인되었다.
[표 3a]
Figure 112019013561213-pct00003
[표 3b]
Figure 112019013561213-pct00004
[표 3c]
Figure 112019013561213-pct00005
[실시예 6]
[식 F1]이 884nm 파장 대신 751nm 파장을 이용했을 경우 및 NGSP % 대신 IFCC에 기초하는 HbA1c % 측정에서도 유효하다는 것을 확인하였다.
1. 재료
(1) 시료: 수집 전혈을 사용하였다.
(2) 측정 시약과 캘리브레이터: 참고예 1과 동일한 측정 시약, 캘리브레이터를 사용하였다.
(3) 지방 유제류: 인트라리피드를 사용하였다.
2. 조작
(1) 시험 시료의 조제: 수집 전혈에 대하여 표 4a 내지 4b의 최종 농도가 되도록 각 지방 유제류를 첨가하여 시험 시료를 조제하였다.
(2) 시험 시료의 측정: 자동 분석 장치 JCA-BM9130(니혼덴시사)을 이용하여 실시예 5의 측정 파라미터를 일부 변경하고 시험 시료를 측정하여 HbA1c %를 측정하였다.
또한, 실시예 5에서 변경한 파라미터만을 이하에 기재하였다.
실시예 5의 파라미터 → 변경 후 파라미터
[884nm] → [751nm]
측정 파장 (부/주): Hb 없음/884nm → 측정 파장 (부/주): Hb 없음/751nm
항목 간 연산 1
[보정 Hb]
자릿수: 1 정성 판정:하지 않음
X: 751nm Y: Hb
항목 간 연산식: 1.053 * Y - 896 * X ⇒ 751nm 용 [식 F1]
[NGSP %]
자릿수: 2 정성 판정: 하지 않음
X: HbA1c Y = 보정 Hb
항목 간 연산식: X/Y * 91.5 + 2.15
항목 간 연산 2
[보정 Hb]
자릿수:1 정성 판정: 하지 않음
X: 751nm Y: Hb
항목 간 연산식: 1.053 * Y - 896 * X ⇒ 751nm 용 [식 F1]
[IFCC 값]
자리수: 2 정성 판정: 하지 않음
X: HbA1c Y = 보정 Hb
항목 간 연산식: X/Y * 1000 + 0
3. 결과
751nm 용 [식 F1]을 사용하여 보정을 실시한 결과, NGSP %의 경우도 IFCC 값의 경우도 인트라리피드의 영향을 받지 않고 HbA1c %를 산출할 수 있었다 (표 4a 내지 4b) .
[표 4a] 751 nm, NGSP%
Figure 112019013561213-pct00006
[표 4b] 751 nm, IFCC값 (mmol/mol)
Figure 112019013561213-pct00007
[실시예 7]
실제 검체를 이용하여 [식 F1]의 유효성을 확인하였다.
1. 재료
(1) 시료: EDTA 채혈한 전혈 350예(TG 값이 기준 범위 내이며, 또한 육안으로 불투명함을 발견하지 못함)을 사용하였다.
(2) 측정 시약과 캘리브레이터: 참고예 1과 동일한 측정 시약, 캘리브레이터를 사용하였다.
2. 조작
(1) 시료의 측정: 자동 분석 장치 JCA-BM9130 (니혼덴시사)을 이용하여 실시예 5에 기재된 측정 파라미터에 따라 시험 시료를 측정하고, [식 F1]을 사용하여 478nm 헤모글로빈 농도의 보정을 하여 HbA1c %를 측정하였다.
3. 결과
[식 F1]에 의한 보정 전 HbA1c %를 (x), 보정 후 HbA1c %를 (y)로 하여 상관성을 확인하였다. 결과, 상관 계수: R2 = 0.9999이고, 회귀식: y = 0.993x + 0.0199가 얻어져, 실제 검체를 측정했을 경우에도 본 발명의 방법을 사용할 수 있는 것으로 확인되었다 (도 6).

Claims (3)

  1. 효소법에 의한 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 헤모글로빈 A1c 농도의 비율 측정 방법으로서,
    헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과,
    헤모글로빈 A1c 농도를 550 nm 내지 750 nm로부터 선택된 파장에 의해 광학적으로 측정하는 제2 공정을 가지며,
    상기 제2 공정에서 측정한 헤모글로빈 A1c 농도를 상기 제1 공정에서 측정한 헤모글로빈 농도로 나누어 HbA1c %를 산출할 때, 450nm 내지 610nm로부터 선택된 제1 파장에 의해 측정한 분모가 되는 헤모글로빈 농도를, 690nm 내지 900nm로부터 선택된 제2 파장에서 측정한 지질 입자의 농도 정보 및 헤모글로빈의 농도 정보를 이용하여 보정하여 보정된 헤모글로빈 농도를 얻고,
    보정된 헤모글로빈 농도는 하기 [식 F]로 나타내는 방법:
    [식 F]: (보정된 헤모글로빈 농도) = (겉보기 헤모글로빈 농도) - (가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도)
    상기 겉보기 헤모글로빈 농도는 상기 제1 파장에 의해 측정된 헤모글로빈 농도이고,
    상기 가성의 고수치화분 헤모글로빈 농도는 하기 [식 E]로 결정되는 Xlipid-2이고,
    [식 E]: Xlipid-2 = (보정된 지방 입자의 흡광도 Ylipid offset) * a1 (a1은 기울기임)
    이때, Ylipid offset = (제2 파장에 의한 시료의 흡광도) - (제2 파장에서의 헤모글로빈 농도에 의존한 흡광도의 변화분 YHb),
    YHb는 하기 회귀식 [식 C]로 결정된다:
    [식 C]: YHb = a2XHb - b2 (a2는 기울기, b2는 절편, XHb는 겉보기 헤모글로빈 농도를 나타내고, 제1 파장에서 측정된 헤모글로빈 농도임).
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 전혈, 전혈에서 분리된 적혈구, 및 전혈에서 분리되고, 추가로 세정된 적혈구로부터 선택되는 방법.
  3. 삭제
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