CN113462816B - 一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法rt-lamp可视化检测试剂盒 - Google Patents

一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法rt-lamp可视化检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT‑LAMP可视化检测试剂盒，属于动物虫媒病毒检测技术领域。该试剂盒包括引物组、显色物质和反应试剂组、阳性对照和阴性对照；所述引物组包括用于检测TIBOV的特异性RT‑LAMP引物组、用于检测BAV的特异性RT‑LAMP引物组和用于检测MSV的特异性RT‑LAMP引物组；所述阳性对照为TIBOV、BAV和MSV的重组质粒；阴性对照为DEPC处理ddH2O。通过本发明试剂盒的RT‑LAMP方法能够快速诊断样品中携带的TIBOV、BAV或MSV，设备简单，操作简便，灵敏度高和特异性强，适用现场诊断，易于推广应用。

Description

一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT- LAMP可视化检测试剂盒
技术领域
本发明涉及动物虫媒病毒检测技术领域，具体涉及一种快速灵敏的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的RT-LAMP可视化试剂盒。
背景技术
虫媒病毒(Arbovirus)广泛分布于热带、亚热带与温带地区，病毒主要通过吸血节肢动物(主要为蠓、蜱、蚊、白蛉等)叮咬传播，可感染人、反刍动物、马属动物、有袋目哺乳动物、蝙蝠以及鸟类等多种动物并引发相关疾病，给家畜的养殖以及人类的公共卫生安全带来严重的威胁，目前已发现100余种虫媒病毒可引起人、畜或人畜共患疾病，主要集中有披膜病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科和呼肠孤病毒科等。迄今，虫媒病毒仍然在世界各地引发严重传染病，特别是近年来随着全球气候变暖和经济一体化进程加快，致使虫媒病毒病流行范围更广和危害更大，给世界各国造成了巨大的经济损失，并加重了公共卫生负担。
西藏环状病毒(Tibet Orbivirus，TIBOV)隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)。2009年首次从我国西藏墨脱县采集的蚊虫标本中分离出，随后在广东省、湖南省采集的蚊虫标本和在云南省芒市、西双版纳州和师宗县采集的库蠓样本中分离出。在云南省师宗、德宏、景洪等多个地区采集到的牛、羊和猪的血清样本中均检测到TIBOV的中和抗体，特别是多地牛血清的抗体阳性率高于20％，同时有文献报道TIBOV是家畜动物不明原因发热甚至流产的潜在致病病原。以上研究表明TIBOV在我国多地已经存在，可感染多种家畜，是一种潜在致病性病原，对我国牛羊养殖业构成了潜在威胁。
版纳病毒(Banna virus，BAV)隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)，为东南亚十二节段RNA病毒属的代表株，于1987年首次从我国西双版纳地区无名热和脑炎患者采集的脑脊液及血清标本中分离出。此后又陆续从印度尼西亚、越南、老挝等东南亚国家和中国甘肃、山西、山东、辽宁、内蒙古、湖北等地区采集的蚊虫或库蠓标本中分离出。并且多次直接从病人标本中分离到BAV，并在不明原因发热和病毒性脑炎患者血清中筛查到BAV的IgM和IgG抗体，这些研究结果表明了BAV可能是一种引起人类发热和病毒性脑炎的重要新发传染病的病原体，引起了国内外病毒学家和疾病预防控制专家的广泛关注。
芒市病毒(Mangshi virus,MSV)隶属呼肠病毒科(Reoviridae)东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)，为一种新发现的虫媒病毒。病毒于2013年在云南省芒市采集的三带喙库蚊(C.tritaeniorhynchus)中首次分离并因而得名，2014年在我国广东省汕头市濠江区采集的三带喙库蚊中再次分离到MSV，并于2019年首次从云南省景洪市哨兵牛的血液中分离到了MSV。但作为新发虫媒病毒的MSV，感染宿主动物的范围、感染特征、对动物健康和公共卫生的危害尚不清楚。
目前，动物感染病毒的检测方法主要有血清抗体检测和核酸检测，血清检测主要进行ELISA实验，但ELISA检测耗时长(2-3小时)，操作复杂，属于感染后的晚期诊断，并不适合作为快速检测方法；核酸检测主要包括常规RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法；常规RT-PCR耗时长，灵敏度低，扩增结束后需电泳检测，易污染，很难在感染初期检出病毒；实时荧光定量RT-PCR虽然灵敏度和时效性上有所提高，但是需要昂贵的检测设备。
环介导等温核酸扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification，RT-LAMP)是由Notomi等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用Bst-DNAPolymerase的帮助，从而可在等温条件下进行靶序列高效快速扩增，避免了常规RT-PCR或者实时荧光定量RT-PCR的梯度升降温模式。所以，RT-LAMP不需要昂贵的仪器设备，在普通的恒温水浴锅和热块中即可以完成，再有RT-LAMP可以根据反应管荧光颜色的变化，通过肉眼识别即可做出判断，做到了真正意义上的现场可视化快检。近年来，国内外已将该技术广泛应用于细菌、真菌和病毒等病原微生物的检测，其灵敏度、特异性和时效性都有很好的体验。但目前尚未见该方法用于TIBOV、BAV和MSV的检测应用中。
