CN113493804A - 猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法 - Google Patents

猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法，将猫杯状病毒DL19株基因组分为两段连接到改造好的pBluescript II SK(+)载体，构建了可作为反向遗传平台猫杯状病毒DL19株全长感染性克隆质粒，为后续病毒拯救、基因组结构研究奠定基础。

Description

猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法
技术领域
本申请属于分子生物学领域和兽医领域，具体地，本申请提供了一种猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法。
背景技术
猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)曾属于小RNA病毒科杯状病毒属，1981年国际病毒分类委员(ICTV)将其单独列为杯状病毒科。目前，杯状病毒科由札幌病毒属、兔病毒属、水疱疹病毒属、纽伯病毒属以及诺如病毒属5个属构成。FCV于1957年被首次分离，主要感染家猫，也可以感染狮、虎、豹等猫科动物，对猫科动物的健康造成一定威胁。 FCV在1998年前以一种非致病性的形式存多年，死亡率偏低。1998年至今，FCV导致的具有极高死亡率的恶性全身性系统疾病在意大利，法国和德国等国家被相继报道，此类毒株被命名为FCV VSD株。FCV VSD株感染主要引起皮下水肿、口腔溃疡、跛行、耳廓、足垫等皮肤不同程度的溃烂等临床症状，死亡率较高。2009年Martino等从患有肠炎的犬粪便中分离到FCV，进一步证实FCV具有跨物种传播的风险。
RNA病毒的反向遗传学研究的核心是构建病毒的感染性克隆，即病毒的人工构建。不同病毒遗传物质的性质和病毒基因组转化为病毒mRNA的途径是不同的，通常病毒反向遗传平台构建常以此选择复制机制以及表达策略。目前FCV反向遗传平台研究中，都是根据FCV单一的限制性核酸酶酶切识别位点进行全基因组克隆，然而传统的PCR克隆耗时耗费力，过程相对复杂。
发明内容
针对以上问题，申请人对pBluescript II SK(+)进行修饰，在基因组5’末端和3’末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子、FCV(DL19)株5’UTR、FCV(DL19)株3′UTR、 poly(A)尾以及丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)序列。构建了表达绿色荧光蛋白重组质粒，将重组质粒转染BHK-T7细胞系中，发现绿色荧光蛋白可良好表达。以分离到的国内流行株FCV(DL19)株为研究对象，将其基因组分为4段克隆，利用融合PCR将其全基因组融合为2段后依次克隆到改造好的pBluescript II SK(+)质粒上，并在4505bp处引入遗传标记位点，构建FCV(DL19)株全长cDNA重组质粒。测序显示，重组质粒构建成功。为下一步FCV拯救及基因组结构、新型疫苗、RNA病毒载体等方面研究奠定基础。
一方面，本申请提供了一种猫杯状病毒反向遗传平台的制备方法，其特征在于，包括将猫杯状病毒全基因组连接到改造后的pBluescript II SK(+)载体上。
进一步地，所述改造后的pBluescript II SK(+)载体在5’末端和3’末端引入T7RNA 聚合酶启动子、猫杯状病毒5’UTR、猫杯状病毒3′UTR、poly A尾以及丁型肝炎核酶序列。
进一步地，所述猫杯状病毒全基因组为猫杯状病毒DL19株的全基因组。
进一步地，所述制备方法还包括使用核酸序列为SEQ ID NO.1-8的四对引物扩增全基因组cDNA；并对相应扩增产物进行融合PCR的步骤。
进一步地，所述制备方法包括还包括将融合PCR获得的插入片段无缝克隆连接至改造后的pBluescript II SK(+)载体上的步骤。
进一步地，将融合PCR获得的插入片段无缝克隆连接至改造后的pBluescript IISK(+) 载体上后获得的猫杯状病毒感染性克隆序列为SEQ ID NO.9。
另一方面，本申请还提供了按照上述方法制备的猫杯状病毒反向遗传平台，其为猫杯状病毒感染性克隆。
进一步地，所述猫杯状病毒感染性克隆序列为SEQ ID NO.9。
另一方面，本申请还提供了上述猫杯状病毒反向遗传平台在猫杯状病毒拯救、基因组结构、疫苗、病毒载体研究方面的应用。
本申请中的方法中所用的PCR试剂不局限于本申请中记载过的种类，本领域技术人员可以根据《分子克隆》等工具书自行配置或者购买市售产品。
本申请的猫杯状病毒反向遗传平台可用于以已知方法进行病毒拯救、基因组结构、疫苗、病毒载体研究，可也用于反向遗传平台其他的已知和研究中的应用。
附图说明
图1为FCV(DL19)株全长感染性克隆构建策略；
图2为eGFP重组载体转染结果(A:转染组；B:对照组)；
图3为FCV(DL19)全长RT-PCR结果电泳图(M:DL-5000DNA相对分子质量标准； 1:M:DL-5000DNA Marker；1:g1(2.5kb)；2:g2(2kb)；g3(1.6kb)；g4(1.5kb)M:DL-5000 DNAMarker；1:g1(2.5kb)；2:g2(2kb)；g3(1.6kb)；g4(1.5kb))；
图4为FCV(DL19)In-Fusion PCR结果电泳图(M:DL-5000DNA相对分子质量标准；1:G1；2:G2)。
具体实施方式
材料和试剂
毒株、载体与质粒：
质粒pBluescript II SK(+)和F81细胞由本实验室保存。
主要试剂、耗材及仪器：
试剂：XholⅠ、EcoRⅠ限制性核酸内切酶为Neb产品，购自北京宝林科生物科技有限公司。
实施例1序列分析及引物的设计
根据FCV(DL19)株序列，使用DNA MAN和DNA Star进行引物设计，利用在线生物学软件NovoPro(https://www.novopro.cn/tools/rest_summary.html)对FCV(DL19株)序列中限制性酶切位点进行分析，选取4505处XholⅠ酶切位点，进行同源臂引物设计。引物由北京华大生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。
表1 FCV基因组引物序列
Figure RE-GDA0003189175160000031
Figure RE-GDA0003189175160000041
实施例2病毒总RNA的提取及cDNA的获取
病毒总RNA的提取按照Trizol Reagent说明书进行，具体步骤如下：
1)将存于-80℃冰箱的样品取出，待样品完全融化恢复至室温；
2)按照200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，旋涡震荡15s使样品充分混匀，在室温条件下静置3min；
