EA010924B1

EA010924B1 - Способ получения партий рекомбинантного аденовируса и используемые для этого пакующие клетки

Info

Publication number: EA010924B1
Application number: EA200600693A
Authority: EA
Inventors: Роналд Вогелс; Мензо Янс Эмко Хавенга; Давид А.Т.М. Зюэйдгест
Original assignee: Круселл Холланд Б.В.
Priority date: 2003-10-02
Filing date: 2004-10-04
Publication date: 2008-12-30
Also published as: HK1084974A1; US20060183232A1; DK1670925T3; JP4749334B2; EP1670925B1; IL227543A; WO2005033320A1; US8114637B2; HRP20130616T1; KR101203817B1; EA200600693A1; CN102174536B; SI1670925T1; CA2538025C; CN102174536A; CN1863918A; CN1863918B; NZ545501A; EP1670925A1; AU2004278517A1

Abstract

В отсутствие значительного перекрывания последовательностей между рекомбинантным аденовирусным вектором и геномом пакующей клетки зависимые от хелпера содержащие Е1 частицы (HDEP) могут формироваться с низкой частотой. Изобретение относится к средствам и способам уменьшения или предотвращения образования HDEP. Для этой цели предоставлены новые пакующие клетки и способы их получения.

Description

Изобретение относится к области молекулярной и клеточной биологии, более конкретно, к пакующим клеткам и их применению для получения партий рекомбинантного аденовируса.

Предпосылки изобретения

Дефектные по репликации рекомбинантные аденовирусы могут использоваться, например, в генотерапии и для целей вакцинации. Как правило, у них отсутствует область Е1 аденовируса и, следовательно, они размножаются в комплементирующих клетках, содержащих последовательности Е1. Пакующие клетки обладают всей информацией, необходимой для репликации вектора, который упаковывается в клетках с получением рекомбинантных вирусных частиц. Примером пакующей клетки является клетка 293, содержащая нуклеотиды 1-4344 генома аденовируса 5 (Ьош8 е! а1., 1997), включающие в себя 5' инвертированный концевой повтор (ПК), сигнал упаковки, кодирующие последовательности Е1А и Е1В и кодирующие последовательности р1Х.

Совпадение последовательностей аденовируса в пакующей клетке и вектора может приводить к гомологичной рекомбинации между этими последовательностями, что приводит к получению способного к репликации аденовируса (КСА) (БосйшиНег е! а1., 1994). Эта проблема была решена посредством применения системы упаковки, состоящей из клеточной линии и вектора, которые подобраны таким образом, что не содержат таких совпадающих последовательностей (Еа11аих е! а1., 1998; патент США 5994128). В частности, одним из примеров применяемой клеточной линии в таких случаях является клеточная линия РЕК.С6® (патент США 5994128; №сйо18 е! а1., 2002).

Недавно было опубликовано, что при применении клеток РЕК.С6® в сочетании с вектором, попрежнему содержащим последовательность 177 п.о., гомологичную последовательностям Е1 в геноме РЕК.С6®, единичное событие кроссинговера может с небольшой частотой привести к образованию зависимого от хелперной последовательности, способного к репликации вируса (Мигакат1 е! а1., 2002). Полученный атипичный КСА обозначили как зависимую от хелпера, содержащую Е1 частицу (НОЕР). Как и следовало ожидать, возникновения частиц такого типа избегали при применении вектора с отсутствием перекрывания последовательности с последовательностями Е1 в геноме клеток РЕК.С6® (Мигакат1 е! а1., 2002).

Однако неожиданно было обнаружено, что при использовании системы подобранных вектора и клеток РЕК.С6® в некоторых партиях рекомбинантного аденовируса с низкой частотой происходит загрязнение частицами, которые могут вызывать цитопатологический эффект (СРЕ) в клетках с отсутствующими последовательностями Е1. Частица зависит от хелпера и содержит последовательности Е1, а следовательно также представляет собой НОЕР. Эта НОЕР образуется в отсутствие существенной гомологии между вектором и пакующей клеткой (см. Митакат1 е! а1., 2004). Хотя контролирующие органы считают, что КСА может вызвать трудности при клиническом применении, и визуализация КСА в партиях также осложнена (υδΌΗΗδ, ΕΌΑ, СВЕК. Ошбаисе Еог 1пйи§!гу, Ошбаисе Тот йитап котайс се11 Шегару аий депе !йегару, Магсй 1998), аспекты безопасности НОЕР не ясны. НОЕР дефектна по репликации, так как у нее отсутствуют необходимые для автономной репликации вирусные гены и, следовательно, НОЕР не будет распространяться в организме хозяина. Однако нельзя исключить теоретическую возможность того, что присутствие рекомбинантного вектора или аденовируса дикого типа в той же клетке может вызвать восстановление и распространение НОЕР. Следовательно, существует по меньшей мере потенциальная необходимость в средствах и способах для профилактики образования содержащих Е1 частиц при получении партий частиц рекомбинантных аденовирусов. Для этой цели в настоящем изобретении предоставлены способы получения новых клеточных линий, новые клеточные линии и их применение для получения партий рекомбинантных аденовирусных векторов без КСА и НОЕР.

Описание фигур

Фиг. 1 - карта р1О.Е1А;

фиг. 2 - карта р1О.Е1АВ21;

фиг. 3 - карта рЕ1 В;

фиг. 4 - карта рСС.Е1А;

фиг. 5 - карта рСС.Е1АВ21;

фиг. 6 - карта рСС101;

фиг. 7 - карта рСС105;

фиг. 8 - карта рСС.55Ксо1;

фиг. 9 - карта р1О.Е1В;

фиг. 10 - карта рСС.Е1Всо1;

фиг. 11 - карта рЕС.Е1В;

фиг. 12 - карта р8С.55К;

фиг. 13 - пример дизайна макромолекул, которые могут использоваться для трансформации первичных клеток.

I: схематическое представление отдельного космидного вектора с кодирующими областями белков Е1А и Е1В (А и В, соответственно), фланкированных спейсерной ДНК. КЕ = участок распознавания ре

- 1 010924 стрикционного фермента, не представленный в спейсерной ДНК или последовательностях Е1.

II: схематическое представление двух отдельных нуклеиновых кислот (например, плазмиды или космидного вектора), несущих кодирующие области или Е1А (А) , или Е1В (В) , фланкированные спейсерной ДНК.

III: Ситуация, которая может произойти после трансформации и интеграции в геном первичной клетки-хозяина молекулы I или двух молекул II. В геноме хозяина вставка состоит из области Е1А и области Е1В, разделенных спейсерной ДНК и второй копии данного фрагмента/данных фрагментов в инвертированной ориентации. 1: соединение между инвертированным повтором. Если в рекомбинантном аденовирусе часть таких последовательностей (указано стрелками) рекомбинирует, то геном становится слишком большим для упаковки. ПК: инвертированный концевой повтор, Ф: сигнал упаковки, Н: фрагмент, вставленный в рекомбинантный аденовирус, содержащий здесь последовательности концевых повторов. Хотя присутствие инвертированного повтора может оказать помощь в необходимой далее стадии удаления из вирусного генома других последовательностей, тем не менее присутствие последовательности инвертированного повтора приводит геном вируса к удвоению в виде зеркального отображения левого конца рекомбинированного вируса в течение репликации и образует геном (удвоенный фрагмент, ΌΕ), который опять является слишком большим для упаковки из-за спейсерной ДНК.

Фиг. 14 - карта рЮ.Е1А.Е1В;

фиг. 15 - карта рСС200; фиг. 16 - карта рСС205; фиг. 17 - карта рйу§44;

фиг. 18 - карта р44-1.ссЕ1А;

фиг. 19- Вестерн-блоты белковых лизатов полученных клеточных линий. Дорожки: 1: НЕК01-В-71, 2: НЕК01-Н-86, 3: НЕК01-Н-87, 4: НЕК01-Н-88, 5: НЕК01-Н-89, б: НЕК01-В-90, 7: клетки НЕК01 рп06, 8: клетки РЕК.С6;

фиг. 20 - демонстрация комплементации аденовирусных векторов с делецией Е1 с трансформированными клеточными клонами. -: отрицательный контроль; МОЕ: средняя флуоресценция; В-71, В-90, Н86, Н-87, Н-88, Н-89: полученные трансформированные клеточные клоны.

Фиг. 21 - схематический обзор конструкций АЙ5.Е1, используемых для трансфекции в примере 3. Указаны участки рестрикции, применяемые для расщепления геномной ДНК и для получения фрагментов-зондов. Фрагменты ДНК Е1А и Е1 В искусственно связаны нуклеотидом, с нумерацией, начиная от 5'-конца содержащего Е1А фрагмента.

Фиг. 22: Схематическое представление некоторых вариантов осуществления изобретения (без соблюдения масштаба).

Регулирующие последовательности (такие как промоторы и сигналы ро1уА) не показаны.

A. Природная конфигурация области Е1 генома аденовируса: за Е1А следует Е1В, состоящий из Е1В-19К и Е1В-55К. Между Е1А и Е1В отсутствует спейсерная последовательность. Пакующие клетки предшествующей области сконструированы путем введения ДНК в данной конфигурации, и, следовательно, также несут в своем геноме область Е1 в данной конфигурации.

B. Две простейшие из возможных конфигураций по настоящему изобретению, где в области Е1 находится спейсер (или балласт). 1. Балласт вводили между Е1А и Е1В-19К. 2. Балласт вводили между Е1В-19К и Е1В-55К. Основной причиной является увеличение расстояния между Е1А, Е1В-19К и Е1В55К по сравнению с природным положением для уменьшения вероятности или полного предотвращения одновременного попадания данных трех открытых рамок считывания в одну аденовирусную частицу (предотвращение КСА и НЙЕР). Для получения клеточной линии по изобретению балласт должен состоять по меньшей мере из 4 т.п.н., где указанная клетка, содержащая в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е1А и Е1В-55К и Е1В-19К, характеризуется тем, что в указанной клетке отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1А и обоих Е1В в указанном геноме разделены менее чем 4 т.п.н. Порядок открытых рамок считывания не имеет значения, поскольку все они присутствуют в геноме так, чтобы экспрессировать Е1А, Е1В-19К и Е1В-55К. Таким образом, порядок может быть Е1А-Е1В/19к-Е1В/55к, Е1В/19кЕ1В/55к-Е1А, Е1В/55к-Е1В/19к-Е1А, Е1В/55к-Е1А-Е1В/19к или Е1В19к-Е1А-Е1В55к. Если Е1В/19к и Е1В/55к расположены рядом, то они могут находиться в одной транскрипционной единице или в отдельных транскрипционных единицах, это не важно для настоящего изобретения. Обе конфигурации (1 и 2) способны образовывать клеточные линии, которые удовлетворяют критериям изобретения. При длине балласта по меньшей мере 6, 8, 10, 15 или 34,5 т.п.н. могут быть получены клетки по изобретению со всеми тремя открытыми рамками считывания, но с отсутствующими участками последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1 А и обоих Е1 В в их геноме разделены менее чем 6, 8, 10, 15 или 34,5 т.п.н. Это означает, что когда один фрагмент, содержащий одновременно Е1А + Е1В-19К + Е1В-55К, должен происходить из генома полученных клеток, то данный фрагмент должен состоять по меньшей мере из 7 т.п.н. (балласт из 4 т.п.н.), 9 т.п.н. (балласт из 6 т.п.н.), и тому подобное по меньшей мере до 37,5 т.п.н. (балласт из 34,5 т.п.н.), в отличие от ситуации А, когда последовательности можно найти во фрагменте длиной только 3 т.п.н. генома пакующих клеток, получен

- 2 010924 ных с такими конструкциями (открытые рамки считывания Е1А + Е1В-19К + Е1В-55К вместе содержат приблизительно 3 т.п.н.).

С. Дополнение к варианту В: так как фрагменты, показанные в В, могут интегрировать, примыкая друг к другу, балласт в предпочтительных вариантах осуществления изобретения также может располагаться перед Е1А и/или после Е1В (предотвращает непосредственную близость Е1В первого повтора с Е1А второго повтора). Показан геном полученной пакующей клетки, в которой присутствуют две копии области Е1 вместе с балластной ДНК при интеграции с примыканием друг к другу в тандемный повтор. Эти пакующие клетки по изобретению несут в своем геноме интегрированные Е1А и Е1В-19К и Е1В55К, но не содержат в своем геноме участков нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1А и обоих Е1В разделены менее чем 4 т.п.н., и т.д., в зависимости от длин балласта (который должен в данном примере представлять собой по меньшей мере 4 т.п.н. между Е1А и Е1В-19К (номер 1) или между Е1В-19К и Е1В-55К (номер 2), и по меньшей мере 2 т.п.н. вверх от Е1А и 2 т.п.н. вниз от Е1В-55К (вместе составляющих 4 т.п.н. при интеграции в непосредственной близости).

Описание изобретения

В изобретении описаны способы получения пакующих клеток, содержащих аденовирусные последовательности Е1А и Е1В, где кодирующие области Е1А и по меньшей мере одного из Е1В в геноме клетки отделены друг от друга. Для этой цели предоставлены по меньшей мере три варианта осуществления. В первом варианте осуществления Е1 А и Е1 В можно вводить в клетку-предшественника в различные моменты времени, уменьшая шанс совместной интеграции Е1А и Е1 В в одном и том же хромосомном положении. Во втором варианте осуществления шансы совместной интеграции в том же самом локусе уменьшают посредством введения кодирующих последовательностей Е1 А и Е1 В в клеткупредшественника посредством двух разных молекул, у которых отсутствуют перекрывающиеся последовательности, которые в ином случае могут приводить к гомологичной рекомбинации между данными последовательностями. В третьем варианте осуществления кодирующие области Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В вводят посредством молекулы нуклеиновой кислоты, в которой данные последовательности разделены заданным расстоянием. Должно быть понятным, что в третьем варианте осуществления вместо одной молекулы нуклеиновой кислоты также можно ввести больше молекул нуклеиновых кислот, которые удовлетворяют условию, что кодирующие области Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В, разделены заданным расстоянием, если две или более молекул будут образовывать одну молекулу, например, посредством лигирования, рекомбинации и тому подобное. Полученные в результате пакующие клетки характеризуются тем, что кодирующие области Е1 А и обоих Е1 В находятся на расстоянии друг от друга и, следовательно, шансы того, что кодирующие последовательности Е1 А и обоих Е1 В вместе включатся в геном рекомбинантного аденовируса, размножающегося в таких пакующих клетках, снижены.

Изобретение относится к способу получения клетки, способной к комплементации аденовирусных векторов в отсутствие Е1, без получения зависимых от хелпера, содержащих Е1 частиц, предусматривающему стадии: а) введения в предшественник или клетку-прародитель последовательности(ей) нуклеиновой кислоты, кодирующих функциональные гены Е1А и функциональные гены Е1В, или если клетка-предшественник уже содержит один из функциональных генов Е1А или Е1В, другие функциональные гены Е1А и Е1В; и Ь) отбор или идентификация клеток с приобретенными Е1А и Е1В в хромосомной конфигурации, предотвращающей формирование зависимых от хелпера содержащих Е1 частиц, когда клетки применяют для комплементации рекомбинантного аденовирусного вектора с отсутствием одного или нескольких функциональных генов Е1, где у указанного вектора отсутствуют последовательности нуклеиновой кислоты, обладающие значительным перекрыванием с расположенной на хромосоме последовательностью Е1, которое, в ином случае, может приводить к гомологичной рекомбинации.