发明内容
针对现有常规RT-PCR和定量荧光定量RT-PCR检测技术在检测中存在耗时长或成本高等缺陷，本发明提供了一种快速显色的西藏环状病毒(TIBOV)、版纳病毒(BAV)和芒市病毒(MSV)一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒。样品检测结果表明，通过本发明试剂盒的RT-LAMP检测方法能够快速诊断样品中携带的TIBOV、BAV或MSV病毒核酸，设备简单，操作简便，灵敏度高和特异性强，并适用现场诊断。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种西藏环状病毒(TIBOV)、版纳病毒(BAV)和芒市病毒(MSV)的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，包括引物组、显色物质、阳性对照和阴性对照；
所述引物组包括用于检测TIBOV的特异性RT-LAMP引物组、用于检测BAV的特异性RT-LAMP引物组和用于检测MSV的特异性RT-LAMP引物组；
其中，用于检测TIBOV的特异性RT-LAMP引物组，包括以下6条引物：
TIBOV-F3：5’-gaggataaacctacagaggaa-3’(SEQ ID NO.1)；
TIBOV-B3：5’-tctccttttctttcttgacatt-3’(SEQ ID NO.2)；
TIBOV-FIP：5’-ttctcctttttctgtttgctctcttgggaaagagaaacagattggt-3’(SEQ IDNO.3)；
TIBOV-BIP：5’-gaagattcggtggtggaaaaagattgattaggtttagcgtgct-3’(SEQ IDNO.4)；
TIBOV-Floop：5’-ccttccgctcttcatctacctc-3’(SEQ ID NO.5)；
TIBOV-Bloop：5’-ggtacgtgcggcgaaagca-3’(SEQ ID NO.6)；
用于检测BAV的特异性RT-LAMP引物组，包括以下5条引物：
BAV-F3：5’-acataatttcgctaggagtcaa-3’(SEQ ID NO.7)；
BAV-B3：5’-gtccattctcttttaaatcgttac-3’(SEQ ID NO.8)；
BAV-FIP：5’-attacgaagcgtgggtcgtggcttgccgcttaactttg-3’(SEQ ID NO.9)；
BAV-BIP：5’-acttcttgatttccagcatcagtcacaaatcttttgtattgctcg-3’(SEQ IDNO.10)；
BAV-Floop：5’-accctcacaacccacagttt-3’(SEQ ID NO.11)；
用于检测MSV的特异性RT-LAMP引物组，包括以下5条引物：
MSV-F3：5’-agatggaagaaatgccaact-3’(SEQ ID NO.12)；
MSV-B3：5’-aactcacgttttaaatcgtttg-3’(SEQ ID NO.13)；
MSV-FIP：5’-acatttcaccacttcgtttgtcaataagcgtatttacccggttc-3’(SEQ IDNO.14)；
MSV-BIP：5’-agtgttgacagatgaaatgatggatggtatcttggcgacagt-3’(SEQ IDNO.15)；
MSV-Floop：5’-atgatcagcaggtgctgttg-3’(SEQ ID NO.16)。
进一步，优选的是，所述显色物质为钙黄绿素和氯化锰。
进一步，优选的是，所述阳性对照为TIBOV、BAV和MSV的重组质粒；阴性对照为DEPC处理ddH2O。
进一步，优选的是，TIBOV、BAV和MSV的重组质粒的制备方法为：利用TIBOV的SEQID NO.1和SEQ ID NO.2引物、BAV的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物、MSV的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13引物，分别对TIBOV、BAV和MSV的RNA进行RT-PCR，将扩增产物与pMD18-T连接构建获得，TIBOV、BAV和MSV的重组质粒TIBOV-CPMD、BAV-CPMD和MSV-CPMD。
进一步，优选的是，TIBOV、BAV和MSV的重组质粒浓度分别在0.1ng/μL-0.3ng/μL，计算核酸拷贝数分别为1.82×109拷贝/μL、1.37×109拷贝/μL和1.9×109拷贝/μL。
进一步，优选的是，还包括反应试剂组：dNTP混合物、MgSO4、10×Bst聚合酶反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱和AMV逆转录酶。
进一步，优选的是，反应试剂组含有：5U/μL的AMV逆转录酶、10倍Bst聚合酶反应缓冲液、6U/μL的链置换DNA聚合酶、10mmol/L的dNTP Mixture、10mol/L的甜菜碱、250μmol/L的钙黄绿素、25mmol/L的氯化锰、100mmol/L的MgSO4。
进一步，优选的是，3种引物组为分别用于检测TIBOV、BAV和MSV的引物组。TIBOV病毒引物浓度：TIBOV-F3/B3引物各10μmol/L、TIBOV-FIP/BIP引物各20μmol/L、TIBOV-Floop/Bloop引物各20μmol/L；BAV病毒引物浓度：BAV-F3/B3引物各10μmol/L、BAV-FIP/BIP引物各20μmol/L、BAV-Floop引物20μmol/L；MSV病毒引物浓度：MSV-F3/B3引物各10μmol/L、MSV-FIP/BIP引物各20μmol/L、MSV-Floop引物20μmol/L。
