CN106755591A - 检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测伪狂犬病毒野毒株的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用。该引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的引物组；试剂盒包括上述的引物组和核酸试纸条；该试剂盒的使用方法如下：首先配制交叉引物扩增反应体系；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组、试剂盒及 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组、试剂盒及应用。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)感染引起，是严重危害我国养猪业的一种重要传染病。伪狂犬病毒属于α疱疹病毒科，基因组为双链DNA分子，大小约150kb，成熟病毒粒子携带50余种蛋白，其中gB、gE、gG、gI、TK等毒力基因是其复制非必需基。虽然我国曾采取gE基因缺失疫苗免疫与野毒感染抗体监测相结合的策略一度实现了该病的控制与净化，但2011年底猪群中变异毒株的出现导致广泛使用的Bartha-K61弱毒疫苗无法再提供完全保护，许多已免疫的猪场仍相继出现疑似伪狂犬病症状，造成我国养猪业的巨大损失。

PRV宿主谱极其广泛，包括猪、牛、羊、鼠、兔、猫、犬等。猪是PRV感染后唯一可以存活的物种，但急性感染猪康复后，病毒基因组将一直存在于三叉神经节中造成潜伏感染，这增加了猪伪狂犬病的诊断与防控难度。目前，常用的伪狂犬病诊断方法主要包括病毒分离、兔体接种实验、ELISA和PCR技术等。其中，PCR技术是基层兽医普遍使用PRV病原检测方法。然而，该技术在扩增过程中需要昂贵的热循环功能仪与熟练的操作人员，妨碍该技术在兽医基层进行广泛的应用与推广。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增快速检测试剂盒及应用，该试剂盒具有高特异性、高敏感性、可视化、操作方法简单的特点。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组，由外部引物F3、外部引物B3、探针引物B2、探针引物B1、交叉引物CPF组成；

外部引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外部引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

交叉引物CPF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

探针引物B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

探针引物B1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，探针引物B2的5’端标记生物素Biotin；探针引物B1的5’端标记FITC。

本发明还提供一种检测伪狂犬病毒野毒株的交叉引物扩增试剂盒，包括上述的检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组和核酸试纸条。

进一步地，核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

进一步地，该试剂盒还包括全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，该全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

进一步地，该试剂盒还包括dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反应缓冲液、BstWarmStart^TM DNA聚合酶、甜菜碱溶液。

进一步地，该试剂盒包括10×反应缓冲液2.5μL、浓度为8U/μL的Bst WarmStart^TMDNA聚合酶、浓度为10mmol/L的dNTP混合物溶液2.0μL、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液2.5μL、浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液1.0μL、浓度为10μmol/L的交叉引物CPF2.0μL、浓度为10μmol/L的探针引物B2 1.5μL、浓度为10μmol/L的探针引物B11.5μL、浓度为10μmol/L的外部引物F31.0μL、浓度为10μmol/L的外部引物B3 1.0μL。

本发明还提供一种上述的引物组或试剂盒在检测待测样品是否感染伪狂犬病毒野毒株中的应用。

本发明还提供一种检测待测样品是否感染伪狂犬病毒野毒株的方法，包括以下步骤：

1)用上述的引物组或试剂盒对待测样品进行交叉等温扩增，得到扩增产物；

2)反应：将得到的产物用核酸检测试纸条检测，5min后观察结果；

3)结果判读：直接肉眼判读，

a)阴性：仅在质控区出现一条条带，在检测区内无条带出现，证明待测样品没有伪狂犬病毒野毒株感染；

b)阳性：出现两条条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明待测样品为伪狂犬病毒野毒株感染；

c)无效：质控区和检测区内均无条带出现，表明核酸试纸条失效。

进一步地，步骤1)中所述的恒温反应的时间为60min；恒温反应的温度为65℃。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)由于交叉引物扩增检测方法成本低廉，利用Bst WarmStart^TM DNA聚合酶在65℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此本发明提供的试剂盒使用成本低。

2)本发明所提供的试剂盒反应迅速，可以在60min内完成反应。

3)本发明提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，无需进行复杂操作。分别对引物与特异性亲和探针进行生物标记，然后再用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置对反应产物进行检测，既可以准确对结果进行直观、快速的判读，又可以防止污染。

4)本发明提供的试剂盒特异性好，对伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61、猪肾细胞PK-15传代系、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌都呈阴性反应；敏度性高，最低可以检测到2TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株基因组DNA模板，与PCR方法敏感性相同。

5)本发明所述的伪狂犬病毒野毒株交叉等温扩增试剂盒可快速、敏感的检测伪狂犬病毒野毒株，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅即可完成反应。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明不同温度下反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～8依次对应反应温度为57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃的反应产物；

图2是本发明不同浓度交叉引物CPF与电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1～11依次对应交叉引物CPR浓度为0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM的反应产物；其他成分的用量如表2所示；