В одном из аспектов изобретение относится к способу получения клетки, несущей в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е1А и Е1В-19К и Е1В-55К, где последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие указанные последовательности вводят в клетку-предшественник, где способ отличается тем, что а) в клетку-предшественник вводят по меньшей мере две молекулы нуклеиновой кислоты, совместно содержащие указанные последовательности, где указанные кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В находятся на различных молекулах нуклеиновой кислоты, которые вводят в клетку-предшественник в различные моменты времени и где указанная клетка-предшественник не является клеткой почки детеныша крысы; или Ь) в клетку-предшественник вводят молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую последовательность Е1 А, и молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующие последовательности Е1 В, где у указанных молекул нуклеиновой кислоты отсутствует существенное перекрывание, которое в ином случае могло бы приводить к гомологической рекомбинации между указанными по меньшей мере двумя молекулами; или с) указанные последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующие последовательности Е1А и по меньшей мере одного из Е1В разделены по меньшей мере 4 т.п.н. на одной молекуле нуклеиновой кислоты или на двух или более молекулах нуклеиновой кислоты, когда они могут формировать одну молекулу нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления с) указанные последовательности разделены по меньшей мере 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 34,5

- 3 010924

т.п.н. или более. Предпочтительно разделяющие последовательности не являются последовательностями Е1, так что интеграция обеих экспрессионных кассет Е1А и Е1В вместе в один вирусный геном представляется очень маловероятной или невозможной. Альтернативно, когда последовательности Е1А и по меньшей мере одного из Е1В разделены посредством 0-15 т.п.н., можно применять скрининг на отсутствие инвертированных повторов последовательностей Е1 в полученных клетках для выбора клеток, где возможность получения ΗΌΕΡ при размножении рекомбинантного аденовируса в полученных клетках уменьшена или отсутствует. Изобретение также относится к клеткам, полученным способом по изобретению. Кроме того, изобретение относится к клеткам, содержащим в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е1А и Е1В-55К и Е1В-19К, характеризующиеся тем, что в указанных клетках отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1А и обоих Е1В в указанном геноме разделены менее чем 4 т.п.н. Предпочтительно, в указанных клетках отсутствуют последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1А и обоих Е1В в указанном геноме разделены менее чем 10 т.п.н., более предпочтительно в указанных клетках отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1А и обоих Е1 В в указанном геноме разделены менее чем 34,5 т.п.н.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения клеток, содержащих аденовирусные последовательности Е1, где указанные последовательности Е1 включают кодирующие последовательности Е1 А и Е1 В, отличающемуся тем, что указанный способ предусматривает стадию отбора клеток с отсутствием инвертированных повторов, содержащих указанные последовательности Е1. Кроме того, изобретение относится к клеткам, содержащим в своем геноме аденовирусные последовательности Е1, где указанные последовательности Е1 включают кодирующие последовательности Е1 А и Е1 В, отличающимся тем, что указанные последовательности Е1 не представлены в указанном геноме в форме инвертированных повторов. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные клетки содержат в своем геноме по меньшей мере две копии указанных аденовирусных последовательностей, которые могут находиться на одной и той же хромосоме. В другом варианте осуществления указанные клетки содержат в своем геноме одну копию указанных последовательностей Е1, и у них в геноме дополнительно отсутствуют последовательности, кодирующие (функциональный) р1Х аденовируса.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения партии рекомбинантного аденовируса с делецией в области Е1, предусматривающему стадии а) введения указанного рекомбинантного аденовируса в клетку, содержащую последовательности Е1 аденовируса, способную к комплементации удаленных последовательностей Е1 указанного рекомбинантного аденовируса; Ь) культивирования указанных клеток и сбора указанного рекомбинантного аденовируса, где способ отличается тем, что клетка представляет собой клетку по данному изобретению. Специалистам в данной области понятно, что вместо введения указанного рекомбинантного аденовируса также возможно осуществить получение рекомбинантного аденовируса, применяя один или несколько фрагментов нуклеиновой кислоты, способных формировать геном указанного рекомбинантного аденовируса, и которые после репликации и упаковки в указанных клетках формируют указанный рекомбинантный аденовирус. Таким образом, для данного варианта осуществления рекомбинантный аденовирус также может представлять собой геном рекомбинантного аденовируса. В предпочтительном варианте осуществления, у указанного рекомбинантного аденовируса, по существу, отсутствует перекрывание последовательностей с последовательностями Е1, находящимися в указанной клетке, которое в противном случае могло бы привести к гомологичной рекомбинации. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к пакующей системе, включающей в себя пакующую клетку, содержащую в своем геноме последовательности Е1 и рекомбинантный аденовирусный вектор с делецией в области Е1, где в геноме указанного вектора по существу отсутствует перекрывание с последовательностями Е1 в геноме указанной пакующей клетки, отличающейся тем, что указанная пакующая клетка представляет собой клетку по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Способный к репликации аденовирус (ЯСА) представляет собой аденовирусную частицу, способную к репликации в клетках без необходимости в аденовирусе-хелпере. Как используется здесь, под ΗΌΕΡ (зависимая от хелпера частица, содержащая Е1) понимают вирусную частицу, содержащую, по меньшей мере, кодирующие последовательности Е1А и Е1В-55К аденовируса, где указанная частица не способна к репликации в клетке в отсутствие функциональных Е1А и/или Е1В-55К без вируса-хелпера. Вирус-хелпер может представлять собой аденовирус дикого типа или мутантный аденовирус, а также любой аденовирусный вектор, обеспечивающий функции, отсутствующие в ΗΌΕΡ, и, следовательно, может быть обеспечен посредством (дефектного по Е1) рекомбинантного аденовируса с желательным продуктом, размноженного в пакующих клетках. Для размножения аденовируса необходимы последовательности Е1А и Е1В 55К. Как правило, ΗΌΕΡ дополнительно содержит кодирующие последовательности Е1В-19К. Последовательности Е1, находящиеся в ΗΌΕΡ, должны быть способны комплементировать дефектные по Е1 рекомбинантные аденовирусы, которые могут служить в качестве вируса-хелпера для ΗΌΕΡ. ΗΌΕΡ можно получить посредством гомологической рекомбинации на участках перекрывания между последовательностями Е1 в пакующей клетке и векторе (Мигакат! с1 а1., 2002), но как было не

- 4 010924 ожиданно показано в нескольких исследованиях, ΗΌΕΡ также может образовываться в отсутствие существенной гомологии/перекрывания между последовательностями в пакующей клетке и векторе, т.е. посредством процесса, называемого здесь как негомологичная рекомбинация (см., например, Мигакаш1 с1 а1., 2004 для обзора возможных структур ΗΌΕΡ). Следовательно, как используется здесь, существенное перекрывание определяют как перекрывание, достаточное для гомологичной рекомбинации. В любом варианте осуществления, когда изобретение относится к отсутствию существенного перекрывания, полагают, что данное условие выполнено, если перекрывание присутствует не более чем в 50 нуклеотидах (нт), предпочтительно, менее чем 40 нт, более предпочтительно, менее чем 30 нт, еще более предпочтительно, менее чем 20 нт, еще более предпочтительно, менее чем 10 нт, наиболее предпочтительно полное отсутствие перекрывания.

Хотя механизм формирования ΗΌΕΡ в настоящее время понят не полностью, ясно, что последовательности Е1 происходят из генома пакующей клетки. Присутствие последовательностей Е1 в партиях рекомбинантных аденовирусов нежелательно, если оно в форме К.СА или ΗΌΕΡ. Изобретение относится к способам и средствам, минимизирующим шанс образования ΗΌΕΡ. Кроме того, предоставлены способы получения клеток и образующиеся в результате клетки, где указанные клетки несут Е1А и Е1В в хромосомной конфигурации, предотвращающей одновременное введение в рекомбинантный аденовирус кодирующих последовательностей Е1А и Е1В, и, следовательно, формирование ΗΌΕΡ в отсутствие существенного перекрывания последовательностей между вектором и расположенных на хромосомах комплементирующих клеток по изобретению последовательностей Е1, когда клетки применяют для комплементации рекомбинантных аденовирусных векторов с отсутствием Е1. С этой целью конформация хромосом клеток по одному из вариантов осуществления изобретения такова, чтобы кодирующие области Е1А и по меньшей мере одного из Е1В в геноме новых клеток были разделены. Так как полагают, что инвертированные повторы вносят вклад в формирование ΗΌΕΡ посредством стимуляции делеции аденовирусных последовательностей, то в другом варианте осуществления изобретение относится к клеткам, содержащим кодирующие последовательности Е1 А и Е1 В, где последовательности Е1 в геноме указанных пакующих клеток не представлены в конформации инвертированных повторов.

Клетки по изобретению содержат в своем геноме аденовирусные кодирующие последовательности Е1А и Е1В, а предпочтительно они содержат в своем геноме кодирующие последовательности для всех функциональных белков Е1А и обоих Е1В (Е1В-55К и Е1В-19К). Белки Е1А и по меньшей мере один из Е1В по изобретению могут быть одного и того же серотипа или, необязательно, могут быть различных серотипов.

Предпочтительно, в вариантах осуществления по меньшей мере один из Е1А и Е1В регулируется промотором, отличным от промотора Е1А и Е1В, соответственно.

Клетки по изобретению

Рекомбинантный аденовирус может быть способен к включению в себя более 20 т.п.н. ДНК клеточной пинии, в которой он размножается, а максимум длины генома аденовируса, позволяющей эффективную упаковку, составляет приблизительно 38 т.п. к. (для вектора, основанного на аденовирусе типа 5; эта цифра может до некоторой степени зависеть от серотипа). Такую особенность используют для получения новых комплементирующих клеток по изобретению, где указанные клетки содержат кодирующие последовательности Е1А и Е1В и указанные клетки характеризуются тем, что указанные последовательности Е1А и по меньшей мере одного из Е1В в указанном геноме разделены посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно, по меньшей мере 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. Это обозначает, что в геноме таких клеток отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1А и обоих Е1В разделены менее чем 4, 10 или 34,5 т.п.н., соответственно (см., например, фиг. 22 для схематического представления). Понятно, что везде, где в настоящем изобретении указано, что две последовательности в геноме клетки разделены по меньшей мере заданным расстоянием, это требование также считают выполненным, если две последовательности находятся в разных хромосомах. Таким образом, как используют здесь, вариант осуществления, где две последовательности находятся на разных хромосомах, однозначно включен в значение по меньшей мере х т.п.н. одна от другой или разделенные посредством по меньшей мере х т.п.н. в геноме. Такой вариант осуществления можно легко проверить известными специалистам в данной области способами, например, посредством флуоресцентной гибридизации ίη δίΐιι (ΕΙ8Η), которую можно использовать для определения местоположения хромосомы и/или определения местоположения на хромосоме, где находится данная последовательность.

Клетки по изобретению содержат в своем геноме аденовирусные последовательности и, предпочтительно, указанные аденовирусные последовательности кодируют все белки Е1, но отсутствуют последовательности, кодирующие ρΙΧ или его часть (т.е. такие клетки, предпочтительно, не содержат последовательностей из открытой рамки считывания ρΙΧ (для клеток с последовательностями Ε1 А65 это означает что они, предпочтительно, не содержат нуклеотиды 3609-4031 из \\1 А65 или части из них), а более предпочтительно, у них также существуют делеции в промоторе ρΙΧ (для клеток с последовательностями Е1 А65. предпочтительно, нет последовательностей промотора ρΙΧ ниже нуклеотида 3550, более предпочтительно, 3525)) для предотвращения значительного перекрывания с аденовирусными векторами, несу

- 5 010924 щими ρΙΧ под контролем его собственного промотора. Отсутствие последовательностей р1Х в геноме пакующих клеток помогает предотвратить перекрывание между указанным геномом и рекомбинантным аденовирусным вектором (патент США 5994128).

Клетки по изобретению можно получать из иммортализованных клеток, таких как А549, Не1а и т.п., при этом для определения клеток необходим селективный маркер. Предпочтительно клетки по изобретению получают из первичных клеток, при этом селекцию обеспечивают посредством трансформирующей активности Е1А и Е1В (см. примеры). В предпочтительных аспектах указанные клетки получают из клеток сетчатки. Они могут представлять собой клетки любого происхождения, включая человеческие клетки. Для размножения человеческого аденовируса предпочтительны клетки человека. Также клетки могут быть, например, бычьими для размножения рекомбинантного бычьего аденовируса (патент США 6379944). Специалисты в данной области могут выбрать источник клеток, сочетающийся с выбранным рекомбинантным аденовирусом.

В одном из аспектов клетки получают из первичных клеток сетчатки человека (также обозначаемых как клетки НЕК). Иммортализация таких клеток аденовирусными последовательностями Е1 описана, например, в патенте США 5994128, у Вугй е! а1., 1982, 1988 и ОаШтоге е! а1., 1986. Первичные клетки НЕК могут быть выделены из эмбрионов (Вугй е! а1., 1982, 1988). В других вариантах осуществления клетки получают из первичных клеток эмбриональной почки человека (см., например, Огайат е! а1., 1977). В других вариантах осуществления клетки получают из первичных амниоцитов, таких как первичные человеческие амниоциты (см., например, патент США 6558948 о способах иммортализации первичных амниоцитов аденовирусными последовательностями Е1).

Получение клеток

Клетки по настоящему изобретению могут быть получены посредством введения кодирующих последовательностей аденовирусных Е1А и Е1В-55К и Е1В-19К в клетку-предшественник или клеткупрародитель (таким образом, клетки получают из клетки-предшественника или клетки-прародителя введением в них последовательностей Е1). По данному изобретению указанные кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В следует вводить в указанные клетки-предшественники в разъединенном виде. Как используется в данном дополнительном значении, разъединенный означает указание на конфигурацию, отличающуюся от природной конфигурации Е1 А и Е1 В, обнаруженной в аденовирусе, т.е. непосредственно примыкая друг к другу (см., например, фиг. 14, где показана природная, т.е. соединенная, конфигурация Е1А и Е1В, как находится в плазмиде р1О.Е1А.Е1В). Необходимо отметить, что до настоящего изобретения специалисты в данной области, желающие получить пакующие клетки, содержащие в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е1 А и обоих Е1 В, не рассматривали введение последовательностей Е1А и по меньшей мере одного из Е1 В в разъединенном виде, так как а) это является более трудоемким и, следовательно, менее удобным, и так как Ь) для иммортализации необходимы обе последовательности Е1 А и Е1 В. В предыдущих исследованиях, проведенных для понимания трансформирующих возможностей белков Е1 А и Е1 В, показано, что введение кодирующих последовательностей Е1 А и по меньшей мере одного из Е1В может приводить к определенным клонам (уаи йеи Е1кеи е!.а1., 1982; ОаШтоге е! а1., 1986; 1оейеткеи е! а1., 1987; Као е! а1., 1992; №уе1к е! а1., 2001). Однако, совместное введение таких плазмид и/или перекрывание между вводимыми последовательностями, например, в плазмидных последовательностях, регуляторных последовательностях, таких как промотор и/или сигнале полиаденилирования, и перекрывающейся последовательности Е1В-55К и Е1В-19К, вероятно, приводит к совместной интеграции кодирующих областей Е1А и обоих Е1В в один и тот же локус генома. В самом деле, такую совместную интеграцию наблюдали уаи йеп Е1кеи е! а1. (1982). В одном из случаев (1оейеткеи е! а1., 1987) для изучения влияния экспрессии Е1В на экспрессию Е1 А клетки почки детеныша крысы (ВКК) сначала трансфицировали Е1 А, а отобранные клоны затем трансфицировали плазмидой с Е1 В. Очевидно, что данное исследование проводили на конкретном типе клеток и по причине, не связанной с описанным в данной заявке изобретением. До настоящего изобретения не существовало причины для отдельной трансфекции кодирующих последовательностей Е1 А и по меньшей мере одного из Е1В, с целью получения пакующих клеток. Формирование НЭЕР в отсутствие существенного перекрывания между геномом рекомбинантного аденовируса и пакующей клетки до настоящего времени описано не было. Кроме того, ОаШтоге е! а1. (1986) описали, что клетки человека очень редко морфологически трансформируются посредством только экспрессии Е1 А и большинство клонов погибало ίη кйи или сразу после выделения, что служило веским аргументом против использования специалистом в данной области такого способа для получения клеток, отличных от клеток, полученных из ВКК, например, клеток человека. Единственный случай, когда плазмида, экспрессирующая Е1А Ай12 (подгруппа А), приводила к образованию клона, выявили через 114 суток после трансфекции, а смогли отобрать только после того, как клон разросся в чашке. Очевидно, что специалист в данной области мог быть не мотивирован к введению генов Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В в клеткипредшественники в различные моменты времени, основываясь на предшествующем уровне техники. Достоинством настоящего изобретения является то, что в нем предоставлены такие способы получения клеток, несущих в их геноме разделенные кодирующие последовательности Е1А и по меньшей мере одну из Е1 В. В определенных аспектах клетки по настоящему изобретению предпочтительно представляют

- 6 010924 собой клетки, не являющиеся клетками почки детеныша крысы (БЯК). В одном из предпочтительных аспектов клетки по изобретению являются человеческими клетками. В предпочтительном аспекте клетки получают из клеток НЕЯ. Следует понимать, что в геноме клеток, в которые по настоящему изобретению вводят последовательности Е1, перед указанным введением предпочтительно нет кодирующих последовательностей аденовирусных Е1А и Е1В, и только при введении последовательностей они приобретают в своем геноме последовательности Е1, становясь, таким образом, иммортализованными и способными к упаковке рекомбинантного аденовируса с делецией в области Е1. Например, в XVО 03/031633 описано введение Е1В-55к Л611 в клетки 293: это, очевидно, не дает преимущества настоящего изобретения, так как последовательности Е1, как уже присутствующие в 293, остаются в оригинальной конфигурации и клетки несут ОЯЕ Е1В, расположенную менее чем на 4 т.п.н. от ОЯЕ Е1А.

Напротив, настоящее изобретение относится к способам получения клеток, несущих в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е1А и Е1В-19К и Е1В-55К, а также к полученным в результате применения способов клеткам, где последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В в достаточной степени отделены друг от друга, чтобы предотвратить одновременное введение всех последовательностей Е1 А и Е1 В из генома клеток в геном одной аденовирусной частицы.

