CN114752709A - 一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量pcr检测引物、试剂盒及应用 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量pcr检测引物、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物，所述检测引物如下所示：上游引物PEDV‑F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQID NO.1序列；下游引物PEDV‑R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ IDNO.2序列；同时其用TaqMan探针荧光定量检测法，建立了针对猪流行性腹泻病毒M基因的检测方法，可以有效区分野毒感染该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为猪流行性腹泻的鉴别诊断提供了良好的技术支持。

Description

一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物、试剂 盒及应用
技术领域
本发明属于病毒分子生物学，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物、试剂盒及应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(PEDV)会引起猪接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和脱水为特征，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15-90％。猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)系冠状病毒科冠状病毒属成员，属于Ⅰ类冠状病毒，α冠状病毒属，猪流行性腹泻病毒(PEDV)经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞病变、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引发渗透性腹泻，最终造成掉膘、降低饲料吸收利用率，导致猪的死亡，是影响全球养猪业的最重要病毒之一。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长28kb，有七个开放阅读框，编码4个结构蛋白(纤突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N))和3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)。现有技术中常常由于N蛋白能够参与病毒基因组的转录，能与细胞膜和磷脂结合，促进病毒核心的形成以及病毒RNA的组装，进而利用N蛋白来建立针对PEDV分子生物学诊断技术。专利号为CN103866050A的中国专利公开了“猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物”，其中，具体公开了根据猪流行性腹泻病毒的N基因序列设计引物，通过对荧光定量反应条件的优化，使其具有较好的特异性和重复性，用于PEDV的快速检测。
荧光PCR技术已经广泛应用在各种猪病的诊断中，技术成熟，Taqman探针法荧光PCR技术与染料法荧光PCR相比多了一条探针，特异性更好，应用广泛，通过对不同探针标记不同的发光基团可实现病原多重检测，与传统PCR检测比，检测速度快，敏感性高，不需要开盖电泳检测PCR产物，减少实验室气溶胶污染风险。
PEDV的M蛋白作为一个膜糖蛋白，在PEDV病毒的遗传进化过程中很少发生突变，从而保证宿主识别的一致性，因此M基因具有高度的保守性。本申请通过PEDV不同毒株M基因的序列比对，选取了M基因的中段保守序列设计引物及探针，能够实现最大限度识别PEDV的所有毒株。
发明内容
本发明目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物及应用，其中采用TaqMan探针荧光定量检测法，建立了针对猪流行性腹泻病毒M基因的检测方法，可以有效区分野毒感染该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为猪流行性腹泻的鉴别诊断提供了良好的技术支持。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物，所述检测引物如下所示：
上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；
下游引物PEDV-R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ ID NO.2序列。
本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测试剂盒，包括扩增引物和TaqMan荧光探针；所述扩增引物和特异性TaqMan荧光探针如下所示：
上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；
下游引物PEDV-R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ ID NO.2序列；荧光探针PEDV-P：FAM-TCTGGCCCTGCCCACCACGT-BHQ1，其为SEQ ID NO.3序列，FAM为荧光报告基因，BHQ1为荧光淬灭基因。
进一步的，所述试剂盒反应体系中上下游引物浓度为0.1-1μm，荧光探针浓度为0.1-1μm。
本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测方法，利用上述的试剂盒进行猪流行性腹泻病毒检测。
进一步的，一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测方法，具体包括以下步骤：
(1)反应体系配制：取出PEDV Mix、One Step-RT-qPCR酶、阳性对照和阴性对照，置于室温下完全融解，充分颠倒混匀后短暂离心；按照PEDV Mix和酶系以(11.5×n)μL+(1×n)CL＝(12.5×n)μL的比例计算所需配制反应数，充分混匀，配制成PCR反应液；其中，PEDVMix包括上下游引物、荧光探针、buffer和过滤水；
(2)根据检测样品的数量向每个PCR反应管中加入12.5μL PCR反应液，然后取12.5μL的阴性对照、待检样品RNA、阳性对照分别加入到不同的PCR反应管中，盖紧管盖，将PCR反应管瞬时离心；
(3)荧光PCR操作：将瞬时离心好的PCR管放入荧光PCR检测仪内，采用一步法使逆转录和扩增在同一管中进行，按照如下反应设置：第一阶段，50℃逆转录15min；第二阶段，95℃预变性2.5-3min；第三阶段，93-95℃变性10s，55-60℃延伸30s，共40-45个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的55-60℃延伸时进行，选择FAM荧光检测通道，收集FAM荧光信号；