本发明提供用于检测TIBOV的特异性RT-LAMP引物组。
本发明还另外提供用于检测BAV的特异性RT-LAMP引物组。
本发明再提供用于检测MSV的特异性RT-LAMP引物组。
引物组：每一种病毒的引物组分别和反应试剂组混合构成一种病毒的检测试剂。
Figure BDA0003129980850000031
DEPC处理ddH2O补充至25μL。
需要解释的是，可以将检测TIBOV(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6)、BAV(SEQ IDNO.7-SEQ ID NO.11)和MSV(SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.16)的三组引物组分别和反应试剂组进行预混，分别构成检测TIOBV、BAV和MSV的三种预混检测试剂(23-24μL/管)。
需要解释的是，试剂盒中相关试剂产品均可在生物制剂公司现有产品中选择应用，例如：新英格兰生物实验公司(北京)公司的Bst DNA聚合酶或缓冲液(Bst2.0WarmStart DNA polymerase)或
Figure BDA0003129980850000032
LAMP变色预混液试剂盒(M1800)，北京索莱宝科技有限公司的甜菜碱(Betaine)、硫酸镁(MgSO4)和氯化锰(MnCl2)，合肥巴斯夫生物科技有限公司的钙黄绿素(Calcein)或日本荣研公司Loopamp荧光目视检测试剂盒(含有钙黄素和锰离子)，Takara宝生物工程(大连)有限公司的RNA酶抑制剂、dNTP Mixture、AMV反转录酶等。
需要解释的是，所述三种重组质粒TIBOV-CPMD、BAV-CPMD和MSV-CPMD，其制备过程中相关具体操作按现有技术进行即可。
需要解释的是，所述显色物质为钙黄绿素和氯化锰，用量摩尔比为1:100。
所述阴性对照为DEPC处理ddH2O。
所述的检测TIBOV、BAV和MSV的RT-LAMP可视化试剂盒的应用，包含以下步骤：
1)待测样品处理：提取样品的RNA 95℃加热5min后迅速冰水中冷却变性处理，将病毒基因组的双链RNA(dsRNAS)变性为单链RNA(ssRNA)；
2)反应体系准备：按待测样品数量，分别吸取检测TIBOV、BAV和MSV的三种检测预混试剂各23-24μL/样品，再各加入待测样品RNA 1.5μL；
3)反应：检测反应条件为55-65℃恒温反应45-60min，最后80℃灭活5min终止反应；
4)结果判读：通过自然光照下或紫外光下判读结果或是二者结合判读：
4-1)在自然光下反应产物为黄绿色，说明待测样品为阳性；在自然光下反应产物为粉色，说明待测样品为阴性；
4-2)在紫外光下反应产物呈现明显的绿色荧光，说明待测样品为阳性，无荧光或绿色荧光不明显，说明待测样品为阴性。
具体检测判定方法见表1：
表1
Figure BDA0003129980850000041
本发明主要构思为：
从GenBank中下载TIOBV、BAV、MSV病毒序列，通过MEGA-X与本实验室分离TIBOV(YNSZ/V290/2019)、BAV(YNSC043)和MAV(V301/YNJH/2019)毒株的序列进行对比，选择TIBOV Seg-9和BAV、MAV Seg-12的保守区。针对该结构区的靶片段分别设计5-6条特异性引物，提高了扩增效率，增加了扩增产物，相对降低了钙黄素的抑制率。同时，将含钙黄素的预混染料直接加入反应管，在反应结束后，就可以直接观察对比颜色变化，判断待测样品中有无三种病毒感染。
通过引入一对或一条环引物，摸索最佳扩增温度，提高了RT-LAMP的反应效率，进一步缩短了反应时长，加速了显色反应。以细胞毒提取的核酸为检测对象，其最低检出限为10拷贝/μL，敏感性是常规RT-PCR方法的10以上。通过对大量样品检测以及与常规RT-PCR检测方法的比较，表明三种病毒的RT-LAMP可视化检测方法不仅特异性强，而且灵敏度高。
本发明中分别将三种病毒的引物组和RT-LAMP反应试剂组进行了预混，分别组成了检测三种病毒的预混检测试剂，检测样品时可以直接根据待测样品数吸取预混试剂，避免了在配制反应液时出现污染的可能，同时简化了检测步骤，提高了工作效率。
所以，本发明的一步法RT-LAMP可视化检测方法具有广阔的市场应用前景，可以开发为大规模病原学检测方法，有望开发为可以在现场或基层防疫站使用的快速诊断试剂盒。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明提供的TIBOV、BAV和MSV的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒与传统的血清学试验相比，具有快速、准确、成本低廉、安全等明显优势；与病原学检测的常规RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR相比也具有明显优势，体现在表2所示的以下几方面。
表2
Figure BDA0003129980850000051
附图说明：