В первом варианте осуществления для получения клеток по настоящему изобретению кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В раздельно вводят в указанные клеткипредшественники, помещая из в отдельные молекулы, которые вводят в указанные клетки в различные моменты времени, а указанные клетки-предшественники не являются клетками ВЯК. В одном из вариантов осуществления этого, сначала вводят кодирующие последовательности, кодирующие последовательности Е1А и Е1В-21К, тогда как кодирующую последовательность Е1В-55К вводят в более поздний момент времени.

Во втором варианте осуществления для получения клеток по настоящему изобретению по меньшей мере две молекулы нуклеиновой кислоты, вместе содержащие кодирующие последовательности указанного Е1 А и указанного Е1 В, вводят в указанную клетку-предшественник, отличающуюся тем, что в указанных по меньшей мере двух молекулах нуклеиновой кислоты отсутствует значительное перекрывание последовательностей. Полагают, что наличие таких перекрывающихся последовательностей могло бы увеличить вероятность по меньшей мере какого-либо взаимодействия между указанными по меньшей мере двумя молекулами и последующей совместной интеграции последовательностей указанных молекул в один и тот же локус генома клетки-предшественника, в которую вводят данные молекулы, тогда как объектом настоящего изобретения является преодоление этого. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одну из кодирующих областей Е1А и Е1 В помещают под контроль различных регуляторных последовательностей, таких как промоторы и сигналы полиаденилирования. В другом варианте осуществления последовательности Е1В-55К и Е1В-19К, которые перекрываются, разделены и все перекрывания между данными кодирующими последовательностями удалены посредством методов генной инженерии с использованием знания о вырожденности генетического кода известными специалистам в данной области способами, таким образом, обеспечивая введение данных кодирующих последовательностей Е1 В независимо и не связанно друг с другом. Введение кодирующих областей Е1 А и Е1 В в данном варианте осуществления можно проводить в одно и то же время, например, посредством совместной трансфекции указанных по меньшей мере двух молекул, но очевидно, первый и второй варианты осуществления также можно объединять, т.е. вводить по меньшей мере две молекулы, содержащие последовательности нуклеиновой кислоты, вместе содержащие кодирующие последовательности Е1А и обоих Е1 В, где в указанных по меньшей мере двух молекулах отсутствует значительное перекрывание по отношению друг к другу, и где указанные по меньшей мере две молекулы вводят в клетку-предшественник в различные моменты времени.

В третьем варианте осуществления последовательности, кодирующие Е1 А и кодирующие последовательности по меньшей мере одного из Е1 В разъединены посредством помещения в одну молекулу нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В (очевидно это также могут быть обе кодирующие последовательности Е1 В) разделены посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 6 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 8 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 10 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 15 т.п.н., наиболее предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. нуклеиновой кислоты, обозначаемой здесь как спейсерная или балластная нуклеиновая кислота. Спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты преимущественно может обладать характеристиками, как описано ниже, спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты, конкретно в указанной последовательности отсутствуют кодирующие последовательности Е1 А и Е1 В, может быть построена по меньшей мере частично из интронных последовательностей и может содержать регуляторные последовательности кодирующих последовательностей Е1 А и/или Е1 В. Специалисту понятно, что в эквивалентном варианте третьего варианта осуществления указанные кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В могут присутствовать на различных молекулах нуклеиновой кислоты вместо одной молекулы (см., например, фиг. 13 I, II, и, например, пример 3), пока последовательности остаются разделен

- 7 010924 ными посредством, по меньшей мере, указанного расстояния, когда указанные различные молекулы нуклеиновой кислоты будут формировать одну молекулу, например, посредством (гомологичной) рекомбинации, или лигирования, или соединения конец-в-конец. Идея представляет собой то, что также в таком случае кодирующие последовательности Е1А и по меньшей мере одного Е1В при интеграции в геном клетки-предшественника остаются разделенными посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 6 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 8 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 10 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 15 т.п.н., наиболее предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. (см., например, пример 3 и фиг. 21). Другими словами, третий вариант осуществления изобретения можно, следовательно, проводить посредством введения в клеткупредшественника одной молекулы нуклеиновой кислоты (молекула А), содержащей кодирующие последовательности Е1А и Е1В-19К и Е1В-55К, где по меньшей мере две из данных трех кодирующих последовательностей являются разделенными посредством по меньшей мере 4 т.п.н. (вариант осуществления 3 а); или, с тем же успехом, посредством введения двух или более молекул нуклеиновой кислоты, которые при формировании одной молекулы нуклеиновой кислоты будут формировать молекулу А (вариант осуществления 3Ь). В определенных аспектах третьего варианта осуществления, для уменьшения шанса взаимодействия и возможной гомологичной рекомбинации между данными отдельными последовательностями, отсутствует существенное перекрывание последовательностей и между спейсерными нуклеиновыми кислотами, фланкирующими Е1А и Е1 В, и в регуляторных последовательностях для кодирующих последовательностей Е1 А и Е1 В.

Кодирующие Е1А и Е1В рекомбинантные молекулы

В одном из аспектов изобретение относится к рекомбинантной молекуле, содержащей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аденовирусные белки Е1 А, и по меньшей мере один из аденовирусных белков Е1 В, отличающейся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белки Е1 А, и указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере один белок Е1В, разделены посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. Такую молекулу можно использовать в способе по изобретению для получения клеток по изобретению. Такая молекула может принимать различные известные специалистам в данной области формы, такие как плазмида, космида, искусственная бактериальная хромосома, УАС, и тому подобное.

В эквивалентном варианте осуществления также возможно получать кодирующую белки Е1А и Е1 В указанную нуклеиновую кислоту, исходно находящуюся в виде раздельных молекул. Такие молекулы могут, необязательно, быть способны к формированию одной молекулы посредством гомологичной рекомбинации, лигирования, сайт-специфической рекомбинации, соединения конец-в-конец и тому подобное. Таким образом, аспект изобретения относится к набору по меньшей мере из двух молекул нуклеиновой кислоты, содержащему: а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белки Е1 А аденовируса, где указанная молекула нуклеиновой кислоты несет по меньшей мере 5 т.п.н, предпочтительно по меньшей мере 17 т.п.н. последовательности спейсерной нуклеиновой кислоты на обеих сторонах указанной кодирующей последовательности Е1 А, где указанная спейсерная нуклеиновая кислота не кодирует белок Е1 В; и Ь) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок Е1 В аденовируса, где указанная молекула нуклеиновой кислоты несет по меньшей мере 5 т. п. н, предпочтительно по меньшей мере 17 т.п. н. последовательности спейсерной нуклеиновой кислоты на обеих сторонах указанной кодирующей последовательности Е1В, где указанная спейсерная нуклеиновая кислота не кодирует белок Е1А. Указанная спейсерная нуклеиновая кислота может быть любой другой нуклеиновой кислотой, а предпочтительно ее выбирают таким образом, чтобы она являлась инертной, то есть не содержала кодирующих последовательностей, предпочтительно, без известных регуляторных элементов, без высокоповторяющихся областей, что может приводить к нестабильности хромосом и тому подобному. Предпочтительно указанная спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты, фланкирующая кодирующие последовательности Е1 А, не имеет существенной гомологии с указанной спейсерной последовательностью нуклеиновой кислоты, фланкирующей кодирующую белок Е1В последовательность. Спейсерный фрагмент может включать в себя регуляторные последовательности экспрессионных кассет Е1 А или Е1 В, такие как гетерологичный промотор и/или участок полиаденилирования.

Размножение рекомбинантных молекул в хозяине, как правило, можно без труда проводить, когда молекулы находятся в кольцевой форме. В определенных аспектах рекомбинантные молекулы по изобретению находятся в линейной форме. Это может способствовать трансфекции линий клетокпредшественников, которая, как правило, более эффективна при использовании линейных молекул. Например, линеаризацию можно проводить посредством расщепления рекомбинантной молекулы одними или несколькими подходящими рестрикционными ферментами, как известно специалистам в данной области.

Клеточные линии с отсутствующими последовательностями Е1 в ориентации инвертированного повтора

Каков бы ни был механизм образования ΗΌΕΡ в отсутствие существенного перекрывания между пакующей клеткой и рекомбинантным аденовирусом, вероятно, что первой стадией в данном процессе

- 8 010924 является событие интеграции последовательности Е1 из генома пакующей клетки в геном вируса. Для приспособления к данным добавочным последовательностям у вируса впоследствии должна произойти делеция аденовирусных последовательностей (Мигакаш1 с1 а1., 2002). Данная стадия может являться более эффективной, когда присутствуют инвертированные повторы (Б1сш\сасг4сг с1 а1., 1999). Клеточная линия РЕК..С6® содержит в своем геноме несколько повторов плазмиды рЮ.Е1А.Е1В, которую применяли для получения клеточной линии, где некоторые из повторов находятся в инвертированной ориентации по отношению друг к другу. Таким образом, присутствие в геноме клеток РЕК..С6® инвертированных повторов области Е1 может влиять на частоту образования ΗΌΕΡ.

Необходимо отметить, что формирование частиц ΗΌΕΡ также может происходить в других пакующих аденовирусы клеточных линиях, но в таких клеточных линиях они остаются необнаруженными вследствие появления классических ВСА. Отсутствие в линиях пакующих клеток последовательностей Е1 в ориентации инвертированных повторов будет, вероятно, приводить к меньшей частоте или даже к полному отсутствию образования ΗΌΕΡ, когда рекомбинантный аденовирус размножается в таких пакующих клетках.

Таким образом, при получении или селекции новых клеточных линий, содержащих в своем геноме области Е1, может быть желательным селекция новых клонов, в которых отсутствуют инвертированные повторы, но, предпочтительно несущие только прямые повторы или даже единственную интеграцию последовательностей Е1. Таким образом, аспект изобретения относится к клеткам, а также к способам получения содержащих аденовирусные последовательности Е1 клеток, отличающихся тем, что указанный способ предусматривает стадию отбора клеток с отсутствием инвертированных повторов, содержащих указанные последовательности Е1. Изобретение относится к клеткам, содержащим в своем геноме последовательности аденовирусного Е1, где указанные последовательности Е1 включают в себя по меньшей мере одну функциональную копию кодирующих последовательностей Е1А и Е1В-19К и Е1В-55К, отличающуюся тем, что указанные последовательности Е1 или их часть не существуют в указанном геноме в форме инвертированных повторов. В данном варианте осуществления указанные клетки не являются клетками 293 или их производными. Если инвертированные повторы присутствуют, то предпочтительно, такие инвертированные повторы не находятся в указанной клетке в пределах 10 т.п.н., а в настоящем изобретении инвертированные повторы по меньшей мере с 10 т.п.н. промежуточной последовательности, не содержащей Е1, далее как инвертированные повторы не рассматривают. Обоснование состоит в том, что когда одна копия последовательности Е1 где-либо интегрируется в хромосому, а инвертированная копия может интегрироваться на той же хромосоме, но на расстоянии, достаточно большом, чтобы предотвратить захват всего содержащего оба повтора сегмента ДНК в аденовирусную частицу, не представляют никаких проблем. Также когда расстояние является таким, что захват фрагмента возможен (т.е. 10 т.п.н.), дупликация левого конца являющаяся результатом последовательности инвертированных повторов приводит к вирусному геному, который слишком велик для упаковки (проиллюстрировано на фиг. 13). Участок вставки последовательностей Е1 в геном вируса важен для конечной общей длины ΗΌΕΡ. Очевидно, что вероятность, что включение содержащего Е1 геномного фрагмента приведет к пакующемуся геному, увеличивается, если вставка находится ближе к левому концу вируса. Если участок вставки находится точно на З'-конце минимального сигнала упаковки, тогда вставка может составлять до 18,5 т.п.н. (в том числе 1 копия Е1А и Е1В и последовательность инвертированного повтора) и все еще оставаться пакующейся (при условии, что концевая дупликация слева направо включает в себя 350 п.н. 1ТВ и сигнал упаковки). Это не означает, что вставка, например, 17 т.п.н. будет легко образовывать ΗΌΕΡ, так как возможные участки интеграции такого фрагмента, которые еще приводят к вирусу пакуемого размера, ограничены до 1,5 т.п.н. только на З'-конце минимальной пакующейся последовательности. Таким образом, частота образования ΗΌΕΡ при увеличении расстояния между кодирующими областями Е1 А и Е1 В будет уменьшаться и еще может быть достаточно ниже уровня детекции, когда расстояние является значительно меньшим, чем указанные 18,5 т.п.н.

Эти же аргументы справедливы и для прямой вставки Е1А и Е1 В в отсутствие последовательностей прямых повторов. В этом случае общая длина вставки в геном аденовируса не должна превышать 37,5 т.п.н. (включая сюда приблизительно 3 т.п.н. для области Е1А и Е1В), но только когда она вставляется непосредственно на 3'-конце минимального сигнала упаковки. Таким образом, когда кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В разделены в геноме пакующей клетки посредством по меньшей мере 34,5 т.п.н., вставка обеих данных последовательностей в рекомбинантный аденовирус предотвращается. Кроме того, затем в полном геноме аденовируса на последующей стадии должна произойти делеция, каковой процесс может быть дополнительно намного менее эффективным в отсутствие последовательностей инвертированных повторов (Б1сй1\сасг4сг с1 а1., 1999). В любом случае независимо от присутствия в геноме инвертированных последовательностей Е1, вероятность образования частиц, содержащих последовательности Е1А и Е1 В уменьшается, если кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В дополнительно разделены в геноме. Таким образом, в определенных вариантах осуществления указанные кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1В разделены в геноме клеток по настоящему изобретению посредством по меньшей мере 4 т.п.н., 6

- 9 010924

т.п.н., 8 т.п.н., 10 т.п.н., 12 т.п.н. В этих вариантах осуществления предпочтительно, чтобы последовательности Е1 не присутствовали в форме инвертированных повторов. Предпочтительно, указанные последовательности разделены посредством по меньшей мере 15 т.п.н. и в них отсутствуют инвертированные последовательности Е1, что гарантирует теоретическую возможность образования в такой клеточной линии ΗΌΕΡ посредством введения последовательностей Е1 из генома указанной клеточной линии в аденовирус практически уменьшится до нуля (см. фиг. 13). В других вариантах осуществления, указанные кодирующие последовательности Е1А и по меньшей мере одного из Е1В разделены посредством по меньшей мере 18 т.п.н., 20 т.п.н., 25 т.п.н., 30 т.п.н. Наиболее предпочтительно, чтобы указанные последовательности были разделены посредством по меньшей мере 34,5 т.п.н. Это будет гарантировать, что не произойдет однократной интеграции обоих Е1А и Е1В, происходящих из генома клетки, которая сможет привести к образованию ΗΌΕΡ. Как указано выше, очевидно, что в определенных эквивалентных вариантах осуществления указанные кодирующие последовательности Е1А и по меньшей мере одного Е1 В в геноме клетки находятся на различных хромосомах.

Способы скрининга полученных клонов на присутствие инвертированных повторов последовательностей Е1 известны специалистам в данной области и могут включать в себя РСЯ, саузерн-блоттинг, анализ рестрикционными ферментами, ИЬег-ИЗН и тому подобное. При образовании клеточных клонов с применением плазмиды, содержащей гены Е1, такой как плазмида рЮ.Е1А.Е1В (патент США 5994128), сначала можно получать клоны, а затем в цикле скрининга отбирать для дальнейшего применения те клоны, в которых отсутствуют указанные инвертированные повторы. Клетки из отобранных клонов затем можно соответствующим образом применять для получения рекомбинантного аденовируса, и следует ожидать, что частота образующихся в данных клетках ΗΌΕΡ будет значительно ниже (или даже отсутствовать), чем в клетках, содержащих указанные инвертированные повторы. Таким образом, существует другой аспект настоящего изобретения, относящийся к клетке, содержащей в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е1 А и Е1 В, характеризующийся тем, что указанные последовательности Е1 не находятся в указанном геноме в форме инвертированных повторов. Для данного аспекта настоящего изобретения последовательности, разделенные посредством по меньшей мере 10 т.п.н. последовательности, не содержащей Е1, не рассматривают как инвертированные повторы. В конкретном аспекте указанные последовательности Е1 А и Е1 В находятся в указанном геноме по меньшей мере в количестве двух копий на геном. В одном из аспектов указанные по меньшей мере две копии содержат по меньшей мере две копии, находящиеся на одной хромосоме. В другом варианте осуществления указанные клетки содержат в своем геноме только одну копию кодирующих областей Е1А и Е1 В, при отсутствии последовательностей, кодирующих аденовирусный р1Х. Конечно, следует ожидать, что в клетке, содержащей в своем геноме только одну копию указанных последовательностей Е1 будет уменьшена (или даже отсутствовать) частота образования ΗΌΕΡ.

Применение клеток

В другом аспекте изобретение относится к способу получения рекомбинантного аденовируса в клетках по изобретению. Это приводит к образованию партий рекомбинантного аденовируса со значительно сниженной по сравнению с полученными в известных в данной области системах партиями частотой ΗΌΕΡ, предпочтительно совсем без ΗΌΕΡ. В особенно предпочтительных вариантах осуществления в векторе и пакующей клетке, применяемых для получения указанного рекомбинантного аденовируса, отсутствует значительное перекрывание последовательностей (т.е. предпочтительно менее чем 10 нт, или более предпочтительно, совсем без перекрывания), а, предпочтительно, перекрывание отсутствует, тем самым сводя к минимуму шанс гомологичной рекомбинации между вектором и последовательностями в пакующей клетке, что приводит к партиям вируса с частицами, не содержащими Ε1 (ΗΌΕΡ, ЯСА).