图3是本发明提供的交叉等温扩增试剂盒特异性实验中的结果图，其中：

Ctrl为空白对照；1是以伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA为模板的检测结果；2是以伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因组DNA为模板的检测结果；3是以猪肾细胞PK-15传代系基因组DNA为模板的检测结果；4是以猪圆环病毒2型基因组DNA为模板的检测结果；5是以猪细小病毒基因组DNA为模板的检测结果；6是以血清5型副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板的检测结果；7是以血清2型猪链球菌基因组DNA为模板的检测结果。

图4是本发明提供的交叉等温扩增试剂盒敏感性试验结果图；其中，1为2×10⁴TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；2×10³TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；3为2×10²TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；4为2×10¹TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；5为2×10⁰TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；6为2×10^-1TCID50的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；7为2×10^-2TCID50的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；8为空白对照。

图5是本发明利用PCR方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；其中，1为2×10⁴TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；2×10³TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；3为2×10²TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；4为2×10¹TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；5为2×10⁰TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；6为2×10^-1TCID50的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；7为2×10^-2TCID50的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH基因组DNA；8为空白对照。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明的研究思路是：针对PCR技术在诊断应用中不足，有关恒温扩增技术的研究不断深入，为快速诊断方法的形成带来了新的契机。本发明技术研制了伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增检测方法，并将该方法与核酸试纸条检测相结合，使得伪狂犬病毒野毒株的检测过程更加方便、快速。本发明技术提供的检测试剂盒在整个使用过程不需要复杂仪器，核酸样品制备与扩增程序简便，容易在兽医基层建立与开展。另外，本发明技术提供的检测试剂盒在样品扩增与结果判定过程中可保证环境的密闭，有效杜绝了因核酸污染造成的假阳性的发生。

实施例中所涉及的材料：

a)引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Bst WarmStart^TM DNA聚合酶购自New England公司；MgSO₄(100mM)购自New England公司；甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司(货号：0001-03)；病毒核酸提取试剂盒购自Magen(美基)生物(R4410-03)；伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)、猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)、猪细小病毒油乳剂灭活疫苗购自上海海利生物技术有限公司；PK-15细胞购自上海拜力生物技术有限公司。

b)伪狂犬病毒野毒GZ-WH株由临床病料接种PK-15细胞分离，病毒基因序列已提交至交至GenBank(No.KT948051)。

c)以下生物材料均已在文献“副猪嗜血杆菌和猪链球菌双重PCR方法的建立与应用.中国兽医学报,2009(9):第1155-1157页.”中公开：血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌。

实施例1交叉引物恒温扩增引物的设计和合成

根据引物设计原则，针对伪狂犬病毒野毒株gE基因的保守区域序列，应用Priemer5软件进行引物设计，按照我们的经验保证引物的GC含量在40％～60％之间，各引物Tm值在50～60℃左右。接着我们应用Larsergene7.0生物软件的PrimerSelect工具对引物进行初步筛选，筛选原则为保证各引物对之间dG值较小。引物序列如表1所示(此时B2和B1引物未进行生物标记)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成浓度为10μM，-20℃保存。

实施例2交叉引物恒温扩增引物在检测待测病毒中的应用

一、病毒核酸的提取

取样品200μL，按照病毒RNA/DNA提取试剂盒的操作说明进行病毒的核酸提取。

二、交叉等温扩增方法的建立

以伪狂犬病毒野毒株GZ-WH的基因组DNA为模板，应用初步筛选理论值较优的1套引物(如表1所示)进行交叉引物扩增，并对得到产物进行琼脂糖凝胶(质量体积比2％)电泳检测。

表1伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增反应引物

三、交叉引物扩增反应条件的优化

1.反应温度的优化

为了得到最优化的反应温度，分别设置57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃进行交叉等温扩增反应，反应时间是60min，反应体系如表2所示。反应产物通过2％琼脂糖凝胶(质量体积比)电泳检测，从多次重复试验中确定最佳反应温度，结果如图1所示，说明最佳反应温度为65℃。

2.反应体系的优化

主要对交叉引物浓度进行优化，反应产物通过2％琼脂糖凝胶(质量体积比)电泳检测。

通过设置不同终浓度的交叉引物CPF：0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM，其他成分的用量如表2所示(结果如图2所示)。检测条件为65℃恒温60min。根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系(25μL)如表2所示。

表2优化的伪狂犬病毒野毒株交叉引物扩增反应体系

四、交叉等温扩增-测流层析检测方法的建立

由上海生工生物工程技术服务有限公司对B2和B1引物的5’端分别进行Biotin(生物素)和FITC(异硫氰酸荧光素)标记。按照表2反应体系将B2和B1分别替换为Biotin(生物素)标记的B2和FITC(异硫氰酸荧光素)标记的B1，建立可用于核酸试纸条检测的新交叉等温扩增反应体系。以伪狂犬病毒野毒株GZ-WH的基因组DNA为模板进行交叉等温扩增反应，反应条件为65℃恒温60min，同时以水替代核酸模板设置空白对照。反应结束后，将产物用核酸试纸条进行检测，核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条，包括质控区(C)和检测区(T)。