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为TIBOV、BAV和MSV常规RT-PCR电泳图。其中：N为阴性对照、数字1为TIBOV样品、数字2为BAV样品、数字3为MSV样品、M为DNA Marker DL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图2为TIBOV、BAV和MSV RT-LAMP最佳反应体系和反应条件下的电泳和目测结果图。其中：A图为电泳图，B图为目测结果，数字1和数字2分别为TIBOV样品和阴性对照、数字3和数字4分别为BAV样品和阴性对照、数字5和数字6分别为MSV样品和阴性对照、M为DNAMarker DL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图3为TIBOV、BAV和MSV RT-LAMP的特异性实验结果图。其中：A、C、E图为电泳图，B、D、F为目测结果；A、B图为TIBOV RT-LAMP特异性实验结果图；C、D为BAV RT-LAMP特异性实验结果图；E、F为MSV RT-LAMP特异性实验结果图；数字1为TIBOV、数字2为BAV、数字3为MSV、数字4为流行性出血病病毒(EHDV)、数字5为蓝舌病病毒(BTV)、数字6为中山病病毒(CHUV)、数字7为广西环状病毒(GXOV)和数字8为阿卡斑病毒(AKAV)、M为DNA Marker DL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图4为TIBOV RT-LAMP和常规RT-PCR灵敏度对比实验结果。其中：A为RT-PCR电泳图，B为RT-LAMP电泳图，C为RT-LAMP目测结果；数字0-6为TIBOV阳性质粒10倍倍比稀释至1.82×100拷贝/μL-1.82×106拷贝/μL的7个梯度样品、N为阴性对照、M为DNA MarkerDL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图5为BAV RT-LAMP和常规RT-PCR灵敏度对比实验结果。其中：A为RT-PCR电泳图，B为RT-LAMP电泳图，C为RT-LAMP目测结果；数字0-6为BAV阳性质粒10倍倍比稀释至1.37×100拷贝/μL-1.37×106拷贝/μL的7个梯度样品、N为阴性对照、M为DNA Marker DL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图6为MSV RT-LAMP和常规RT-PCR灵敏度对比实验结果。其中：A为RT-PCR电泳图，B为RT-LAMP电泳图，C为RT-LAMP目测结果；数字0-6为MSV阳性质粒10倍倍比稀释至1.9×100拷贝/μL-1.9×106拷贝/μL的7个梯度样品、N为阴性对照、M为DNA Marker DL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明的具体技术条件或实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，如Sambrook分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning：a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。所用材料、设备未注明生产厂商者或无特殊说明，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明除非另有说明，否则比例为质量比。
1.毒株
西藏环状病毒(Tibet orbivirus，TIBOV)YNSZ/V290/2019毒株、版纳病毒(Bannavirus，BAV)YNSC043毒株、芒市病毒(Mangshi virus,MSV)V301/YNJH/2019毒株、流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV)YNSZ/V003/2012毒株、蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)V134毒株、中山病病毒(Chuzan virus，CHUV)SZ187毒株、广西环状病毒(Guangxi orbivirus，GXOV)V172/GX/2015和阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)16415毒株由本实验室分离保存。
2.临床样品
用于临床检测的蠓虫和蚊虫样品采集自云南省德宏和师宗不同地区牛羊养殖场，共有2596份样品，其中蠓虫1947份，蚊虫649份。这些样品提取其核酸后，分别进行TIBOV、MSV和BAV快速显色一步法RT-LAMP和常规RT-PCR检测，比较两种方法的检出率，并计算二者的符合率。
3.核酸扩增和提取相关试剂盒
用于建立RT-LAMP方法的Bst DNA聚合酶和聚合酶缓冲液(Bst 2.0WarmStart DNApolymerase)或扩增试剂盒
Figure BDA0003129980850000061
LAMP变色预混液(M1800)购自新英格兰生物实验公司(北京)，甜菜碱(Betaine)、硫酸镁(MgSO4)和氯化锰(MnCl2)均购自北京索莱宝科技有限公司；钙黄绿素(Calcein)购自合肥巴斯夫生物科技有限公司；病毒RNA抽提试剂盒MagMAX-96Viral RNA Isolation Kit购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司；一步法RT-PCR试剂盒PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2、RNA酶抑制剂、dNTP Mixture、AMV反转录酶购自TakaRa宝生物工程(大连)有限公司；DEPC处理ddH2O购自天根生化科技(北京)有限公司。
实施例1
一、样品核酸提取和变性
采用Thermo赛默飞世尔科技公司生产病毒RNA抽提试剂盒MagMAX-96Viral RNAIsolation Kit提取细胞毒和研磨后的昆虫样品中的核酸。