3)4℃，12,000rpm离心15min后，样品分为三层，缓慢的吸取最上层含有RNA的水相(大约450μL)置于新的1.5mL EP管内，1：1加入预冷的异丙醇，将液体温和混匀后在冰上放置10min；
5)取出混匀的液体在4℃12,000rpm的条件下离心10min，弃去上清后，可在EP管壁和管底发现凝胶沉淀；
6)沿EP管壁加入1mL 75％酒精(DEPC水配制)，下上轻轻颠倒，弃上清液；
7)4℃12,000rpm离心5min，用移液器尽量吸弃管底液体(勿触及沉淀)，开盖室温干燥 5min；
8)每个样品加入50μL的DEPC水，充分混匀；
取参考TIANGEN反转录试剂盒说明书，以获得RNA为模板进行反转录，20μL反转录反应体系及程序如下：
5×FastKing-RT SuperMix 4μL
RNA 2μL
RNase-Free ddH2O 14μL
反转录程序：42℃，15min，95℃，3min。cDNA置于-20℃保存备用。
实施例3表达eGFP重组载体构建
为了进一步验证pBluescript II SK(+)修饰后载体系统是否可用，在pBluescript II SK (+)修饰载体FCV 5’UTR后插入eGFP全基因组，构建表达eGFP重组载体，进行拯救系统微基因组系统验证。
表达eGFP重组载体转染：
将BHK-T7接种6孔细胞板，待细胞铺满孔底80％左右时，使用Lipofectamine 2000转染构建好的pBluescript II SK(+)-eGFP，转染后48h在荧光显微镜下观察eGFP基因表达情况。
使用Lipofectamine 2000转染构建好的pBluescript II SK(+)-eGFP，转染后48h，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况，如图2所示，绿色荧光蛋白报告基因表达良好。
实施例4 pBluescript II SK(+)-G1G2的构建
FCV感染性克隆构建策略：
将FCV(DL19)株全基因组分为G1、G2连接到改造后的pBluescript II SK(+)载体上。构建策略如图1所示：
pBluescript II SK(+)-G1G2的构建：
FCV(DL19)株P1～P4片段的获得：
用表1中4对引物扩增出FCV(DL19)株相应目的片段，50μL反应体系如下：
Figure RE-GDA0003189175160000051
PCR反应程序：95℃，3min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5 min。
分别扩增的g1、g2、g3和g4片段，经过1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示，扩出大小为2.5kb、2kb、1.6kb、1.5kb的目的片段，片段大小符合预期，如图3所示。
FCV(DL19株)基因组PCR产物的回收和纯化：
操作步骤参考AXYGEN通用型DNA胶回收试剂盒说明书。
In-Fusion PCR：
通过以上反应分别获得FCV(DL19株)基因组的g1～g4片段，分别以g1、g2和g3、 g4片段为模板，进行融合PCR，扩增片段G1和G2。50μL反应体系如下：
Figure RE-GDA0003189175160000061
g1、g2、g3和g4 4个片段进行胶回收，经In-Fusion PCR获得G1、G2片段，如图 4-3所示。
pBluescript II SK(+)酶切及胶回收纯化
将改造后的质粒按照NEB XholⅠ酶说明书进行酶切，50μL酶切体系如下：
pBluescript II SK(+) 1ug
XholⅠ 1μL
RNase-Free ddH2O up to 50μL
酶切程序：37℃，2h；65℃，20min。
胶回收纯化按DNA小量凝胶回收试剂盒说明进行，。胶回收产物分别命名为FCV(DL19)株-G1和FCV(DL19)株-G2。
pBluescript II SK(+)-G1的构建：
按照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit说明书将FCV(DL19)株-G1片段无缝克隆连接到酶切胶回收的pBluescript II SK(+)载体上。20μL无缝克隆体系反应体系如下：
Figure RE-GDA0003189175160000071
使用移液器缓慢吸打混匀，短暂离心后置于PCR仪进行后续反应。反应程序：50℃，15min；结束后立即取出，并置于冰上冷却。
重组产物的转化，操作过程参考ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit说明书。提取单菌落，进行菌液PCR鉴定。25μL菌液PCR反应体系及反应程序如下：
Figure RE-GDA0003189175160000072
菌液PCR反应程序：95℃，3min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
将菌液PCR鉴定阳性的菌液送至金唯智生物科技(北京)有限公司进行测序鉴定，测序结果正确的质粒命名pBluescript II SK(+)-G1。
将测序正确的质粒进行质粒提取，操作步骤参照TIANGEN天根无内毒素质粒大提试剂盒说明书进行。
pBluescript II SK(+)-G1G2的构建：
pBluescript II SK(+)-G1经XholⅠ酶切后胶回收，将FCV(DL19)株-G2片段以无缝克隆方式连接到pBluescript II SK(+)-G1，进行转化。无缝克隆反应体系、条件及操作步骤同上。
将FCV(DL19)株基因组分为G1和G2 2个片段利用无缝克隆的方法连接到修饰好的pBluescript II SK(+)载体上，经PCR鉴定及测序，结果显示pBluescript II SK(+)-G1G2的构建成功。
结论：
本申请的研究首先对pBluescript II SK(+)进行修饰改造，在基因组5’末端和3’末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子、FCV(DL19)株5’UTR、FCV(DL19)株3’UTR、poly(A)尾以及丁型肝炎核酶(HdvRz)序列。为了验证改造后的载体是否可正常发挥作用，采用无缝克隆的方法构建了表达eGFP重组载体，将重组载体转染BHK-T7细胞系，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因表达良好，经微基因组系统验证该拯救系统有效。
赵艳丽、李伍新、左智敏等在构建FCV反向遗传平台研究中，都是根据FCV单一的限制性核酸酶酶切识别位点进行全基因组克隆，然而传统的PCR克隆耗时耗费力，过程相对复杂。本实验采用了无缝克隆技术，简化了载体的构建过程，快速、高效获得构建重组质粒。本章研究将FCV(DL19)株基因组分为两段连接到改造好的pBluescript II SK (+)载体，构建了FCV(DL19)株全长感染性克隆质粒，为后续病毒拯救、基因组结构研究奠定基础。