(4)结果判定：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，同时观察报告基团FAM有无扩增曲线出现。
本发明还提供上述试剂盒在制备猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测的TaqMan实时荧光PCR试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明中通过PEDV不同毒株M基因的序列比对，选取M因的中段保守序列设计通用型的PEDV的引物及探针，能够最大限度识别PEDV的所有毒株，目的片段约为103bp，利用引物及探针设计试剂盒用于猪流行性腹泻病毒的检测，针对通用型的单重的PEDV，Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系，相关系数R2为0.977，利用上述试剂盒进行猪流行性腹泻病毒检测可以有效区分野毒感染，具有良好的特异性、敏感性和重复性，为猪流行性腹泻的鉴别诊断提供了良好的技术支持。
2、本发明中用于检测猪流行性腹泻病毒采用一步法使逆转录和扩增在同一管中进行，采用One Step-RT-qPCR酶，在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险，简化了实验操作，提高了实验效率，同时降低了污染的风险。
附图说明
图1为本发明实施例中TaqMan实时荧光定量PCR的标准曲线图；
图2为本发明实施例中TaqMan实时荧光定量PCR灵敏度验证曲线，图中，1-6分别表示RNA模板浓度为1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、5.0×102copies/μL、1.0×101copies/μL、1.0×100copies/μL；
图3为本发明实施例中TaqMan实时荧光定量PCR的特异性实验结果图。
图4和图5为本发明实例中中TaqMan实时荧光定量PCR的重复性实验结果图。
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明做进一步的说明，在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值；对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因DNA Star软件序列比对结果，利用探针引物设计软件Primer Express5.0设计出一对检测引物和一条探针，所述检测引物和探针序列如下所示：
上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；
下游引物PEDV-R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ ID NO.2序列；
荧光探针PEDV-P：FAM-TCTGGCCCTGCCCACCACGT-BHQ1，其为SEQ ID NO.3序列，FAM为荧光报告基因，BHQ1为荧光淬灭基因。
实施例2
一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测试剂盒，包括扩增引物和TaqMan荧光探针；所述扩增引物和特异性TaqMan荧光探针如下所示：上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；下游引物PEDV-R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ ID NO.2序列；荧光探针PEDV-P：FAM-TCTGGCCCTGCCCACCACGT-BHQ1，其为SEQIDNO.3序列，FAM为荧光报告基因，BHQ1为荧光淬灭基因；
其中，所述试剂盒反应体系中上下游引物浓度为0.1-1μm，荧光探针浓度为0.1-1μm。
实施例3
一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测方法，利用上述的试剂盒进行猪流行性腹泻病毒检测，本实施例中PEDV-M的序列如SEQ ID NO.4所示，具体包括以下步骤：
(1)反应体系配制：取出PEDV Mix、酶系、阳性对照和阴性对照，置于室温下完全融解，充分颠倒混匀后短暂离心；按照PEDV Mix和酶系以(11.5×n)μL+(1×n)μL＝(12.5×n)μL的比例计算所需配制反应数，充分混匀，配制成PCR反应液；其中，PEDV Mix包括上下游引物、荧光探针、buffer和过滤水；
(2)根据检测样品的数量向每个PCR反应管中加入12.5μL PCR反应液，然后取12.5μL的阴性对照、待检样品RNA、阳性对照分别加入到不同的PCR反应管中，盖紧管盖，将PCR反应管瞬时离心；
RNA的提取：本实验方法参照福建佰孟医学科技有限公司的核酸提取或纯化试剂说明书进行；
(3)荧光PCR操作：将瞬时离心好的PCR管放入荧光PCR检测仪内，采用一步法使逆转录和扩增在同一管中进行，按照如下反应设置：第一阶段，50℃逆转录15min；第二阶段，95℃预变性2.5-3min；第三阶段，93-95℃变性10s，55-60℃延伸30s，共40-45个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的55-60℃延伸时进行，选择FAM荧光检测通道，收集FAM荧光信号；
(4)结果判定：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，报告基团FAM有扩增曲线出现的即是变异PEDV，若是无扩增曲线产生，则说明样品中不含PEDV，其中扩增曲线CT值小于35的判断为阳性，CT值大于35而小于40的判断为可疑，需重复实验，第二次CT值仍在这个范围的判断为阳性。
性能测试
1、荧光定量标准曲线的建立
测定纯化后RNA转录本的浓度，利用拷贝数计算公式：拷贝浓度＝[6.023×1023×(浓度ng/μL×10-9)]/碱基数×660，计算出其拷贝数为2.0×106copies/mL，经稀释，以2.0×105、2.0×104、5.0×103、1.25×103copies/mL的标准品为模板进行荧光定量PCR，得到检测PEDV的扩增动力学曲线，如图1所示，计出相应的标准曲线；如图2所示，PEDV荧光定量PCR标准品的浓度在2.0×106～1.25×103copies/mL范围内具有良好的线性，Y＝-3.4832×lg(x)+41.957，相关系数R2＝0.9769。
2、敏感性实验
将标准品按照1.0×105、1.0×104、1.0×103、5.0×102、1.0×101、1.0×100copies/μL分别进行稀释，进行荧光定量PCR反应，如图2结果显示，荧光定量PCR的最低检测量为10copise/μL，因此本发明建立的荧光定量PCR具有较高的敏感性。
3、特异性实验
以非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2病毒、猪细小病毒的阳性样品作为模板，用本发明提供的引物及探针进行荧光定量PCR扩增，结果如图4所示，非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2病毒、猪细小病毒的荧光定量PCR均未有扩增曲线，说明本实验所建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性。