将提取的核酸95℃加热5min后迅速冰水中冷却，解开病毒基因组的双链RNA后，作为待检实验样品。
二、常规RT-PCR实验检测TIBOV、BAV和MSV
1.TIBOV、BAV和MSV常规RT-PCR扩增引物序列见表3
表3
Figure BDA0003129980850000062
Figure BDA0003129980850000071
以上3对引物TIBOV-S9-F/R、BAV-S 12-F/R和MSV-S 12-F/R是本申请人建立TIBOV、BAV和MSV一步法常规RT-PCR检测方法的引物序列，引物和方法已经于国内刊物上发表。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并用RNase free水稀释至10μmol/L。
2.RT-PCR扩增反应体系
采用TakaRa公司PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2进行RT-PCR扩增。
RT-PCR反应体系：
Figure BDA0003129980850000072
3.RT-PCR扩增反应流程
扩增程序：45℃反转录40min；94℃变性2min；[94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸45s]×30个循环；72℃延伸5min。
4.RT-PCR扩增产物电泳检测
取RT-PCR扩增产物5μL进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为1.5％，电泳缓冲液为1×TAE，电泳速度为5-6伏特/厘米。
5.结果
采用TIBOV Seg-9、BAV和MSV Seg-12为靶基因设计的特异性引物对，分别对TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株、BAV(YNSC043)毒株、MSV(V301/YNJH/2019)毒株的RNA模板进行扩增，结果见图1TIBOV、BAV和MSV常规RT-PCR电泳图，结果显示3对引物均能分别特异性扩增3种毒株的核酸，并产生相应的扩增条带，对TIBOV、BAV和MSV的预计扩增片段大小分别为716bp、653bp和631bp。
三、TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP的建立
1.TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP扩增引物选择及序列
本申请人从NCBI检索并下载TIBOV、MSV和BAV病毒的全基因组序列，并根据本实验室在我国新分离3种毒株的全基因序列，利用MEGA-X和Alignment软件进行序列对比分析，确定并选择TIBOV的Seg-9基因(GenBank号：KF_746195)，BAV和MAV的Seg-12基因(GenBank号：NC_007747与NC_004199)的相对保守区为靶基因，利用Primer Exporer V5(http://primerexplorer.jp/e/)在线软件设计特异性RT-LAMP引物。
TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP共有16条引物(见表4)，除了常规的一对外引物(F3和B3)和一对内引物(FIP和BIP)之外，还有一对或一条环引物，即Floop或Bloop。引入环引物的目的旨在进一步提高扩增效率，提高产物量，利于快速显色。
表4
Figure BDA0003129980850000073
Figure BDA0003129980850000081
2.RT-LAMP扩增反应体系
TIBOV、BAV和MSV RT-LAMP的反应体系分别均为25μL/管，加样量如下：
引物组：每一种病毒的引物组分别和反应试剂组混合构成一种病毒的检测试剂。
Figure BDA0003129980850000082
DEPC处理ddH2O补充至25μL。
TIBOV、BAV和MSV RT-LAMP反应涉及16条引物，在实验前，可分别先将每一种病毒的引物组和反应试剂组按量进行预混，分别制备成检测三种病毒的预混检测试剂，操作时仅需按(23-24μL预混试剂)/管计算，吸取预混检测试剂。这样一方面降低成本，一方面简化了病毒检测的实验操作过程，缩短了检测时间，提高了工作效率，同时有效避免了污染的可能。
需要解释的是，试剂盒中相关试剂产品可在相关生物制剂公司的现有产品中选择应用，例如：新英格兰生物实验公司(北京)公司的Bst DNA聚合酶和缓冲液(Bst2.0WarmStart DNA polymerase)或
Figure BDA0003129980850000083
LAMP变色预混液试剂盒(M1800)，TakaRa宝生物工程(大连)有限公司的RNA酶抑制剂、dNTP Mixture、AMV反转录酶等。或可以选用其他公司产品，根据产品规格对反应体系进行适当调整即可。
需要解释的是，本实施例中所用引物SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
还需解释的是，试剂盒中所述三种病毒的阳性对照分别为三种病毒的重组质粒TIBOV-CPMD、BAV-CPMD和MSV-CPMD，其制备过程中相关具体操作按现有技术进行操作即可。
也可具体参考如下过程制作：
首先，从确定的TIBOV、BAV和MSV病毒的细胞培养液中提取三种病毒的RNA样本，分别利用三种病毒RT-LAMP的外侧引物(TIBOV-S9-F3/B3、BAV-S 12-F3/B3、MSV-S12-F3/B3)进行一步法RT-PCR扩增，获取目的片段；