Следует отметить, что новые клетки, предоставленные по настоящему изобретению также можно применять для получения рекомбинантных белков, как описано ранее (\νϋ 00/63403), и для получения других (не являющихся аденовирусами) вирусов, как описано ранее (νθ 01/38362).

Специалистам в данной области должно быть понятно, что серотип или природа трансгена не важны для изобретения. Например, сразу же будет понятным, что последовательности аденовирусного Е1, кодирующие последовательности, применяемые для получения клеток, можно взять из любого подходящего серотипа, совместимого с аденовирусом, который необходимо размножать в клетках, такого как Аб5, Аб35, Аб11, Аб16, Аб49 и т.д., или их сочетания, т.е. кодирующие последовательности Е1А из одного серотипа, и по меньшей мере одного из Е1В из другого серотипа (см., например, νθ 02/40665). Также должно быть понятным, что во многих других аспектах изобретение можно изменять без отклонения от его объема и сущности. Изобретение далее будет проиллюстрировано посредством нижеследующих примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Примеры

В практическом осуществлении данного изобретения применяют, пока не указано иначе, традиционные способы молекулярной биологии, клеточной биологии и рекомбинантных ДНК, которые известны специалистам в данной области. См., например, ЗашЬгоок, Егйксй апб ΜαηίαΙίκ. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2^пб ебйюп, 1989; Сштеп! Ργο1ο^1κ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, АикиЬе1 ЕМ, е! а1., ебк, 1987;

- 10 010924

1йе 5СПС5 Ме1йоб§ ίη Επζνιηοίοβν (Асабеппс Ргс55. 1пс.); РСК2: А Ргасбса1 Арргоасй. МасРйегкоп М1, Натк ВЦ. Тау1ог СК. ебк. 1995.

Пример 1. Получение комплементирующих клеточных линий с применением отдельных нуклеиновых кислот. кодирующих белки Е1А и Е1В

Полная морфологическая трансформация первичных клеток аденовирусными генами Е1 представляет собой результат совместной активности белков. кодируемых областями Е1А и Е1В.

Роли различных белков Е1 в литической инфекции и трансформации широко изучены (рассмотрено в 2ап1ета апб уап бег Ей. 1995; ^ййе. 1995. 1996). Аденовирусные белки Е1А необходимы для трансформации первичных клеток. Сопутствующую индукцию апоптоза нейтрализуют и Е1В-19К. и Е1В-55К. хотя и различными механизмами. Хотя область Е1А кодирует несколько белков. как кодирующую область Е1 А. как правило. обозначают всю область. а во всех вариантах осуществления. как применяют здесь. кодирующая последовательность Е1А обозначает последовательности. кодирующие все белки Е1А.

В клетках грызунов активности Е1А вместе с любым из Е1В-19К или -55К достаточно для полной трансформации. хотя экспрессия обоих белков Е1В вместе эффективнее в два раза (Са1йтоге е1 а1.. 1985; Као е1 а1.. 1992). Однако представляется. что в человеческих клетках активность белка Е1В-55К является более важной. принимая во внимание наблюдение. что Е1В-55К необходим для получения бессмертной трансформированной клеточной линии (ОаШтоге е1 а1.. 1986). При аденовирусной инфекции и размножении вируса белки Е1 А функционируют при активации аденовирусных генов. включая сюда Е1 В и другие ранние области. вероятно. посредством взаимодействия с ТАТА-связывающими белками (рассмотрено у 2ап1ета апб уап бег Ей. 1995). Экспрессия Е1В-55К важна на поздней фазе инфекции для отключения синтеза белков хозяина и селективного транспорта кодируемых вирусом белков из ядра в цитоплазму (Вай1кк е1 а1.. 1985; Рббег е1 а1.. 1986). У аденовирусов с делецией Е1В-55К в линиях некомплементирующих человеческих клеток показана уменьшенная репликация (Нагаба апб Вегк. 1999). Таким образом. кодируемые Е1А и Е1В-55К белки необходимы для трансформации первичных человеческих клеток и для эффективной репликации вируса в человеческих клетках.

Негомологическая рекомбинация может приводить к включению последовательностей Е1 из клеточного генома пакующей клетки в рекомбинантный аденовирус. Зависимые от хелпера содержащие Е1 частицы. которые в результате возникают из исходного рекомбинированного аденовируса. способны комплементировать репликацию не способных к репликации векторов в некомплементирующих (человеческих) клетках. но не способны к автономной репликации. Данная комплементация опосредована функциями и Е1А. и Е1В-55К. а возможно и Е1В-19К. Таким образом. если возможность того. что обе функции Е1А и Е1В-55К (а предпочтительно Е1В-19К) окажутся в аденовирусном зекторе исключена или уменьшена. тогда формирование НЭЕР будет исключено или уменьшено.

Здесь авторы описывают примеры функциональных плазмид. экспрессирующих любой из Е1А. Е1А и Е1В-19К. Е1В (Е1В-19К + Е1В-55К) или Е1В-55К. который применяют для получения пакующих аденовирусы клеточных линий. с областями Е1А и Е1В-55к. отделенными друг от друга.

Ранее описана (патент США 5994128) конструкция р1С.Е1А.Е1В (фиг. 14; 8ЕО Ш N0:1). содержащая область Аб5-Е1 (нуклеотиды 459-3510 генома Аб5 (инвентарный номер СепВапк М73260). функционально связанную с промотором человеческой фосфоглицераткиназы (РСК) и последовательностью полиаденилирования вируса гепатита В.

Получение конструкции р1С.Е1А

Конструкцию р1С.Е1А получали расщеплением р1С.Е1А.Е1В с Ншб1 с последующей очисткой полученного в результате фрагмента длиной 5 т.п.н. из геля с применением набора экстракции из геля 01АЕХ II (О|адеп) по инструкциям производителя. Повторное лигирование выделенного фрагмента и трансформирование в компетентные клетки 8ТВЬ2 (1пуйгодеп) приводило к получению р1С.Е1 А (фиг. 1). Данная конструкция содержит нуклеотиды от 459 до 1578 из генома Аб5 (инвентарный номер СепВапк М73260).

Получение конструкции р1С.Е1АВ21

Конструкцию р1С.Е1А расщепляли Хйа1 и Нра1. а полученный фрагмент длиной 4.8 т.п.н. выделяли из геля. как указано выше. Конструкцию р1С.Е1А.Е1В расщепляли ВкгС1 и обрабатывали фрагментом Кленова (Νον Епд1апб Вю1айк) для создания тупых концов из выступающих 5'-концов. Затем ДНК очищали набором для очистки продуктов ПЦР 01Ас.|шск (О|адеп) по инструкциям производителя и далее расщепляли Хйа1. Полученный фрагмент длиной 913 нуклеотидов. содержащий З'-часть Е1А и кодирующую последовательность Е1В-19К выделяют из геля. как описано. Лигирование двух выделенных фрагментов и трансформация в клетки ΌΗ5α-Τ1^Γ (1пуйгодеп) дает в результате конструкцию р1С.Е1АВ21 (фиг. 2). Таким образом. данная конструкция содержит нуклеотиды от 459 до 2253 генома Аб5 (инвентарный номер СепВапк М73260). в результате чего последовательность Е1А попадает под контроль промотора РСК. а промотор Е1В управляет геном Е1В-19К.

Иногда ген Е1В-19К Аб5 обозначают как ген Е1В-21К Аб5. так как ожидаемая аминокислотная последовательность образует белок массой 20.6 кДа (например. некоторые из плазмид и праймеров в данной заявке имеют 21К как часть их названий).

- 11 010924

Получение конструкции рСК5В

Затем, как указано ниже, получали конструкцию, содержащую область Е1В Л65. Вначале получали фрагмент ПЦР с праймерами 5Е1В£ог-1: 5'-ССС ААТ ТСС ССС ТОТ ТАА АТС 666 С6-3' (8ЕО ГО N0:2) и 5Е1В-геу: 5' -ТАС САС ССС АТТ СТТ СТС ТС-3' (8ЕО ГО N0:3), с применением ДНК р1С.Е1А.Е1В в качестве матрицы и ДНК-полимеразы Рио (РосНе) по инструкциям производителя с ΌΜ80 в конечной концентрации 3%. Программа амплификации представляла собой 94°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами, состоящими из (94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин) и заканчивалась 72°С в течение 10 мин. Полученный амплифицированный фрагмент длиной 481 нуклеотид очищали с применением набора очистки продуктов ПЦР 01Ас.|шек (01адеп) и лигировали в вектор рСК-8епр1Атр с применением набора для клонирования продуктов ПЦР (81га1адепе) в присутствии фермента 8гП по инструкциям производителя. Лигирование (по тупым концам) приводило в результате к двум ориентациям вставки в векторе, из которых произвольно выбирали одну с наибольшим фрагментом между участком ЕсоР1 на 5'-конце представляющей интерес вставки и участком ЕсоР1 в векторе. В результате это приводило к конструкции рСР5В. Корректность амплификации последовательности-мишени (между участками Крп1 и ЕсоР1) контролировали секвенированием.

Получение конструкции рЕ1В рСР5В расщепляли Крп1 и ЕсоРЕ а фрагмент длиной 415 нуклеотидов выделяли из геля с применением набора экстракции из геля 01Ас.|шск (01адеп). Затем конструкцию р1С.Е1А.Е1В также расщепляли ЕсоР1 и Крп1, а полученный в результате фрагмент вектора длиной 5,2 т.п.н. выделяли из геля, как указано выше. Лигирование выделенных фрагментов и трансформация в клетки ЬН5а-Т1^г Диуйгодеи) дает в результате конструкцию рЕ1В (фиг. 3). Последовательность Е1В в данной конструкции состоит из нуклеотидов от 1642 до 3510 из генома А65.

Затем тестировали трансформирующую способность новых конструкций в сравнении с полноразмерной экспрессирующей А65Е1 конструкцией. Для этого выделяли первичные человеческие клетки эмбриональной сетчатки (НЕР) (см., например, Вугб е1 а1., 1982, 1988) и высевали в 6-см чашки в среде ЬМЕМ (С1Ьсо ВРЬ) дополненной инактивированной нагреванием 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЕВ8, С1Ьсо ВРЬ). При 60-70% конфлюентности клетки трансфицировали в совокупности 20 мкг ДНК/чашку с применением набора для сопреципитации с СаРО₄ (1пуйгодеп) по инструкциям производителя. Через две недели трансформированные клоны становились видимыми как очаги в монослое первичных клеток. У клеток в очаге наблюдали совершенно отличную морфологию по сравнению с первичными клетками. В табл. II приведено количество трансформированных клонов, полученных при каждой из трансфекций.

Результаты подтвердили предыдущие наблюдения, что первичные клетки можно трансформировать генами А65-Е1А и Е1В19К (р1С.Е1АВ21). Следует отметить, что данные очаги, как правило, были меньше, чем очаги, полученные трансфекцией, где находилась полная область Е1В. Также, после отбора очагов, полученных в результате трансфекций конструкцией р1С.Е1АВ21, и высеванием в 96-луночные планшеты не получали длительного роста клеток и все клетки погибали. Во всех остальных случаях большинство отобранных очагов в результате давали жизнеспособные клеточные клоны.

Так как трансфекция р1С.Е1АВ21 вначале приводит к трансформированным клеткам, возможно повторно трансфицировать клетки экспрессирующей Е1В-55К конструкцией, например, через 5-10 суток после первой трансфекции. Это обеспечивает то, что получаемые клетки включают в себя обе экспрессирующие кассеты в различных локусах генома.

Данный эксперимент дополнительно подтвердил, что возможно получать и создавать трансформированные клеточные клоны посредством применения двух отдельных плазмид для генов Е1А и Е1В (р1С.Е1А + рЕ1В). Однако так как обе плазмиды трансфицировали совместно и они содержат значительное перекрывание последовательностей (каркас плазмид и промотор/ро1уА), возможно, что интеграция Е1 А и Е1 В происходила в одном и том же локусе генома.

Этого можно избежать, применяя фрагменты только с экспрессионными кассетами (без векторных последовательностей) и без перекрывания последовательностей. Перекрывание последовательностей можно удалить из регуляторных элементов, таких как промоторы и последовательности полиаденилирования (ро1уА), применяя различные регуляторные последовательности для двух экспрессирующих конструкций с последовательностями Е1 А и Е1 В. Предпочтительно данные последовательности в достаточной мере отличаются, чтобы предотвратить перекрывание, которое может приводить к формированию парных структур, создающихся в процессе гомологичной рекомбинации. Можно применять любой промотор и последовательность ро1уА. Предпочтительно, чтобы регуляторные последовательности отличались от регуляторных последовательностей трансгенов в рекомбинантном аденовирусе, который будет размножаться в данных клетках. Очевидно, что это можно определить только когда данный рекомбинантный аденовирус размножается в данных клетках на поздней стадии и будет зависеть от конкретного рекомбинантного аденовируса. Таким образом, удобно выбирать регуляторные последовательности таких трансгенов позднее, так чтобы они отличались от последовательностей Е1А и Е1 В в клетках, полученных по настоящему изобретению. Однако так как многие доступные в настоящее время рекомби

- 12 010924 нантные аденовирусные векторь несут трансгены, регулируемые промотором СМУ и последовательностью ро1уА 8У40, предпочтительные регуляторные последовательности для конструкций с Е1А и Е1В, как проиллюстрировано здесь, отличаются от промотора СМУ и последовательности ро1уА 8У40. Ввиду проблем с регулированием, дополнительно данные регуляторные последовательности предпочтительно не являются вирусного происхождения.

С этой целью описанные выше плазмиды дополнительно модифицируют, как описано ниже.

Получение конструкций рСС.Е1А и рСС.Е1АВ21

Последовательность Е1А амплифицировали с указанными ниже праймерами: 5Е1А-£от: 5'-ССС ААТ ТСС АТС СТС ТАС ТО-3' (8ЕО ГО N0:4) и 5Е1А-теу: 5'-СОО ОАТ ССА ТТТ ААС АСО ССА ТОС ААО-3' (8Е0 ГО N0:5). Реакцию проводили на матрице ДНК р1С.Е1А.Е1В с применением ДНКполимеразы Ρ\\ό (Восйе) по инструкциям производителя, но с конечной концентрацией ΌΜ80 3%. Программу ПЦР устанавливали как 94°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами (94°С в течение 30 с, 58°С в течение 30 с и 72°С в течение 120 с) и заканчивали при 72°С в течение 8 мин. Полученный в результате фрагмент длиной 1,2 т.п.н. содержал последовательность Е1А из А65 (нуклеотиды от 459 до 1655 как в инвентарном номере СепВапк М73260) и был фланкирован участками ЕсоК1 (5') и ВатН1 (3').

Второй фрагмент ПЦР получали с применением праймера 5Е1А-£от с обратным праймером: 5Е1АВ21-теу: 5' -ССС САТ ССТ САТ ТСС ССА ССС ТСС АС-3' (8ЕО ГО N0:6), с применением таких же условий. Полученный в результате фрагмент длиной 1,8 т.п.н. содержал последовательности Е1А и Е1В-19К из АЙ5 (нуклеотиды от 459 до 2244 как в инвентарном номере СепВапк М73260), фланкированные участками ЕсоВ1 (5') и ВатН1 (3'). Оба фрагмента ПЦР выделяли из агарозного геля, очищали с применением набора экстракции из геля 01АЕХ II (01адеп) и клонировали в векторе для клонирования продуктов ПЦР; рСВ-Т0Р0Ыип1 (1пуйгоден) и последовательность подтверждали. Затем конструкции расщепляли ЕсоК1 и ВатН1, а инсерционные фрагменты выделяли из геля с применением набора для экстракции из геля 01АЕХ II (01адеп). как указано выше.

Затем каждый из выделенных фрагментов лигировали в вектор рСС101 (см. ниже), который сначала расщепляли ЕсоК1 и ВатН и очищали из геля, как указано выше. Трансформация в электрокомпетентные клетки ЬН10В (Зпуйгодеп) приводила к конструкциям рСС.Е1А (фиг. 4) и рСС.Е1АВ21 (фиг. 5). Синтетический сигнал полиаденилирования (8РА) находится на данных плазмидах (полученных из конструкции рСС271, как описано в \У0 02/40665).