Claims (9)

1.一种猫杯状病毒反向遗传平台的制备方法，其特征在于，包括将猫杯状病毒全基因组连接到改造后的pBluescript II SK(+)载体上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述改造后的pBluescript II SK(+)载体在5’末端和3’末端引入T7 RNA聚合酶启动子、猫杯状病毒5’UTR、猫杯状病毒3′UTR、poly A尾以及丁型肝炎病毒核酶序列。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述猫杯状病毒全基因组为猫杯状病毒DL19株的全基因组。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中所述制备方法还包括使用核酸序列为SEQ ID NO.1-8的四对引物扩增全基因组cDNA；并对相应扩增产物进行融合PCR的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，所述制备方法包括还包括将融合PCR获得的插入片段无缝克隆连接至改造后的pBluescript II SK(+)载体上的步骤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中将融合PCR获得的插入片段无缝克隆连接至改造后的pBluescript II SK(+)载体上后获得的猫杯状病毒感染性克隆序列为SEQ IDNO.9。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的猫杯状病毒反向遗传平台，其为猫杯状病毒感染性克隆。
8.根据权利要求7所述的猫杯状病毒反向遗传平台，其中所述猫杯状病毒感染性克隆序列为SEQ ID NO.9。
9.根据权利要求7或8所述的猫杯状病毒反向遗传平台在猫杯状病毒拯救、基因组结构、疫苗、病毒载体研究方面的应用。
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