4、染料法与本发明探针检测进行比较
采集猪粪便样品和肛门拭子样品，用常规染料法与本发明的试剂盒和检测方法对所采集的猪粪便样品肛门拭子样品进行检测，具体方法参见RT-PCR试剂盒操作方法说明进行，检测结果如下表1至表2所示：
表1染料法和本发明探针法检测肛门拭子样品CT值以及针对探针法CT值的病毒载量
Figure BDA0003632702320000061
Figure BDA0003632702320000071
表2染料法和本发明探针法检测粪便样品CT值以及针对探针法CT值的病毒载量
Figure BDA0003632702320000072
Figure BDA0003632702320000081
其中，1A-30A、1B-30B为样本编号；从表1和表2中可以看出，使用传统染料法和本发明的探针法对猪的肛门拭子样品和粪便样品的检测，比较其CT值，其中使用探针法的CT值普遍小于染料法的CT值，说明本发明提供的探针法在扩增效率和灵敏度上都要优于染料法。
5、重复性验证
选取统一标准品的质粒进行稀释，并选择1.0×106和1.0×103两个稀释梯度，每个梯度十个重复，以验证该检测方法的重复性效果，如表3所示：
Figure BDA0003632702320000082
Figure BDA0003632702320000091
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 福建佰孟医学科技有限公司
<120> 一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物、试剂盒及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgctaggct cgcargtac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggacgacra atgcgtgggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctggccctg cccaccacgt 20
<210> 4
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtctaacg gttctattcc cgttgatgag gtgattgaac accttagaaa ctggaatttc 60
acatggaata tcatactgac gatactactt gtagtgcttc agtatggcca ttacaagtac 120
tctgcgttct tgtatggtgt caagatggct attctatgga tactttggcc tcttgtgctg 180
gcactttcac tttttgatgc atgggctagc tttcaggtca actgggtctt ttttgctttc 240
agcatcctta tggcttgcat cactcttatg ctgtggataa tgtactttgt caatagcatt 300
cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg tctttcaatc ctgaaacaga cgcgcttctc 360
actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta 420
acgctaacac tccttagtgg tacattgctt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta 480
caggtaagtc aattacctaa tttcgtcaca gtcgccaagg ccactacaac aattgtctat 540
ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctagcactg gttgggcttt ctatgtccgg 600
tcaaaacacg gcgactactc agctgtgagt aatccgagtg cggttctcac agatagtgag 660
aaagtgcttc atttagtcta a 681

Claims (6)

1.一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述检测引物如下所示：
上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；
下游引物PEDV-R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ ID NO.2序列。
2.一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的检测引物和TaqMan荧光探针；所述特异性TaqMan荧光探针如下所示：
荧光探针PEDV-P：FAM-TCTGGCCCTGCCCACCACGT-BHQ1，其为SEQ ID NO.3序列，FAM为荧光报告基因，BHQ1为荧光淬灭基因。
3.如权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒反应体系中上下游引物浓度为0.1-1μm，荧光探针浓度为0.1-1μm。
4.一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测方法，其特征在于：利用上述权利要求2至3任一所述的试剂盒进行猪流行性腹泻病毒检测。
5.如权利要求4所述的一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)反应体系配制：取出PEDV Mix、One Step-RT-qPCR酶、阳性对照和阴性对照，置于室温下完全融解，充分颠倒混匀后短暂离心；按照PEDV Mix和酶系以(11.5×n)μL+(1×n)μL＝(12.5×n)μL的比例计算所需配制反应数，充分混匀，配制成PCR反应液；其中，PEDV Mix包括上下游引物、荧光探针、buffer和过滤水；
(2)根据检测样品的数量向每个PCR反应管中加入12.5μL PCR反应液，然后取12.5μL的阴性对照、待检样品RNA、阳性对照分别加入到不同的PCR反应管中，盖紧管盖，将PCR反应管瞬时离心；
(3)荧光PCR操作：将瞬时离心好的PCR管放入荧光PCR检测仪内，采用一步法使逆转录和扩增在同一管中进行，按照如下反应设置：第一阶段，50℃逆转录15min；第二阶段，95℃预变性2.5-3min；第三阶段，93-95℃变性10s，55-60℃延伸30s，共40-45个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的55-60℃延伸时进行，选择FAM荧光检测通道，收集FAM荧光信号；
(4)结果判定：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，同时观察报告基团FAM有无扩增曲线出现。
6.如权利要求2所述的的试剂盒在制备猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测的TaqMan实时荧光PCR试剂中的用途。
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