Получение рСС101 рСС100 (см. ниже) расщепляли XЫаI и полученный в результате линейный фрагмент очищали из геля с применением набора для экстракции из геля 0МЕХ II, как указано выше. Посредством отжига олигонуклеотидов Х-8М-1: 5'-СТАССТССАССААТТС-3' (81Т) ГО N0:7) с Х-8М-2: 5'СТАССААТТССТССАС-3' (8Е0 ГО N0:8) получали линкер. Для этого 1 мкг каждого олигонуклеотида смешивали с 2 мкл 10х буфера ХЕВ2 (ХЕВ) и ιηί11ίθ Н₂0 в конечном объеме 20 мкл. Смесь помещали в 98°С и медленно охлаждали до 4°С на устройстве для ПЦР (скорость охлаждения 2°С/мин). Затем отожженный линкер лигировали с выделенным фрагментом после расщепления XЫаI с применением 4х молярного избытка линкера по отношению к фрагменту. Цитированную ДНК очищали набором для очистки продуктов ПЦР О^цшск (01адеп) по инструкциям производителя и расщепляли XЫаI для удаления самолигировавшейся векторной ДНК. После тепловой инактивации фермента ХЫак смесь затем применяли для трансформации компетентных клеток ЬН5а-Т1^г, получая в результате рСС101 (фиг. 6).

Получение рСС100

Конструкцию рСС271 (описанную в XV0 02/40665) расщепляли ЕсоГО и РШ, а фрагмент вектора длиной 3 т.п.н. выделяли из геля, как описано выше. Посредством отжига олигонуклеотида ЕсоРЧ-3: 5'ААТ ТСА ТАТ ССА АТТ ССС ССА ССТ ССТ ААС СТТ ССА ТСС СТС СА-3' (8ЕО ГО N0:9) с олигонуклеотидом ЕсоРЧ-4: 5'-ССС АТС САА ССТ ТАС САС СТС ССС САА ТТС САТ АТС-3' (8ЕО ГО N0:10) получали линкер. Для этого олигонуклеотиды смешивали, как описано выше, и отжигали посредством инкубации при 98°С в течение 2 мин, 65°С в течение 30 мин и комнатной температуре в течение 2 ч. Затем выделенный фрагмент вектора лигировали до избытка отжигаемого олигонуклеотида и трансформировали в компетентные клетки ЬН5а-Т1^г, получая в результате конструкцию рСС100.

Получение рСС200

Плазмиду рВВ322 (СепВапк 101749.1) расщепляли ЕсоШ, а затем формировали тупые концы с применением фрагмента Кленова с последующей очисткой набором для очистки продуктов ПЦР ОТАс.|шск (01адеи). После второго расщепления с применением N1^ фрагмент вектора длиной 4150 п.н. выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля 0МЕХ II (01адеп). Параллельно конструкцию рСС100 расщепляли ВкаАк фрагментом Кленова формировали тупые концы и очищали набором для очистки продуктов ПЦР О^дшск (01адеп), с последующим вторым расщеплением с применением XЫаI и выделением фрагмента длиной 350 п.н. из агарозного геля. Затем фрагменты лигировали и трансформировали в компетентные клетки 8ТВЬ-2 (Iиν^ΐ^одеи), получая в результате рСС200 (фиг. 15).

- 13 010924

Получение рСС105

Конструкция рСС105 содержит человеческий промотор РСК и сигнал полиаденилирования человеческого гена СОБ1А2. Вначале из человеческой геномной ДНК посредством ПЦР амплифицировали последовательность полиаденилирования СОБ1А2 (Ναΐαΐίζίο с1 а1., 2002), как описано авторами с применением рекомбинантной полимеразы Тад Циуйгодеи) и праймеров СОБ1А2Е: 5'-САС СТА ССС ТСС АСС ААС ТАТ ССА САТ ТАТ ТТС-3' (8ЕО ГО N0:11) и СОЬ1А2К-8а1: 5'-АСА ССТ ССА ССС СТС СТА САС АТС С-3' (8Е0 ГО NО:12). При этом опубликованную последовательность достраивают на 5' -конце посредством последовательности для рестрикции 8ЬЙ, а на З'-конце посредством последовательности для рестрикции 8а11. Полученный фрагмент ПЦР клонировали в рСК-ТОРО-ТА с применением набора для клонирования рСК-ТОРО4 ТА Цпуйгодеп). После проверки вставки посредством секвенирования посредством расщепления 8ЬЙ и 8аИ из вектора ТОРО выделяли вставку длиной 277 п.н. и очищали с применением набора для очистки продуктов ПЦР 01Ас.|шск (01адеп). Параллельно плазмиду рСС1О1 также расщепляли посредством 8ЬЙ и 8аИ, с последующим электрофорезом в геле. Фрагмент вектора длиной 2965 п.н. выделяли из агарозного геля с применением СепеС1еап Κίΐ (Βίο 101) по инструкциям производителя. Данный фрагмент вектора лигировали с очищенным фрагментом СОЬ1А2рА в эквимолярных количествах и трансформировали в химически компетентные клетки 8ТВБ-2 Цпуйгодеп). Это приводило к плазмиде рСС105 (фиг. 7).

Получение рСС205

Конструкцию рСС205 получали расщеплением рСС200 8аИ и ЕсоШ, с последующей очисткой фрагмента вектора длиной 4225 нуклеотидов из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля О1АЕХ II (01адеп). Параллельно, из конструкции рСС105 посредством расщепления ЕсоШ и 8аИ с последующим электрофорезом в геле и очисткой фрагмента с применением набора для экстракции из геля О1АЕХ II выделяли 310 нуклеотидов СОБ1А2 ро1уА. Затем два фрагмента лигировали в эквимолярных количествах и трансформировали в ОН5а-Т1^г, получая в результате рСС205 (фиг. 16).

Клонирование рСС.55Ксо1

Вектор рСС205 применяли для конструирования плазмиды, экспрессирующей белок А65 Е1В-55к. Для этого получали продукт ПЦР с применением следующих праймеров: 55КЮгЕ:5'-ССА АТТ ССС САС САТ ССА ССС ААС ААА ССС АТС ТСА-3' (8ЕО ГО ^:13) и 55КгеуВ: 5'-§да 1сс ТСА АТС ТСТ АТС ТТС АТС ССТ АСА ССС-3' (8ЕО ГО NО:14). ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Ρ\\ό по протоколу производителя в присутствии 3% ЭМ8О. Амплификацию проводили с рЮ.Е1А.Е1В, а программу устанавливали как 94°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами, состоящими из (94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 90 с) и заканчивали 72°С в течение 8 мин. Полученный в результате амплифицированный фрагмент длиной 1510 п.н. содержит последовательность нуклеотидов Е1В-55К от 2019 до 3510 из последовательности А65. Фрагмент очищают с применением набора для очистки продуктов ПЦР О^цшск (01адеп). расщепляют ЕсоШ и ВатШ с последующим электрофорезом в геле для удаления отщепленных концов. Затем данный фрагмент очищают из агарозного геля с применением набора СепеС1еапй (Вю101) и лигируют с рСС205, которую также расщепляют ЕсоШ и ВатШ и выделяют из агарозного геля, как указано выше. Смесь после лигирования трансформировали в химически компетентные клетки 8ТВБ2 Цпуйгодеп), получая в результате конструкцию рСС.55Ксо1 (фиг. 8).

Клонирование р1С.Е1В

Получали фрагмент ПЦР с применением ДНК-полимеразы Ρ\\ό (Косйе) по инструкциям производителя в присутствии 3% ЭМ8О. В реакции амплификации применяли следующие праймеры: 5Е1В81аг1: 5'-ССА АТТ ССТ САТ ССА ССС ТТС 00-3' (8ЕО ГО ^:15) и 5Е1Вгеу2: 5'-СТС ТСТ САС ААС ССС ТСТ С-3' (8Е0 ГО NО:16). Амплификацию проводили с рЮ.Е1А.Е1В, а программу устанавливали как 94°С в течение 2 мин с последующими 5 циклами, состоящими из (94°С в течение 30 с, 56°С в течение 30 с и 72°С в течение 60 с), затем за этими циклами следовали другие 35 циклов из (94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 60 с) и заканчивали 68°С в течение 8 мин. Затем фрагмент ПЦР длиной 390 нуклеотидов расщепляли Крй и ЕсоШ, получая в результате фрагмент длиной 347 нуклеотидов, который выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля О!АЕХ II (О1адеп).

Затем данный фрагмент лигировали с фрагментом вектора рЮ.Е1А.Е1В длиной 5713 п.н., полученного посредством расщепления Крй и частично ЕсоШ, последующего выделения из геля и очистки с применением набора для экстракции из геля О!АЕХ II (01адеп). После лигирования смесь трансформировали в химически компетентные клетки 8ТВЬ-2, получая в результате плазмиду рЮ.Е1В (фиг. 9). рЮ.Е1В содержит нуклеотиды от 2019 до 3510 из генома А65.

Клонирование рСС.Е1Всо1

Для конструирования плазмиды, несущей обе кодирующие последовательности Е1В А 65 19К и 55К, плазмиду рСС.55Ксо1 расщепляют ЕсоШ и КрпЕ Фрагмент вектора длиной 5970 нуклеотидов выделяют посредством электрофореза в геле и очищают из агарозного геля с применением набора СепеС1еапй (Вю101), как указано выше. Затем конструкцию рЮ.Е1В также расщепляли Крп! и ЕсоШ, а

- 14 010924 фрагмент длиной 347 нуклеотидов выделяли из геля и очищали с применением набора для экстракции из геля О1Лс.|шек (01адеп). Лигирование данной вставки и выделенного фрагмента вектора рСС.55Ксо1 и трансформация в клетки 8ТВЬ-2 приводит к конструкции рСС.Е1Всо1 (фиг. 10). Данная конструкция содержит нуклеотиды от 1711 до 3510 из последовательности генома Л65.

Клонирование рЕС.Е1В

Промотор человеческого фактора элонгации 1-α (ЕР1-а) выделяют из плазмиды рЕР/щус/пис (Ιηνί1тодеи) посредством расщепления ЕсоК! и Рт11. После расщепления у фрагмента формируют тупые концы фрагментом Кленов, а затем фрагмент промотора ЕР1-а длиной 1183 нуклеотида выделяют посредством электрофореза в геле и очищают с применением набора СепеС1еапП (Вю101). Параллельно вектор рСС.Е1Всо1 расщепляли посредством ΒδίΧΙ, с последующей обработкой ДНК-полимеразой Т4 для получения тупых концов и очищали на колонке для очистки продуктов ПЦР (01адеп). Затем проводят второе расщепление посредством ЕсоКУ с последующим электрофорезом в геле. Затем фрагмент вектора длиной 5827 нуклеотидов очищают с применением набора СепеС1еапй (Вю101). И фрагмент ЕР1-а, и фрагмент вектора вместе лигировали в эквимолекулярном количестве и трансформировали в химически компетентные клетки 8ТВЬ-2 Птйгодеп), что приводило в результате к плазмиде рЕС.Е1В (фиг. 11), содержащей ту же последовательность Л65-Е1В. что и плазмида рСС.Е1Всо1.

Клонирование р8С.55К

Промотор 8У40 амплифицировали с плазмидной ДНК рЕР/тус/пис Дпсйгодеп) посредством применения рекомбинантной ДНК-полимеразы Тад Дпсйгодеп) и следующих праймеров: 8У40.£от8: 5'-САА СТА СТА САТ СТС САА ТОТ СТС ТСА СТТ АСС-3' (8ЕО ΙΌ N0:17) и 8У40.^ЕШ: 5'-ООА АТТ САО СТТ ТТТ ССА ААА ССС ТАС С-3' (8Е0 ΙΌ N0:18). Программу амплификации устанавливали как 94°С в течение 2 мин с последующими 5 циклами из (94°С в течение 30 с, 48°С в течение 30 с и 72°С в течение 45 с), а затем дополнительными 25 циклами из (94°С в течение 30 с, 58°С в течение 30 с и 72°С в течение 45 с) и заканчивали 68°С в течение 8 мин. Полученный в результате амплифицированный фрагмент длиной 357 п.н. (нуклеотиды от 266 до -71 из последовательности 8У40 инвентарного номера СепВапк 102400) выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля О1АЕХ II (01адеп). Затем данный фрагмент клонировали в рСК-Т0Р0, с применением набора для клонирования РСКТ0Р04Ыип1 Дпсйгодеп). После проверки последовательности из вектора ТОРО посредством расщепления ЕсоК1 и 8ре1 выделяли вставку длиной 357 п.н. и выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля О1АЕХ II (01адеп). Параллельно посредством ΛνΓΐΙ и ЕсоК1 расщепляли плазмиду рСС.55Ксо1 (обладающую каркасом рВК322), с последующим электрофорезом в геле. Фрагмент вектора длиной 5508 нуклеотидов выделяли из геля, как описано выше, и лигировали в эквимолярном количестве с расщепленным фрагментом ПЦР. Смесь после лигирования трансформировали в химически компетентные клетки 8ТВЬ-2, получая в результате плазмиду р8С.55К (фиг. 12), содержащую ту же последовательность Ай5 Е1В-55К, что и рСС.55Ксо1.

Для получения трансформированных клонов из первичных клеток НЕК из геля выделяли фрагменты ДНК, содержащие подходящие экспрессионные кассеты. Полагают, что удаление (перекрывающихся) векторных последовательностей уменьшает шанс совместной интеграции. Для этого рСС.Е1А и рСС.Е1АВ21 расщепляют В^·^ и АЙШ, а инсерционные фрагменты очищают из геля с применением устройства ЕЬи-Ттар (8сй1е1ет апй 8сйие11) по инструкциям производителя. Данный аппарат обеспечивает выделение больших количеств фрагмента ДНК. Конструкции рЕС.Е1В и р8С.55К расщепляют АаШ/НшсП и АЙШ/НшсП, соответственно, и инсерционные фрагменты выделяют, как указано выше. Первичные клетки культивируют и трансфицируют, как описано выше. Для трансфекции выделенные из рСС.Е1А и рЕС.Е1В фрагменты объединяют. Фрагменты ДНК, выделенные из рСС.Е1АВ21 объединяют с р8С.55К или трансфицируют отдельно. Затем последние культуры через 7-10 суток после первой трансфекции в зависимости от размера наблюдаемых клонов повторно трансфицируют фрагментом ДНК, выделенным из р8С.55К. За день перед трансфекцией половину чашек трансфицируют только Е1 АВ21 и пассируют на 10 см чашках, а затем повторно трансфицируют, другую половину чашек повторно трансфицируют без предшествующего пассажа.

Трансформированные клоны, получающиеся в результате данных трансфекции, собирают и наращивают дальше в 96-луночных планшетах и последующих больших масштабах. Участок интеграции и количество копий фрагментов исследуют с применением саузерн-блоттинга и посредством ПЦР для выявления нахождения вставок в непосредственной близости. В дальнейшем предпочтительно применяют клоны, где Е1А и Е1В-55К в геноме трансфицированных клеток присутствуют в единственной копии или присутствуют более чем в одной копии, но не в конформации инвертированного повтора данных последовательности, или где кодирующие последовательности Е1 А и по меньшей мере одного из Е1 В (в данном случае - Е1В-55К) разделены по меньшей мере посредством 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере посредством 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере посредством 34,5 т.п.н.

Пример 2. Получение комплементирующих клеточных линий с применением нуклеиновых кислот, несущих области Е1А и Е1В, разделенные большими спейсерными последовательностями

Как описано в предыдущем примере, стабильно трансформированные клеточные клоны из первич

- 15 010924 ных клеток возможно получать с применением отдельных плазмид для Е1А и Е1В. Однако когда фрагменты ДНК трансфицируют вместе, все еще остается шанс того, что трансфицированные фрагменты окажутся в непосредственной близости друг от друга, хотя этот шанс уменьшен в отсутствие значительного перекрывания последовательностей. Возможности интеграции в хромосому экспрессионных кассет Е1А и Е1В с менее чем 30 т.п.н. последовательности без Е1 между ними можно избежать фланкированием различных экспрессионных кассет Е1 большими участками последовательностей ДНК, не кодирующими Е1 (так называемые спейсерные фрагменты). Если несущий Е1А фрагмент интегрируется в геном полученной пакующей клетки следом за несущим Е1 В фрагментом, то большие фланкирующие последовательности должны создавать достаточное расстояние для устранения шанса того, что кодирующие Е1 А и Е1 В последовательности рекомбинируют в одной и той же векторной молекуле при размножении рекомбинантного аденовирусного вектора в указанной пакующей клетке. Неограничивающие примеры больших спейсерных фрагментов ДНК, которые можно применять, представляют собой большие последовательности, происходящие, например, из человеческого гена дистрофина или человеческого гена Аро-Е1. Также можно применять другие спейсерные молекулы, причем даже из источников, отличных от человека. Предпочтительно, фланкирующие последовательности не содержат кодирующие области для функциональных белков и, таким образом, могут происходить из интронных последовательностей. Также последовательностям Е1 А и Е1 В не обязательно находиться в различных молекулах, но они могут находиться на одной и той же макромолекуле, такой как космида. Примеры данных несущих Е1А и Е1В молекул приведены на фиг. 13. В предпочтительных вариантах осуществления расстояние между кодирующими областями Е1А и Е1В составляет более 34,5 т.п.н., так как тогда совместная вставка данных двух областей в вирус приведет к слишком большому для упаковки геному. Данная ситуация может произойти, например, когда применяют два отдельных космидных фрагмента приблизительно из 40 т.п.н., несущих экспрессионные кассеты приблизительно в середине. Однако, допустив, что Е1 в форме структур инвертированных повторов вносит вклад в частоту возникновения ΗΌΕΡ, конструкции, где кассеты Е1 А и Е1 В расположены в одном космидном фрагменте общей длины приблизительно 22 т. п. н. (подобно тому, как на фиг. 13^, достаточно, даже когда вторая копия расположится в геноме клетки в правильной ориентации следом за первой. Затем полная интеграция структуры с зеркальным отражением будет также вовлекать фрагмент длиной более 38 т.п.н. Также если наличие инвертированных повторов увеличивает частоту образования ΗΌΕΡ, тогда ситуацию, где несколько копий интегрируются в виде прямых повторов, рассматривают как менее проблематичную, даже когда фрагмент ДНК, включающий в себя 2 полных копии Е1А и Е1А, обладает длиной менее или равной 20 т.п.н. В отсутствие инвертированных повторов интеграция любого содержащего Е1 повтора, большего чем место, оставленное в рекомбинантном вирусе (т.е. 38 т.п.н. минус фактическая длина генома рекомбинантного вируса), в рекомбинантный вирус в виде последующей стадии заставляет его удалить части необходимых вирусных последовательностей для обеспечения упаковки и, таким образом, размножения. Анализ первого генома ΗΌΕΡ, возникшего вследствие гомологической рекомбинации (Мигакат1 с1 а1., 2002), показал, что делеция вирусных последовательностей возможна.