核酸试纸条的结果鉴定方法如下：

①阴性(－)：仅在质控区(C)出现一条条带，在检测区(T)内无红色条带出现。证明所检测的样本没有伪狂犬病毒野毒株感染；

②阳性(+)：出现两条条带。一条位于检测区(T)内，另一条位于质控区(C)内。证明所检测的样本为伪狂犬病毒野毒株感染。

③无效：质控区(C)和检测区(T)内均无条带出现，表明核酸试纸条失效。

五、交叉等温扩增检测方法的特异性、敏感性分析

1.特异性分析

使用伪狂犬病毒野毒株GZ-WH、伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61、猪肾细胞PK-15传代系、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌的基因组DNA为模板检测体系的特异性。反应体系如表2所示，反应条件为步骤3确定的优化条件，使用核酸试纸条对产物进行检测。使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置检测(5min后看结果)，得到的结果如图3所示：以伪狂犬病毒野毒株GZ-WH的基因组DNA为模板的交叉等温扩增反应产物出现两条条带，一条位于检测区(T)内，另一条位于质控区(C)内；以伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61、猪肾细胞PK-15传代系、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌的基因组DNA分别为模板得到交叉引物扩增反应产物，仅在质控区(C)出现一条条带，在检测区(T)内无条带出现。结果显示检测体系的特异性良好，可特异的检测到伪狂犬病毒野毒株。

2.敏感性分析

取浓度为1×10⁵TCID₅₀/ml的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH病毒液200μL并进行DNA提取，吸取1μL DNA依次加入9μL的灭菌纯水进行10倍梯度稀释，各取1μL稀释后样品液进行交叉等温扩增-测流层析检测(反应体系如表2所示，除了模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件)与PCR检测。PCR所使用的引物是F3与B3引物，反应体系如表3所示：

表3PCR反应体系

PCR程序如下：94℃预变性3min；94℃60s，56℃45s，72℃30s为一个循环，运行30个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存。

比较交叉等温扩增-测流层析检测法与PCR琼脂糖凝胶电泳检测方法的敏感性。结果如图4和5所示，交叉等温扩增-测流层析检测法的敏感性与PCR琼脂糖凝胶电泳方法相同，最低可以检测到2TCID₅₀的伪狂犬病毒野毒株GZ-WH的DNA。相比之下，本发明提供的交叉等温扩增-测流层析检测方法敏感性高，操作更加简单(等温反应)，而且用时更短(只需60min)，结果比较直观(肉眼判别)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组，其特征在于，由外部引物F3、外部引物B3、探针引物B2、探针引物B1、交叉引物CPF组成；

外部引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外部引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

交叉引物CPF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

探针引物B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

探针引物B1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组，其特征在于，所述探针引物B2的5’端标记生物素Biotin；探针引物B1的5’端标记FITC。

3.一种检测伪狂犬病毒野毒株的交叉引物扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组和核酸试纸条。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，该全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反应缓冲液、Bst WarmStart^TM DNA聚合酶、甜菜碱溶液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括10×反应缓冲液2.5μL、浓度为8U/μL的Bst WarmStart^TM DNA聚合酶、浓度为10mmol/L的dNTP混合物溶液2.0μL、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液2.5μL、浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液1.0μL、浓度为10μmol/L的交叉引物CPF2.0μL、浓度为10μmol/L的探针引物B2 1.5μL、浓度为10μmol/L的探针引物B11.5μL、浓度为10μmol/L的外部引物F3 1.0μL、浓度为10μmol/L的外部引物B3 1.0μL。

8.权利要求1-2所述的引物组或权利要求3-7任一权利要求所述的试剂盒在检测待测样品是否感染伪狂犬病毒野毒株中的应用。

9.一种检测待测样品是否感染伪狂犬病毒野毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-7任一权利要求所述的试剂盒对待测样品进行交叉等温扩增，得到扩增产物；

2)反应：将得到的产物用核酸检测试纸条检测，5min后观察结果；

3)结果判读：直接肉眼判读，

a)阴性：仅在质控区出现一条条带，在检测区内无条带出现，证明待测样品没有伪狂犬病毒野毒株感染；

b)阳性：出现两条条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明待测样品为伪狂犬病毒野毒株感染；

c)无效：质控区和检测区内均无条带出现，表明核酸试纸条失效。

10.根据权利要求9所述的检测待测样品是否感染伪狂犬病毒野毒株的方法，其特征在于，步骤1)中所述的恒温反应的时间为60min；恒温反应的温度为65℃。