采用TakaRa公司PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2进行RT-PCR扩增，扩增反应体系(50μL)：
Figure BDA0003129980850000091
RT-PCR扩增反应流程：45℃反转录40min；94℃变性2min；[94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s]×30个循环；72℃延伸5min。
将上述RT-PCR反应产物进行胶回收，将回收产物与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、鉴定正确重组质粒，并进行测序验证后。用紫外分光光度计测定三种重组质粒(TIBOV-CPMD、BAV-CPMD和MSV-CPMD)核酸浓度分别在0.1ng/μL-0.3ng/μL，根据公式计算出核酸拷贝数分别为1.82×109拷贝/μL、1.37×109拷贝/μL和1.9×109拷贝/μL。
相关过程采用商品化试剂盒进行实验，具体操作参考对应试剂盒说明书进行操作即可，不再赘述。
3.RT-LAMP扩增反应流程
RT-LAMP为恒温扩增反应，所以不需要PCR扩增仪器，只要能够提供恒温反应的仪器都可以，最常用的仪器是普通的水浴锅或热块。加样后的反应管瞬时离心，然后放入水浴锅(管子插入浮漂即可)或热块即可。
扩增程序：60-65℃反应45-90分钟。一般情况60分钟就可以。63℃或64℃反应效果最佳，最后80℃灭活5min终止反应。
4.RT-LAMP扩增产物检测
(1)琼脂糖凝胶电泳检测法
RT-LAMP扩增产物可以采用常规琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为2-2.5％，电泳缓冲液为1×TAE，电泳速度为5-6伏特/厘米，电泳结束后在紫外灯下观察拍照。
(2)荧光目测法
快速显色一步法RT-LAMP由于在反应管内加入了含有钙黄素和锰离子的染料，所以，在反应结束后，阳性样品管就会出现明亮的黄绿色，而阴性样品管为粉色。这样通过与系统设置的阴性和阳性对照的比较，在自然光下，通过肉眼观察即可以做出判断。再有，阳性样品由于扩增产生了大量产物，所以与阴性对照相比较，阳性管溶液更为浑浊。在实验室，还可以通过在紫外灯下观察颜色变化，较自然光观察，更为明显。
5.RT-LAMP的结果判定
一份待测样品需要用TIBOV、BAV和MSV的三种RT-LAMP的预混试剂分别进行检测，结果判定标准为：
(1)首先若三种病毒的阳性对照均为明亮的黄绿色，阴性为粉色，实验成立；
(2)若只有一个反应管中产物颜色为黄绿色或绿色荧光，其它两管中产物颜色为粉色或无荧光，判定待测样品中只含一种病毒，即为黄绿色或绿色荧光产物管对应的检测病毒；
(3)若两个反应管中产物颜色为黄绿色或绿色荧光，另外一管中产物颜色为粉色或无荧光，判定待测样品中含两种病毒，即为两个黄绿色或绿色荧光产物管对应的检测病毒；
(4)若三个反应管中产物颜色均为黄绿色或绿色荧光，判定待测样品中含三种病毒。
6.结果
以TIBOV(YNSZ/V290/2019)、BAV(YNSC043)、MSV(V301/YNJH/2019)毒株的三种细胞毒RNA为模板建立TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP，结果见图2TIBOV、BAV和MSVRT-LAMP最佳反应体系和反应条件下的电泳和目测结果。电泳结果(图2A)显示，在60-65℃三种病毒都能够有效扩增出典型的梯形条带，条带清晰明显。在自然光情况下(图2B)，肉眼可见黄绿色，阴性对照为粉色，拍照效果不如肉眼观察效果好。
实施例2
本发明试剂盒的性能试验：
一、TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP特异性分析实验
取TIBOV、MSV、BAV、EHDV、BTV、CHUV、GXOV和AKAV等虫媒病毒作为特异性实验对照，提取核酸后用TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP分别进行检测，验证三种病毒检测方法的特异性。具体实验操作方法按照实施例1中进行。
结果见图3TIBOV、BAV和MSV RT-LAMP的特异性实验结果，电泳结果如图3(A、C、E)所示，目测颜色结果如图3(B、D、F)所示。从图中可以看出，TIBOV、BAV和MSV样本分别可见阶梯状的电泳条带，反应管中颜色为黄绿色，显示为阳性；而其他病毒和阴性对照无电泳条带，反应管中颜色为粉色，显示为阴性。这一结果表明，TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP具有较好地特异性，三种病毒间不发生交叉反应也不会和其他虫媒病毒发现交叉反应。
二、TIBOV、BAV和MSV快速显色一步法RT-LAMP敏感性分析实验
将已经测定核酸拷贝数的TIBOV、BAV和MSV重组质粒(TIBOV-CPMD、BAV-CPMD和MSV-CPMD)用RNase free水10倍梯度稀释成106-100拷贝/μL的7个浓度梯度，每个反应管加入1μL稀释的核酸样品作为模板，按实施例1中方法分别进行TIBOV、BAV和MSV RT-LAMP实验和常规RT-PCR扩增。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳和荧光检测，分析比较两种方法的敏感性。
结果分别见图4至图6TIBOV、BAV和MSV的RT-LAMP和常规RT-PCR灵敏度对比实验。结果表明，以TIBOV、BAV和MSV三种病毒细胞毒提取的RNA为检测对象时，快速显色一步法RT-LAMP检出TIBOV、BAV和MSV的最低核酸浓度分别为18.2拷贝/μL、13.7拷贝/μL和19.0拷贝/μL(图4至图6的B和C)，常规RT-PCR方法分别检出三种病毒的最低核酸浓度分别为182拷贝/μL、137拷贝/μL和190拷贝/μL(图4至图6的A)。表明，一步法快速显色RT-LAMP比常规RT-PCR灵敏高，至少可以提高10以上。