Последовательности ДНК, интегрирующие в геном клетки, не всегда доступны для активирующих факторов транскрипции вследствие ассоциированной с хроматином репрессии. В частности, когда используют большие фрагменты интронной ДНК, происходящие из областей генома, которые обычно неактивны в клетке, которую трансдуцируют данными последовательностями, генная экспрессия может отключаться вследствие неактивного хроматина. Недавно идентифицировали последовательности, способные ингибировать данную репрессию. Примеры представляют собой элемент Η84 куриного βглобина (патент США 5610053), функционирующий в виде инсуляторной последовательности, 5С5 или элемент 5С5 ΌΐΌ5ορ1ιί1η (Ке11ит с1 а1., 1991; Еаткак с1 а1., 1992), и ряд последовательностей в человеческом геноме (так называемые противорепрессорные элементы или элементы 8ТАК), идентифицированных при специфическом скрининге на противорепрессорные элементы (К^акк е1 а1., 2003; XVО 03/004704). Включение таких последовательностей, которые предотвращают позиционное молчание генов Е1А и/или Е1 В, в экспрессирующие Е1 А и Е1 В конструкции, также увеличивает количество иммортализованных клонов. Следовательно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько элементов 8ТАК, например 8ТАК 7 (инвентарный номер ОепБапк ΑΥ190751) или 8ТАК 40 (инвентарный номер ОепБапк ΑΥ190756), присутствуют по меньшей мере в одной из экспрессирующих Е1 А и/или Е1 В конструкций. Предпочтительно указанные элементы фланкируют обе стороны кодирующих последовательностей Е1А и/или Е1В, т.е. зкспрессирующие конструкции могут содержать от 5' к 3': элемент 8ТАК регулирующую экспрессию последовательность (например, промотор), кодирующую последовательность Е1 А; или кодирующие последовательности Е1 А + одного из Е1 В; или одну кодирующую последовательность Е1 В; или обе кодирующие последовательности Е1 В - последовательность полиаденилирования - элемент 8ТАК.

Пример 3. Получение клеточных линий посредством Е1 А и Е1 В на отдельных конструкциях и фланкированных балластной ДНК

В данном примере описано получение новых клеточных линий по изобретению посредством совместной трансфекции лервого фрагмента ДНК с экспрессионной кассетой Е1А, фланкированной большой

- 16 010924 балластной ДНК и второго фрагмента ДНК с экспрессионной кассетой Е1В, фланкированной плазмидной ДНК.

В данном примере в качестве балластной ДНК, окружающей экспрессирующую Е1А плазмиду, взяли последовательность интрона 44 человеческого дистрофина (инвентарный номер ОепВапк М86524), клонированную в каркас космидного вектора (рйу§44; фиг. 17).

Конструкцию рССН1А (описанную в примере 1; фиг. 4) расщепляли АЙШ и ΑντΙΙ (Ыете Επ§1;·ιηά Вю1аЬ§) и выступающие концы делали тупыми фрагментом Кленова (Ыете Επ§1;·ιηά Вю1аЬ§). Расщепленные фрагменты разделяли в 0,5% агарозном геле в ТАЕ, а фрагмент длиной 2 т.п.н., соответствующий экспрессионной кассете ΡΟ^ΕΤΑ очищали с применением набора для экстракции из геля (01адеп) по инструкциям производителя.

Конструкцию рйу§44 (фиг. 17) расщепляли Вд111 (Ыете Εη§1;·ιηά Вю1аЬ§), а выступающие концы превращали в тупые с применением фрагмента Кленова. Фрагменты разделяли в 0,5% агарозном геле в ТАЕ, а фрагмент длиной 27 т.п.н., содержащий каркас плазмиды и часть интрона дистрофина, вырезали. Затем кусочки геля помещали в шприц, содержащий немного стекловаты, и с применением поршня содержащий ДНК буфер помещали в пробирку еррепбогГ. Полученный таким образом раствор ДНК содержал приблизительно 5 нг/мкл и его применяли непосредственно в реакции лигирования с очищенным фрагментом ΡΟ^Ε^ длиной 2 т.п.н.

Трансформация в компетентные клетки ΌΗ5αΤ1 приводила в результате к конструкции р441.ссЕ1А (фиг. 18). Конструкция содержит Е1А под контролем промотора человеческого ΡΟΙ< и синтетического сигнала ро1уА.

В качестве зкспрессирующей Е1 В плазмиды в данном примере применяли конструкцию рЕ1 В (описанную в примере 1; фиг. 3). Плазмида содержит Е1В под контролем его собственного промотора и сигнал ро1уА вируса гепатита В (ИВУ).

Конструкцию р44-1.ссЕ1А расщепляли Х1ю1 и ΡтеI, а расщепленную ДНК очищали посредством экстракции фенолом/хлороформом (1:1) с последующим осаждением этанолом (получая в результате кодирующие последовательности Е1А, фланкированные балластом длиной приблизительно 11,6 т.п.н. вверх (включая сюда промотор ΡΟΗ) и приблизительно 6,5 т.п.н. вниз (включая сюда синтетический сигнал ро1уА) от кодирующих последовательностей Е1 А). Затем ДНК осаждали, отмывали 70% этанолом и асептически растворяли в стерильном ТЕ без эндотоксинов. Плазмиду рЕ1В расщепляли 8са1 и очищали, как указано выше (получая в результате кодирующие последовательности Е1В, фланкированные балластом длиной приблизительно 1,4 т.п.н. вверх и более чем 2,3 т.п.н. вниз от кодирующих последовательностей Е1В, где балласт ниже Е1В включает в себя последовательность ро1уА ЧВУ).

Первичные человеческие клетки ΗΕΚ. культивировали и трансфицировали на пассаже номер 6 (ΡΝ6) в одной серии трансфекций и на ΡΝ9 во второй серии трансфекций. Культивирование клеток ΗΕΚ и трансфекций проводили способами, описанными в примере 1. Содержащие Е1А и Е1 В ДНК, полученные выше, для различных трансфекций смешивали в различных пропорциях (в обоих фрагментах отсутствует значительное перекрывание по отношению друг к другу, происходящее из вирусных последовательностей или регулирующих последовательностей, тем самым снижая шансы гомологичной рекомбинации между двумя фрагментами; если оба фрагмента могут формировать одну молекулу нуклеиновой кислоты (например, посредством соединения конец-в-конец или лигирования, теоретическая возможность), и впоследствии интегрировать в геном как одна единица, кодирующие последовательности Е1 А и Е1В в полученных в результате клетках будут разделены более чем 4 т.п.н. балластных последовательностей (по меньшей мере 6,5 т.п.н. (ниже Е1А) + 1,4 т.п.н. (выше Е1В) = по меньшей мере 7,9 т.п.н. между кодирующих последовательностей Е1 А и Е1 В, в теории). Всего трансфицировали 8 чашек приблизительно эквимолярными соотношениями обеих конструкций (17 мкг плазмиды с Е1 А и 3 мкг плазмиды с Е1 В), а 3 чашки трансфицировали 10 мкг каждого фрагмента. В обеих сериях трансфекций наблюдали очаги, но в случае 10 мкг каждой конструкции получали относительно больше очагов. Конструкцию рЮШАШВ, расщепленную Аке1 и Вд11, применяли в качестве положительного контроля (20 мкг ДНК/чашку) в отдельных чашках. Как и ожидалось, эффективность формирования очагов была выше при (одной) плазмиде положительного контроля, чем при двух отдельных фрагментах (из р44-1.ссЕ1 А и рЕ1В). Плазмида рЮШАШВ была приблизительно в 10х более эффективной. Кроме того, при трансфекций и плазмидой положительного контроля, и двумя фрагментами выявили, что приблизительно 8090% отобранных трансформированных клеточных клонов являются жизнеспособными и приняли их в качестве клеточной линии.

Данные эксперименты отчетливо показывают, что возможно трансформировать первичные клетки посредством совместной трансфекции генами Е1 А и Е1 В в различных фрагментах ДНК и фланкированных посредством (неперекрывающейся) балластной ДНК.

Всего дополнительно проанализировали 6 клонов ΗΕΒ01-Ε-71 (депонированный 1 октября 2004 в Вигореап Со11ес11оп оГ Се11 СиНигек (ЕСАСС) под номером 04100101), ΗΕΚΌ1-Η-87 (депонированный 1 октября 2004 в ЕСАСС под номером 04100102), ΗΕΚ01-Η-86, ΗΕΚΌ1-Η-88, ΗΕΚ01-Η-89 и №^01^-90.

Экспрессию генов Ε1 анализировали с применением специфических для белков Е1 антител на вес

- 17 010924 терн-блоте. Для анализа вестерн-блот применяли белок из лизата полученных клеточных клонов общим количеством 10 мкг. Образцы денатурировали в течение 15 мин при 70°С после добавления % объема буфера для образца ИиРаде (Зпуйгодеп). В качестве положительного контроля применяли клеточный лизат РЕЯ.С6®. Лизат нетрансфицированных первичных клеток НЕЯ (пассаж номер 6) служил в качестве отрицательного контроля. Образцы запускали на 10% геле δΌδ-РАСЕ ВщТпк Дпуйтодеп), рядом с предварительно окрашенным маркером 8ееЫие р1ик2 (Зпуйгодеп). Вестерн-блот получали из геля. Применяли следующие антитела: любое из 1) Е1А: мышиного против человеческого А62.Е1А (1:400, 8аи1а Сгих). или 2) Е1В.19К: крысиного против человеческого Е1В 21К моноклонального (1:500, Опсодепе), или 3) Е1В.55К: мышиного против человеческого 55Кба (полученное из линии гибридомных клеток С9А1С6, полученных от Ότ. Я. НоеЫеп, ЬИМС, Ье1беп). В качестве вторых антител применяли следующие антитела: 1) Е1А: козьи 1дС-НЯР против мышиных антител (Вютаб), 2) Е1В.19К: козьи 1дС-НЯР против крысиных антител (Ерсат), 3) Е1В.55К: мкл козьих 1дС-НЯР против мышиных антител (Вютаб). Белки визуализировали посредством применения анализа ЕСЬ+ (Атегкйат).

Исходя из данных экспериментов, ясно, что все тестируемые клоны экспрессируют белки Е1А и Е1В и что уровни сравнимы с уровнями в клетках РЕЯ.С6® (фиг. 19). Это подтверждает то, что трансформация первичных клеток в самом деле индуцируется экспрессией Е1 А65 и не является результатом самопроизвольного события.

Функциональную экспрессию генов Е1 А65 в данных клеточных линиях также можно протестировать, показав то, что данные клетки способны комплементировать вирусы А65 с делецией Е1. Таким образом, 6 различных клеточных клонов тестировали на репликацию вектора Аб5.еСЕР, основанного на А65 с делецией Е1 (делеция нуклеотидов 455-3510 последовательности А65) аденовирусного вектора, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок. Для этого клетки высевали при плотности 1 х 10⁶ клеток/лунку и заражали на следующие сутки при множественности заражения (МО1) 5 вирусных частиц (УР)/клетку. В качестве положительного контроля также высевали клетки РЕЯ.С6® и заражали при МО1 5. Через пять суток во всех лунках наблюдали полный цитопатогенный эффект (СРЕ). Клетки и среду собирали, замораживали/оттаивали три раза и центрифугировали для удаления клеточного дебриса. Затем супернатанты (грубые лизаты) применяли для заражения клеток А549. Для этого 5х10⁵ клеток А549 высевали в 24-луночные планшеты и через сутки заражали 50 мкл грубых лизатов. Через двое суток клетки А549 собирали и анализировали на экспрессию СЕР посредством РАС8. Результаты показывают, что все клоны способны комплементировать вектор Аб5.еСЕР (фиг. 20).

Примечательно, что в аденовирусном векторе (с делецией Е1, с отсутствием нуклеотидов 455-3510) не было перекрытия с последовательностями Е1, присутствующими в клеточной линии (А65 нуклеотиды 459-3510), и, следовательно, сочетание аденовирусного вектора с новыми клеточными линиями в данном примере представляет собой пакующую систему по изобретению, а получение рекомбинантного аденовируса в данном примере представляет собой способ получения партии рекомбинантного аденовируса по изобретению.

Для демонстрации того, что кодирующие последовательности Е1 А и Е1В в геноме клеток разделены более чем 4 т.п.н. геномную ДНК полученных клеточных линий с применением зондов Е1А и Е1В тестировали на саузерн-блотах. Для этого геномную ДНК расщепляли рестрикционными эндонуклеазами ЕсоЯУ и Вд111 (фиг. 21). Расщепленную ДНК разделяли по размеру посредством электрофореза в геле (например, с применением гель-электрофореза с инверсией полюсов, Е1СЕ, для обеспечения разделения больших фрагментов ДНК), а затем переносили на нейлоновую мембрану посредством капиллярного переноса. Для гибридизации на блотах радиоактивно метили три различных зонда. Один зонд А65.Е1А получают из рестрикционного фрагмента ЕсоЯУ-8аП (1330 п.н.; см. фиг. 21), расположенного в направлении 3' от участка ЕсоЯУ в гене А65.Е1А. Получают два зонда А65.Е1В: А65.Е1В (5'), из фрагмента ВккН11-Вд111 (1354 п.н.) и А65.Е1В(3'), из фрагмента Вд111-ВкгС1 (652 п.н.), расположенных на 5'-конце и 3'-конце от участка Вд111 в гене А65.Е1В, соответственно. Получали идентичные блоты, содержащие расщепленную геномную ДНК полученных клеточных линий или, альтернативно, блот очищали после гибридизации первого зонда, а затем гибридизовали со вторым. Любой способ должен обеспечивать перекрывание сигналов, полученных с зондами к Е1 А и Е1В. Если после трансфекции и интеграции в течение получения трансформированной клеточной линии фрагмент Е1А интегрируется следом за содержащим Е1В фрагментом, зонды для Е1А и Е1В выявляют на блотах одни и те же полосы, где размер полос идентифицирует дистанцию между данными двумя генами. Так как ориентация фрагментов Е1 А и Е1В относительно друг друга неизвестна, два зонда к Е1 В применяют раздельно, обеспечивая гибридизацию или с фрагментом в направлении 5' или в направлении 3' от рестрикционного участка Вд111. Если фрагмент Е1 А интегрируется следом за другим фрагментом Е1А, тогда полоса, получающаяся в результате расщепления ЕсоРУ, не распознается зондом к Е1 В. Также полосы, не распознающиеся обоими зондами, будут образовывать одиночные интеграции или концевые фрагменты.

В совокупности эксперименты в данном примере ясно показывают, что совместная трансфекция первичных человеческих клеток отдельными плазмидами, одна из которых содержит Е1 А, фланкированный большой балластной областью, и одна содержит Е1 В, фланкированный каркасными последователь

- 18 010924 ностями, приводит в результате к трансформированным клеточным линиям. Кроме того, данные клеточные линии экспрессируют белки Е1 в количествах, достаточных для эффективного комплементирования векторов Аб5 с делецией Е1.

В альтернативном варианте осуществления последовательности Е1 А и Е1 В клонируют в одну конструкцию, с балластным фрагментом между данными последовательностями, после чего с применением данной одиночной конструкции получают клеточные линии.

Очевидно, что если желательны большие дистанции между Е1А и Е1В, кодирующие последовательности Е1 В также можно фланкировать более длинной балластной нуклеиновой кислотой и/или длину балластов, фланкирующих кодирующие последовательности Е1 А и Е1 В, можно увеличить посредством стандартных обычных способов молекулярной биологии, следуя указаниям настоящего описания. Таким образом, очевидно, что данный пример не следует рассматривать как ограничивающий объем изобретения фактически проведенными экспериментами, но предпочтительнее как иллюстрацию концепций настоящего изобретения.

Таблицы

Таблица. Трансформация первичных клеток ΗΕΒ экспрессирующими Аб5-Е1 конструкциями

Конструкция	Количество	Кол-во чашек	очаги/чашку
ρΙΟ.ΕΙΑ.ΕΙΒ	20 мкг	2	31
ρΙΟ.ΕΙΑ	20 мкг	2	0
р!С.Е1А+рЕ1В	10 мкг каждого	4	15
рЮ.Е1АВ21	20 мкг	2	11,5
р1С.Е1АВ21+рЕ1В	10 мкг каждого	4	10
АсГАрС. еСГР	20 мкг	1	0

Ссылки

Вугб Ρ., Вго\уп К.XV.. ОаШтоге Ρ.Η. 1982. МайдиаиГ ГгаикГогтайои оГ йитаи етЬгуо гс11поЬ1а818 Ьу с1оиеб абеиоуйик 12 ΌΝΑ. №1Шге 298: 69-71.

Вугб Ρ.Τ, Огапб В.1.А., ОаШтоге Ρ.Η. 1988. О1ГГегеп11а1 ГгаикГогтайои оГ рптагу йитаи етЬгуо гейиа1 се11к Ьу абеиоу1гик Е1 гедюик апб сотШпабопк оГ Е1А + гак. Оисодеие 2: 477-484.

Тайаих Р.Т, Вой! А., уап бег Уе1бе I., уап беп Vο11еηЬе^д ΌΙΜ, ЧеЫг КМ, Кеедап 1., Аидег С., Сгатег 8.1., уап ОгтоибГ Η., уап бег ЕЬ А., Уа1епо Ό., ИоеЬеп В.С.. 1998. Νον йе1рег се11к апб таГсйеб еаг1у гедюи 1-бе1е1еб абеиоуиик уесЮгк ргеуеп! деиегайои оГ герйсайои-сотреГеиГ абепоуйикек. Ηιιιη Оепе Тйег 9: 1909-1917.

Тагкак О., Ибуагбу А. 1992. 8едпепсе оГ кск апб кск' Эгокорйба ^NΑ ГгадтегИк \\йй Ьоипбагу йтсбоп 1п 1йе соиГго1 оГдепе ехргеккюи. Шс1е1с Ас1бк Век. 20: 2604.

ОаШтоге Ρ.Η., Вугб, Ρ.Τ, \νΐ6ΐΙ;·6^Γ ТЬ. апб Огапб, В.1.А. (1985). бюре^ек оГ га! се11к (гапкГогтеб Ьу ^NΑ р1акт1бк соиГаштд абеиоуиик 1уре 12 Е1 ^NΑ ог кресгйс ГгадтегИк оГ Гйе Е1 гедюп: сотрапкоп оГ ГгаикГогттд Ггедпепс1ек. Сапсег Век., 45, р.2670-2680.

ОаШтоге Ρ.Η., Огапб, В.1.А. апб Вугб, Ρ.Τ (1986). ТгаикГогтайои оГ йитап етЬгуо гейиоЫакГк \гбй к1т1ап У1гик 40, абеиоуиик апб гак опсодепек. АпйСапсег Век. 6, р.499-508.

Огайат Р.Ь., 8тбеу 1., Викке11 ν.Ο, №бгп В. 1977. СйагасГепкйск оГ а йитап се11 1те (гапкГогтеб Ьу ^NΑ Ггот йитаи абеиоу1гик 1уре 5. 1 Оеи У1го1 36: 59-72.

1осйеткеи А.О., Ρ^ηΒϋΐ£ Ь.Т.С., Ге Ρак Μ.Ρ.ν., бе XVII СМ, Вок ТЬ., уап бег ЕЬ А.Т 1997. Асйуайои оГ абеиоу1гик 5 Е1А ГгаикспрГюи Ьу гедюи Е1В ίη ГгапкГогтеб рптагу гаГ се11к. ЕМВО 1. 6: 3399-3405.

Клгакк Τ.Η., ВагиеГГ Ρ., Ηет^^ка V., 81егкта Т., 8е\уа11 В.О., 8аГуи Ό.Ρ., Вгоик 1.Р., Уаи В1ок1аиб В, Клгактап Ρ., КгискеЬегд А.Ь., Ке1бег А., Обе АР. 2003. 1беиййсайои оГ аий-гергекког е1етеиГк ГйаГ сопРег й1дй аиб к1аЬ1е ргоГет ргобисйои ίη таттайаи се11к. №1Шге ВюГесй 21: 553-558 (+ сотдеибит уо1ите 21 иитЬег 7, Ш1у 2003, р. 822).

Ке11ит В., 8сйеб1 Ρ. 1991. А рокбюп-еГГес! аккау Гог Ьоиибапек оГ Ыдйег огбег сйготокота1 ботатк. Се11 64: 941-950.

Ьосйтийег Η., .Гат, А., Чиагб 1., кгексоб М., 81тоиеаи М., Макк1е В., КаграШ О. аиб Аскаб1 О. (1994) Етегдеисе оГ еаг1у гедюи 1-соиГаттд герйсайои-сотреГеиГ абеиоуиик ίη кГоскк оГ герйсайои-беГесйуе абепоуйик гесотШиапГк (бЕ1+бЕ3) бигтд тиШр1е раккадек ίη 293 се11к. Читай Оеие Тйегару, 5, 1485-1491.

Ьошк Ν., Еуе1едй С., Огайат Р.Ь. 1997. С1ошид аиб кедпепс1пд оГ Гйе се11и1аг-у1га1 щисйоик Ггот Гйе йитаи абепоу|гпк Гуре 5 ГгапкГогтеб 293 се11 йие. У1го1. 233: 423-429.

Мигакат1 Ρ., кпидог Е., Рбек 1., Чо Ь., уап Вуикоеуег В., Уоде1к В., ВоиГ А., МсСатаи М. 2002. А ктд1е кйой кГгеГсй оГ йото1оду Ье1\уееп абеиоуйа1 уесГог аиб раскадтд се11 йие сап дгуе пке Го суГораГЫс еГ

- 19 010924

Гсс1-1пйис1пд. йе1рег-йерепйеп1 Е1-рокй1уе рагйс1ек. Нит Оепе Тйег 13: 909-920.

Мигакаш1 Р., Науепда М., Еа\\'ах Е., Уоде1к К., Маг/ίο О., Рипдог Е., Ейек 1., Йо Ь., Ооийктй 1., МсСатап М. 2004. Соттоп кйисФге оГ гаге герНсайоп-йейтеШ Е1-рокй1уе рагйс1ек т айепоу1га1 уесЮг Ьа1с11ек. 1 Уйо1 78: 6200-6208.

№уе1к М., ТаиЬег В., 8ргикк Т., ^о1Г Н., ЙоЬпег Т. 2001. Нй-апй-Кип 1гапкГогтайоп Ьу айепоуйик опсодепек. 1 У1го1. 75: 3089-3094.

№с1ю1к ν.ν., Ьагйепоце К., Ьейтейй В.Е, Вгоитеег К., Мапат 8., Уоде1к К., Как1о\\· Й., 2шйдееЧ й., Вей А.Е, Сйеп Ь., уап йег Каайеп М., Оа11отеау 8.М., Н111 К.В., Мас1ю1ка 8.У., Апйегкоп С.А., Ые\у1к 1., Майте/ й., ЬеЬгоп 1., Кикко С., Уа1епо й., Вой! А.. Ргорадайоп оГ айепоуйа1 уес!огк: ике оГ РЕК.С6 се11к. ΣΠ Айепоу1га1 уесЮгк Гог депе Фетру, (Ей. Сипе1 Й.Т. апй Йоид1ак, 1.Т.). РиЬ. Асайетк Ргекк, 2002.

Као Ь., йеЬЬак, М., 8аЬЬайш Р., НоскепЬегу й., Когктеуег 8. апй ΧνΐιίΝ, Е. (1992). Тйе айепоуйик Е1А ргсИетк тйисе арор!ок1к, теЫсй ίκ 1пй1Ьйей Ьу Фе Е1В 19-кйа апй Вс1-2 ргсИеФк. Ргос. №111. Асай. 8ск И8А 89, р.7742-7746.

81е1петаегйег Й.8., Саг1коп С.А., ЫеЬег А. 1999. Оепегайоп оГ айепоуйик уесЮгк йеуо1й оГ а11 У1га1 депек Ьу гесотЬтайоп Ьейуееп туейей гереа1к. Σ. У1го1. 73: 9303-9313.

Уап йеп Е1кеп Р., йе Ра1ег 8., Ноите1шд А., уап йег Уеег 1., уап йег ЕЬ А. 1982. Тйе ге1айопкЫр Ье1\\'ееп гедюп Е1а апй Е1Ь оГ йитап айепоу1гикек ш се11 1гапкГогтайоп. Оепе 18: 175-185.

VЫΐе Е. (1995). Кеди1айоп оГ р53-йерепйеп1 арорЮчк Ьу Е1А апй Е1В. Σϋ: Тйе то1еси1аг герейойе оГ айепоуйикек III. Ейк. йоегПег V. апй Войт, Р. 8рппдег-Уег1ад Вег1т Не1йе1Ьегд 1995, р.33-58.

VЫΐе Е. (1996). ЫГе, йеаФ, апй Фе ригкий оГ арорЮчк. Оепек йеу. 10 (1), р.1-15.

2ап1ета А. апй уап йег ЕЬ Λ.Σ. (1995). Мойи1айоп оГ депе ехргеккюп Ьу айепоуйик йапкГогтайоп. Ы Тйе то1еси1аг герейойе оГ айепоуйикек III. Ейк. ЙоегПег, V. апй Войт, Р.8рппдег-Уег1ад Вег1т Не1йе1Ьегд 1995, р.1-23.

- 20 010924

Список последовательностей <110> СКОСЕЬЪ НОЬЬАНЭ Β.ν.

Уоде1в, КопаШ

Η3νβΠ93, Мепго Д.Е. гиЁЭсЗдеезС, ϋβνϊά А.Т.М.

<120> Пакующие клетки для рекомбинантных аденовирусов <130> 0095 ИО Р00 ΡΗΙ <160>18 <170> РабепЪ1п уетзхоп 3.2 <210>1 <211>7315 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> плазмида ρΙΟ.ΕΙΑ.ΕΙΒ <220>

<221> промотор фосфоглицераткиназы человека <222> ¢17)., (504) <220>

<221> область Е1 генома человеческого аденовируса типа 5 <222> (513) ..(3564) <220>

<221> последовательность полиаденилирования вируса гепатита В <222> (3588).. (4205) <400> 1

дааЪ^сдаГа	аббссасддд	дббддддРСд	сдссбРбссс	ааддсадссс	бдддбСРдсд	60
садддасдсд	дсбдс^сЕдд	дсдСддбСсс	дддааасдса	дсддсдссда	сссбдддСсС	120
сдсасаЪЪсЪ	Ъсасдбссдб	есдсадсдбс	асссддаЮГ	£сдссдс£ас	ссРбдбддде	130
сссссддсда	сдсИссбдс	Рссдссссба	адбсдддаад	дЪГсс^дсд	дббсдсддсд	240
£дссддасд£	дасааасдда	адссдсасд!:	сбсас1ад1;а	ссс^сдсада	сддаеадсдс	300
садддадсаа	бддсадсдсд	ссдассдсда	гдддссдсдд	ссаа^адсдд	сСдсбсадса	360

- 21 010924

дддсдсдссд	ададсадсдд	ссдддааддд	дсддндсддд	аддсддддбд	Сддддсддеа	420
дСдЬдддссс	СдДЬссСдсс	сдсдсддбдо	СссдсабОсГ	дсаадссбсс	ддадсдсасд	480
бсддсадбсд	дсЬсссСсдб	бссдааббсд	абсдбдбадб	дба5СЬа5ас	ссддСдадк ί	540
ссбсаададд	ссасбсСбда	дбдссадсда	дбададбб^б	сбссСссдад	ссдсСссдас	600
ассдддасбд	аааабдадас	аГаббабсГд	ссасддадд5	дГЬаЬбассд	аадааагддс	660
сдссадбсЬС	бЪддассадс	Сдабсдаада	ддбасСддсЬ	дасаабсСДс	сассбссбад	720
ссаЬЪССдаа	ссассЪассс	ГДсасдаас!	дСаСдаЬЬНа	дасдодасдд	сссссдаада	780
Ьсссаасдад	даддсддСЬС	сдсада!С5б	бсссдас±сС	дГаа^дтГдд	сддСдсадс(а	840
адддабСдас	ίίасЕсасбб	ίίссдссддс	дсссддб1:с5	ссддадссдс	сбсассббГс	900
ссддсадссс	дадсадссдд	адсадададс	сЪбдддбссд	дбСГсЬаЬдс	сааассбЬдб	960
ассддаддбд	аГсдабсбХа	ссГдссасда	ддсГддсГЛЛ	ссасссадбд	асдасдадда	1020
Ддаададддб	даддадбббд	1д^ада£1а	бдеддадсас	сссдддсасд	дббдсаддбс	1080
6ЬдТса(:11а11	сассддадда	абасддддда	сссадабаЬЪ	аЬдЬдЬСсдс	ίίίςοίΞίϊΐί	1140
даддассбдб	ддсабдбЪбд	ГсЬасадбаа	дбдаааабба	ЬдддсадЬдд	дбда1ададб	1200
ддбдддЪбЬд	дЕдЬддбааб	ίΐίίίίίίίβ	аЪ£^£асад	ίίΐ Ъд-ЬддЬЪ	Гааадаа'ЛЛ	1260
бдбасбдбда	бЫЛГббааа	адд1:ссбд(:д	Гс^даассбд	адссбдадсс	сдадссадаа	1320
ссддадссбд	саадассбас	ссдссдСссб	ааааСддсдс	сбдсбабссЬ	дадасдсссд	1380
асабсассбд	ЬдЬсбадада	а6дсаа6ад£	адЪасддаба	дсбдбдасбс	сддЬссЬНсС	1440
аасасассЪс	οί: дад а Паса	сссддЬддйо	ссдсбдЬдсс	ссабЬааасс	адЬЬдссдЪд	1500
адад^ГддЬд	ддсд!сдсса	ддс^дЪддаа	бдЬаНсдадд	астЛдс!: Ьаа	сдадссбддд	1560
саассХДГдд	асббдадсбд	бааасдсссс	аддссабаад	дбдбааассб	дЪдабЪдсдб	1620
дСдГдсГЛаа	сдсс1Д£д11	ЬдседааСда	дЬГдаСдСаа	дбСЬаабааа	дддбдада1:а	1680
абдЬ-ЬЬаасГ	бдсабддсдЬ	дЬбаааГддд	дсддддсГГ.а	аадддГаНаЬ	аабдсдссдГ	1740
дддсбаагс·:	ЬддбГасаЬс	бдассбса^д	даддсД^ддд	адЬдЬббдда	ада^Ьб6ίαΐ	1800
дсЬдГдсдЪа	асЬДдсбдда	асададсЪсб	аасадбассб	сЕЬддЫЛбд	даддЬСГсгд	1860