三、RT-LAMP和常规RT-PCR临床样本的检测对比试验
提取采集自云南省德宏和师宗不同地区牛羊养殖场共2596份蠓虫和蚊虫的核酸样品，参照实施例1中的方法，分别进行TIBOV、BAV和MSV快速显示一步法RT-LAMP和常规RT-PCR检测，比较两种方法的检出率，并计算二者的符合率。
结果分别见表5至表7的TIBOV、BAV和MSV快速显示一步法RT-LAMP和常规RT-PCR检测临床样品的比较结果。表5TIOBV RT-LAMP和常规RT-PCR检测结果显示，RT-LAMP和RT-PCR检出TIBOV的检出率分别为3.31％和1.19％，两种方法检测同为阳性和阴性的样品各为31份和2510份，符合率为[(31+2510)/2596]×100％＝97.88％。表6BAV RT-LAMP和常规RT-PCR检测结果显示，RT-LAMP和RT-PCR检出BAV的检出率分别为2.97％和1.12％，两种方法检测同为阳性和阴性的样品各为29份和2519份，符合率为[(29+2519)/2596]×100％＝98.15％。表7MSV RT-LAMP和常规RT-PCR检测结果显示，RT-LAMP和RT-PCR检出MSV的检出率分别为2.35％和0.96％，两种方法检测同为阳性和阴性的样品各为25份和2535份，符合率为[(25+2535)/2596]×100％＝98.61％。
以上结果表明，TIBOV、BAV和MSV快速显示一步法RT-LAMP在临床样品检测的应用中，病毒检出率均是常规RT-PCR的2倍以上，说明本的建立灵敏度优异传统的RT-PCR，更适用于临床样品的检测。
表5
Figure BDA0003129980850000111
表6
Figure BDA0003129980850000112
表7
Figure BDA0003129980850000113
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 云南省畜牧兽医科学院
<120> 一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gaggataaac ctacagagga a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tctccttttc tttcttgaca tt 22
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ttctcctttt tctgtttgct ctcttgggaa agagaaacag attggt 46
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gaagattcgg tggtggaaaa agattgatta ggtttagcgt gct 43
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ccttccgctc ttcatctacc tc 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggtacgtgcg gcgaaagca 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
acataatttc gctaggagtc aa 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gtccattctc ttttaaatcg ttac 24
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
attacgaagc gtgggtcgtg gcttgccgct taactttg 38
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
acttcttgat ttccagcatc agtcacaaat cttttgtatt gctcg 45
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
accctcacaa cccacagttt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
agatggaaga aatgccaact 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
aactcacgtt ttaaatcgtt tg 22
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
acatttcacc acttcgtttg tcaataagcg tatttacccg gttc 44
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
agtgttgaca gatgaaatga tggatggtat cttggcgaca gt 42
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
atgatcagca ggtgctgttg 20

Claims (10)

1.一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，包括引物组、显色物质、阳性对照和阴性对照；