- 22 010924

ЕддддсЕсаЕ	сссаддсааа	дЕЕадЕсЕдс	адааЕЕаадд	аддаЕЕасаа	дЕдддаам Е	1920
даададсЕЕЕ	ЕдаааЕссЕд	ЕддЕдадсЕд	ЕЕЕдаЕЕсЕЕ	ЕдааЕсЕддд	Есассаддсд	1990
сЕЕЕЕссаад	адааддЕсаЕ	саадасЕЕЕд	даЕЕЕЕЕсса	сассддддсд	сдсЕдсддсЕ	2040
дсЕдЕЕдсЕЕ	ЕЕЕЕдадЕЕЕ	ЕаЕаааддаЕ	аааЕддадсд	аадааассса	ЕсЕдадсддд	2100
дддЕассЕдс	ЕддаЕЕЕЕсЕ	ддссаЕдсаЕ	сЕдЕддадад	сддЕЕдЬдад	асасаадааЕ	2160
сдссЕдсЕас	ЕдЕЕдЕсЕЕс	сдЕссдсссд	дсдаЕааЕас	сдасддадда	дсадсадсад	2220
садсаддадд	аадссаддсд	дсддсддсад	дадсададсс	саЕддаассс	дададссддс	2280
сЕддасссЕс	дддааЕдааЕ	дЕЕдЕасадд	ЕддсЕдаасЕ	дЕаЕссадаа	сЕдадасдса	2340
ЕЕЕЕдасааЕ	ЕасададдаЕ	дддсаддддс	ЕааадддддЕ	ааададддад	сддддддсЕЕ	2400
дЕдаддсЕас	ададдаддсЕ	аддааЕсЕад	сЕЕЕЕадсЕЕ	ааЕдассада	сассдЕссЕд	2460
адЕдЕаЕЕас	ЕЕЕЕсаасад	аЕсааддаЕа	аЕЕдсдсЕаа	ЕдадсЕЕдаЕ	сЕдсЕддсдс	2520
адаадЕаЕЕс	саЕададсад	сЕдассасЕЕ	асЕддсЕдса	дссаддддаЕ	даЕЕЕЕдадд	2580
Я Л +¹ 3¼ РаЛ	/Ч Г*+- 2 Ь ΐ П О Й		Т Ьап^^Г'апа		5 а/гл Е г а	2640
мууч-. ·=
аасЕЕдЕааа	ЕаЕсаддааЕ	ЕдЕЕдсЕаса	ЕЕЕсЕдддаа	сддддссдад	дЕддадаЕад	2700
аЕасддадда	ЕадддЕддсс	ЕЕЕадаЕдЕа	дсаЕдаЕааа	ЕаЕдЕддссд	ддддЕдсЕсд	2760
дсаЕддасдд	ддЕддЕЕаЕЕ	аЕдааЕдЕаа	ддЕЕЕасЕдд	ссссааЕЕЕЕ	адсддЕасдд	2820
ЕЕЕЕссЕддс	сааЕассаас	сЕЕаЕссЕас	асддЕдЕаад	сЕЕсЕаЕддд	ЕЕЕаасааСа	2880
ссЕдЕдЕдда	адссЕддасс	даЕдЕааддд	ЕЕсддддсЕд	ЕдссЕЕЕЕас	ЕдсЕдсЕдда	2940
адддддЕддЕ	дЕдЕсдсссс	аааадсаддд	сЕЕсааЕЕаа	даааЕдссЕс	ЕЕЕдаааддЕ	3000
дЕассЕЕддд	ЕаЕссЕдЕсЕ	дадддЕаасЕ	ссадддЕдсд	ссасааЕдЕд	дссЕссдазЕ	3060
дЕддЕЕдсЕЕ	саЕдсЕадЕд	аааадсдЕдд	сЕдЕдаЕЕаа	дсаЕаасаЕд	дЕаЕдЕддза	3120
асЕдсдадда	садддссЕсЕ	садаЕдсЕда	ссЕдсЕсдда	сддсаасЕдЕ	сассЕдсЕда	3180
адассаЕЕса	сдЕадссадс	сасЕсЕсдса	аддссЕддсс	адЕдЕЕЕдад	саЕаасаЕас	3240
ЕдасссдсЕд	ЕЕссЕЕдсаЕ	ЕЕдддЕааса	ддаддддддЕ	дЕЕссЕассЕ	ЕассааЕдса	3300
аЕЕЕдадЕса	сасЕаадаЕа	ЕЕдсЕЕдадс	ссдададсар	дЕссааддЕд	аассЕдаасд	3360

- 23 010924

дддбдбббда	сабдассабд	аадабебдда	аддбдебдад	дбасдабдад	асссдсасса	3420
ддбдсадасс	с6дедадбдб	ддсддбааас	абаббаддаа	ссадссбдбд	абдебддабд	3480
бдассдадда	дсбдаддссс	дабсасббдд	бдсбддссбд	сасссдсдсб	дадбббддсб	3540
сбадсдабда	адабасадаб	бдадсбсдас	сбдсаддсаб	дсаадсбдаб	ссббсдсддд	3600
асдбссбббд	бббасдбссс	дбсддсдсбд	аабсссдсдд	асдассссбс	дсддддссдс	3660
ббдддасбсб	сбсдбссссб	бсбссдбсбд	ссдббссадс	сдассасддд	дсдсассбсб	3720
сбббасдсдд	бсбссссдбс	бдбдееббеб	сабсбдссдд	беедбдбдеа	сббсдсббса	3780
ссбсбдсасд	ббдеабддад	ассассдбда	асдсссабса	дабссбдссс	ааддбсббас	3840
абаададдас	бсббддасбс	ссадсаабдб	саасдассда	ссббдаддсс	басббсааад	3900
асбдбдбдбб	бааддаебдд	даддадебдд	дддаддадаб	баддббааад	дбебббдбаб	3960
баддаддсбд	баддсабааа	ббддбебдед	сассадсасб	абдсаасббб	66сасс6с1 д	4020
ссбаабсабс	бсббдбасаб	дбсссасбдб	бсаадссбсс	аадсбдбдсс	ббдддбддсб	4080
ббддддсабд	дасаббдасс	еббабааада	абббддадсб	аебдбддадб	басбсбсдб6	4140
бббдссббсб	дасббсбббс	сббссдбсад	адабссбдса	дадеббддбд	дааддсадбд	4200
дааббадсбб	ддсдбаабса	бддбаабадс	бдбббссбдб	дбдаааббдб	бабссдсбса	4260
сааббссаса	саасабасда	дссддаадса	бааадбдбаа	адссбддддб	дссбаабдад	4320
бдадсбаасб	сасаббаабб	дедббдедеб	сасбдсссдс	бббссадбсд	ддааассбдб	4380
сдбдссадсб	дсаббаабда	абсддссаас	дедеддддад	аддеддбббд	сдбаббдддс	4440
дсбсббссдс	ббссбсдсбс	асбдасбсдс	бдсдсбсддб	едббеддебд	сддсдадсдд	4500
бабсадсбса	сбсаааддсд	дбаабаеддб	бабссасада	абсаддддаб	аасдсаддаа	4560
адаасабдбд	адсааааддс	садсаааадд	ссаддаассд	баааааддсс	дедббдебдд	4620
сдб 6666 сса	баддсбссдс	сссссбдасд	адсабсасаа	ааабсдасдс	бсаадбеада	4680
ддбддсдааа	сссдасадда	сбабааадаб	ассаддсдбб	бсссссбдда	адсбсссбсд	4740
бдсдсбсбсс	бдббссдасс	сбдссдсбба	ссддабассб	дбссдссббб	сбсссббсдд	4800
даадсдбддс	дсбббсбсаб	адсбсасдсб	дбаддбабсб	садббсддбд	баддбсдббс	4860

- 24 010924

дсЪссаадсЬ	дддсЬдЬдСд	сасдаасссс	ссд+Ёсадсс	сдассдсЬдс	дсс На! ссд	4920
дСаасЬаСсд	£сНдад£сс	аасссдд^аа	дасасдас^Ь	а£сдссас1д	дсадсадсса	4990
с+дд+аасад	да+Гадсада	дсдадд+а+д	±аддсддЪдс	ЬасададЬЬс	ПдаадЬддГ	5040
ддсс+аасЬа	сддсЬасасЬ	адааддасад	СаЪЮдд+аЪ	сОдсдсбсЪд	сбдаадссад	5100
гТассЮсдд	ааааадад^Ъ	ддбадсСс^Г	дагссддсаа	асааассасс	дслддСадсд	5160
д1дд£-СС££1;	£дПСдсаад	садсадаЫа	сдсдсадааа	аааадда^сС	саадаада1:с	5220
сЬЬЕдаЬСЬЬ	НсГасдддд	Гс£дасдс£с	ад-Ьддаасда	ааасСсасдб	наадддаыс	5280
Гдд+сабдад	аС+а^саааа	адда+с+бса	сс+ада+ссЪ	1.1Лааа1Лай	ааа+даадГС	5340
Ь+ааэ^саа^	сЬааадбаЬа	+а+дад1ааа	сПдд+с+да	садСТассаа	ГдсЬЬаа+са	5400
дсдаддсасс	СаСс+садсд		НсдЫсаГс	сасадТЬдсс	ЬдасЬсссед	5460
Ссд+д+ада!	аас+асдаЪа	сдддадддсй	ГассаСсСдд	ссссадЬдсЪ	дсааСдаСгс	5520
сдсдадассс	асдс+сассд	дс+ссадаН	ЬабсадсааТ	ааассадсса	дссддааддд	5580
ссдадсдсад	аад-Ьдд+ссС	дсаасГ+^аС	ссдссьссаг	ссад+сСаП	ааНдИдсс	5640
дддаадс+ад	адИаад+адГ	СсдссадГЬа	аЬадбб+дсд	саасдСЬдП	дссаПдс! а	5700
саддса+сд+	дд+д+сасдс	Г.сд5сд1П.д	д+аСддсНс	аЬ+садс+сс	ддНсссаас	5760
да^сааддсд	ад+СасаСда	Сссссса+дЬ	Ъд+дсааааа	адсддПадс	£ссС-Есдд1 с	5820
сГссдабсдГ	Ьд(;садаадТ	аадСГддссд	садСдГСаГс	асссаСддб!	аГддсадсас	5880
ЪдсаЪааГХс	тсь+асъдьс	аЬдссаЕссд	ьаадаСдсСГ	ЫсСдТдаст	ддЕдад£асС	5940
саассаад£с	аЫзс+дадаа	Ьад+дЪаЬдс	ддсдассдад	ПдсЛсПдс	ссддсдЬсаа	6000
ГасдддаСаа	Ъассдсдсса	саТадсадаа	с+Наааада	дсЪса-саП	ддаааасдП	6060
сПсддддсд	аааасСсСса	аддабс^Сас	сдсЛдПдад	аЮсадПсд	аСдСаассса	6120
с+сдГдсасс	саас^даГсЬ	Ьсадса+саЬ	НасЛЬсас	садсд+ЛЛсЬ	ддд(;дадсаа	6180
ааасаддаад	дсааааГдсс	дсаааааадд	даа£аадддс	дасасддааа	1:дЪ^дааГас	6240
ИсаЬасСсЪС	ссЬЫЪСсаа	СаЬЪаЪГдаа	дсаИЛаСса	дддПаПдЬ	сЪсаЬдадсд	6300
даЬасаГаЕС	гдаа+дГаг·	^адаааааба	аасааа^адд	ддПссдсдс	асагьгсссс	6360

- 25 010924

даааадсдсс	ассбдасдЕс	Еаадааасса	ЕЕаЕЕаЕсаЕ	дасаЕЕаасс	ЕаЕаааааЕа	6420
ддсдЕаЕсас	даддсссЕЕ£	сдЕсЕсдсдс	дЕЕЕсддЕда	ЕдасддЕдаа	аассЕсЕдас	6480
асаЕдсадсЕ	сссддадасд	дЕсасадсЕЕ	дЕсЕдЕаадс	ддагдссддд	адсадасаад	6540
сссдЕсаддд	сдсдЕсадсд	ддЕдЕЕддсд	ддЕдЕсдддд	сЕддсЕЕаас	ЕаЕдсддсаЕ	6600
сададсадаЕ	ЕдЕасЕдада	дЕдсассага	аааЕЕдЕааа	сдЕЕааЕаЕЕ	ЕЕдЕЕааааГ	6660
ЕсдсдЕЕааа	ЕЕЕЕЕдЕЕаа	аЕсадсЕсаЕ	ЕЕЕЕЕаасса	аЕаддссдаа	аЕсддсаааа	6720
ЕсссЕЕаЕаа	аЕсаааадаа	Еадсссдада	ЕадддЕЕдад	ΐдГгдГГсса	дЕЕЕддааса	6780
ададЕссасЕ	аЕЕааадаас	дЕддасЕсса	асдЕсааадд	дсдааааасс	дЕсЕаЕсадд	6840
дсдаЕддссс	асЕасдЕдаа	ссаЕсассса	ааЕсаадЕЕЕ	ЕЕЕддддЕсд	аддЕдссдЕа	6900
аадсасЕааа	ЕсддаасссЕ	ааадддадсс	сссдаЕЕЕад	адсЕЕдасдд	ддааадссдд	6960
сдаасдЕддс	дадаааддаа	дддаадааад	сдаааддадс	дддсдсЕадд	дсдсЕддсаа	7020
дЕдЕадсддЕ	сасдсЕдсдс	дЕаассасса	сасссдссдс	дсЕЕааЕдсд	ссдсЕасадд	7080
дсдсдЕасЕа	ЕддЕЕдсЕЕЕ	дасдЕаЕдсд	дЕдЕдаааЕа	ссдсасадаЕ	дсдЕааддад	7140
ааааЕассдс	аЕсаддсдсс	аЕЕсдссаЕЕ	саддсЕдсдс	аасЕдЕЕддд	аадддсдаЕс	7200
ддЕдсдддсс	ЕсЕЕсдсЕаЕ	ЕасдссадсЕ	ддсдаааддд	ддаЕдЕдсЕд	сааддсдаЕЕ	7260
аадЕЕдддЕа	асдссадддЕ	ЕЕЕСссадЕС	асдасдЕСдЕ	аааасдасдд	ссадЕ	7315

<210> 2 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер 5Е1В£ог-1 <400>2 сддааЕЕсдд сдрдЕЕаааЕ ддддсд <210>3 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная

- 26 010924 <220>

<223> праймер 5Е1В-геу <400> 3

Ьадсаддсда РЪсЮдЕдбс <210> 4 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер 5Е1А-£ог <400> 4 ссдааР£сда £сд£д£ад£д <210> 5 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная <223> праймер 5Е1А-геч <400> 5 сдддассса£ £Саасасдсс аСдсаад <210> 6 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер 5Е1АВ21-геч <400> 6 сддда£сс£с аЕЕсссдадд д£ссад <210> 7 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

- 27 010924

<223>	олигонуклеотид Х-ЗМ-1
<400>	7
сСаддСсдас	сааССд 16
<210>	8
<211>	16
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>

<223>	олигонуклеотид Х-ЗМ-2
<400>	8
сРадсааРбд	дбсдас 16
<210>	9
<211>	44
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>

<223>	олигонуклеотид ЕсоРзб-З
<400>	9
ааСбда'Саб.с	дааЪРсдссд адсРсдЪаад сРЬддаРссс Рдса 44
<210>	10
<211>	36
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>

<223>	олигонуклеотид ЕсоРзР-4
<400>	10
ддда-Ессаад	сЕГасдадсС сддсдааТСс даЕаЕс 36
<210>	11
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>

<223>

праймер СОБ1А2Р

- 28 010924 <400> 11

садс+адссТ	дсаддаадЬа СдсадаСЕаР	ЕСд
<210>	12
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	праймер С0Ь1А2Н-за1
<400>	12
асасдбсдас	ддсРддЬада даЕдс
<210>	13
<211>	36
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	праймер 55К£огЕ
<400>	13
ддааТТсдсс	ассаЬддадс даадааассс	аЕсЕда
<210>	14
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	праймер 55ΚΓβνΒ
<400>	14
дда+сс^саа	ЕсЕдЕаРсЕЕ саЕсдсЕада	дсс

<210>	15
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>

<223>	праймер 5Е1В5ЕагЕ
<400>	15

- 29 010924

ддааСЬссСс	аЬддаддс£1: ддд	23
<210>	16
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	праймер 5Ε1ΒΓθν2
<400>	16
дЬд(:с1:саса	ассдс£с£с	19
<210>	17
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	праймер Ξν40.ίοτ8
<400>	17
саас^адЪас	а£д1:ддааЪд £д£дксадЬЪ адд	33
<210>	18
<211>	28
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	праймер Ξν 4 0.Р.еνΕΚΙ
<400>	18
ддаа^ссадс	Сеьъьдсааа адссЬадд	28

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения клетки с интегрированным в ее геном кодирующими последовательностями Е1А и Е1В-19К и Е1В-55К аденовируса, где способ включает стадию введения в клеткупредшественник:

a) единичной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей кодирующие последовательности Е1 А и Е1В-19К и Е1В-55К, где по меньшей мере две из этих трех кодирующих последовательностей разделены по меньшей мере 4 т.п.н.; или

b) двух или более молекул нуклеиновой кислоты, содержащих кодирующие последовательности Е1А, Е1В-19К и Е1В-55К, которые в клетке могут образовывать единичную молекулу нуклеиновой кислоты а).
2. Способ по п.1, где указанная кодирующая последовательность Е1А и по меньшей мере одна кодирующая последовательность Е1В находятся под контролем гетерологичного промотора и/или сигнала полиаденилирования.
3. Способ по п.1, где по крайней мере две указанные кодирующие последовательности разделены по крайней мере 10 т.п.н.
4. Способ по п.3, где по крайней мере две указанные кодирующие последовательности разделены по крайней мере 34,5 т.п.н.
5. Клетка, способная комплементировать аденовирусные векторы, у которых отсутствует область Е1, без образования зависимых от хелперной последовательности, содержащих Е1 частиц, где клетка получена способом по любому из пп.1-4.
6. Способ получения партии рекомбинантного аденовируса с делецией в области Е1, включающий стадии:

а) введения указанного рекомбинантного аденовируса или его генома в клетку, содержащую после

- 30 010924 довательности Е1 аденовируса, способную к комплементации указанных аденовирусных векторов в отсутствие последовательностей Е1;

Ы) культивирования указанной клетки и сбор указанного рекомбинантного аденовируса, где способ отличается тем, что указанная клетка является клеткой по п.5.

- 31 010924

Рей (2491)