所述引物组包括用于检测TIBOV的特异性RT-LAMP引物组、用于检测BAV的特异性RT-LAMP引物组和用于检测MSV的特异性RT-LAMP引物组；
其中，用于检测TIBOV的特异性RT-LAMP引物组，包括以下6条引物：
TIBOV-F3：5’-gaggataaacctacagaggaa-3’（SEQ ID NO.1）；
TIBOV-B3：5’-tctccttttctttcttgacatt-3’（SEQ ID NO.2）；
TIBOV-FIP：5’-ttctcctttttctgtttgctctcttgggaaagagaaacagattggt-3’（SEQ IDNO.3）；
TIBOV-BIP：5’-gaagattcggtggtggaaaaagattgattaggtttagcgtgct-3’（SEQ ID NO.4）；
TIBOV-Floop：5’-ccttccgctcttcatctacctc-3’（SEQ ID NO.5）；
TIBOV-Bloop：5’-ggtacgtgcggcgaaagca-3’（SEQ ID NO.6）；
用于检测BAV的特异性RT-LAMP引物组，包括以下5条引物：
BAV-F3：5’-acataatttcgctaggagtcaa-3’（SEQ ID NO.7）；
BAV-B3：5’-gtccattctcttttaaatcgttac-3’（SEQ ID NO.8）；
BAV-FIP：5’-attacgaagcgtgggtcgtggcttgccgcttaactttg-3’（SEQ ID NO.9）；
BAV-BIP：5’-acttcttgatttccagcatcagtcacaaatcttttgtattgctcg-3’（SEQ IDNO.10）；
BAV-Floop：5’-accctcacaacccacagttt-3’（SEQ ID NO.11）；
用于检测MSV的特异性RT-LAMP引物组，包括以下5条引物：
MSV-F3：5’-agatggaagaaatgccaact-3’（SEQ ID NO.12）；
MSV-B3：5’-aactcacgttttaaatcgtttg-3’（SEQ ID NO.13）；
MSV-FIP：5’-acatttcaccacttcgtttgtcaataagcgtatttacccggttc-3’（SEQ ID NO.14）；
MSV-BIP：5’-agtgttgacagatgaaatgatggatggtatcttggcgacagt-3’（SEQ ID NO.15）；
MSV-Floop：5’-atgatcagcaggtgctgttg-3’（SEQ ID NO.16）。
2.根据权利要求1所述的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，所述显色物质为钙黄绿素和氯化锰。
3.根据权利要求1所述的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为TIBOV、BAV和MSV的重组质粒；阴性对照为DEPC处理ddH2O。
4.根据权利要求3所述的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，TIBOV、BAV和MSV的重组质粒制备方法为：利用TIBOV的SEQID NO.1和SEQ ID NO.2引物、BAV的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物、MSV的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13引物，分别对TIBOV、BAV和MSV的RNA进行RT-PCR，将扩增产物与pMD18-T连接构建获得TIBOV、BAV和MSV的重组质粒TIBOV-CPMD、BAV-CPMD和MSV-CPMD。
5.根据权利要求3所述的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，TIBOV、BAV和MSV的重组质粒浓度分别在0.1 ng/μL-0.3 ng/μL，计算核酸拷贝数分别为1.82×109 拷贝/μL、1.37×109 拷贝/μL和1.9×109拷贝/μL。
6.根据权利要求1所述的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，还包括反应试剂组：dNTP混合物、MgSO4、10×Bst聚合酶反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱和AMV逆转录酶。
7.根据权利要求6所述的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，反应试剂组含有：5 U/μL的AMV逆转录酶、10倍Bst聚合酶反应缓冲液、6 U/μL的链置换DNA聚合酶、10 mmol/L的dNTP Mixture、10 mol/L的甜菜碱、250μmol/L的钙黄绿素、25 mmol/L的氯化锰、100 mmol/L的MgSO4。
8.权利要求1所述的用于检测TIBOV的特异性RT-LAMP引物组。
9.权利要求1所述的用于检测BAV的特异性RT-LAMP引物组。
10.权利要求1所述的用于检测MSV的特异性RT-LAMP引物组。
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西藏环状病毒荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方法的建立及应用;杨振兴等;《中国兽医科学》;20201231;第50卷(第11期);第1365-1372页 *

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